阿托伐他汀對高同型半胱氨酸血癥誘發(fā)動脈粥樣硬化的干預(yù)作用_圖文

1、基礎(chǔ)研究 阿托伐他汀對高同型半胱氨酸血癥 誘發(fā)動脈粥樣硬化的干預(yù)作用鮑曉梅 , 鄭宏超(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科 , 上海 200031摘要目的 :觀察阿托伐他汀對動脈粥樣硬化斑塊的影響 , 并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討 。 方法 :20g /LL-蛋氨酸灌胃法建立 ApoE 基因敲除小鼠高同型半胱氨酸血癥 (hyperhomocysteinemia ,HHcy 模型 , 按實(shí)驗(yàn)分組 , 給予不同 劑量阿托伐他汀治療 1個(gè)月后 ,用高效液相色譜熒光法測定血漿同型半胱氨酸 (Hcy 水平 , 相差顯微鏡下觀察小鼠 主動脈根部病理學(xué)形態(tài) , 免疫組織化學(xué)法檢測主動脈血管平滑肌 SM-actin 的

2、表達(dá) , TUNEL 法檢測小鼠主動脈斑 塊中的細(xì)胞凋亡指數(shù) ,NBT 及光澤精化學(xué)發(fā)光法檢測血管局部活性氧 (reactive oxygen species , OS 水平 , 光澤精 化學(xué)發(fā)光法檢測主動脈血管 NADPH 氧化酶 (NADPH oxidase ,Nox 活性 , Western 印跡法檢測 Nox4蛋白表達(dá) 。 結(jié)果 :ApoE-/-小鼠蛋氨酸喂養(yǎng) 3個(gè)月后 , 血漿 Hcy 水平升高 , AS 斑塊形成 。 阿托伐他汀治療 1個(gè)月后 , 呈劑量依 賴性地降低小鼠血漿 Hcy 水平 , 延緩 AS 病變的進(jìn)程 , 減少斑塊內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量 , 降低了血管壁局部 OS水平 ,

3、Nox 活性及 Nox4蛋白表達(dá) (均 P 0. 05 。 結(jié)論 :阿托伐他汀治療后 , HHcy ApoE-/-小鼠 AS 病變進(jìn)程延緩 , 其作用機(jī)制 與其下調(diào) Nox4來源的 OS水平 、 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān) 。關(guān)鍵詞 :高同型半胱氨酸血癥 ; 動脈粥樣硬化 ; 阿托伐他汀 ; 凋亡 ; 活性氧 ; NADPH 氧化酶 中圖分類號 :972文獻(xiàn)標(biāo)識碼 :A文章編號 :1009-7236(2015 01-001-06DOI :1013191/jchj20150001網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間 :2014-9-1810:01網(wǎng)絡(luò)出版地址 :http :/wwwcnkinet /kcms/doi/10

4、13191/jchj20150001html基金項(xiàng)目 :上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助 (12Z1429100 作者簡介 :鮑曉梅 , 副主任醫(yī)師 , 博士Email :baoxiaomei_ntsinacnProtective effects of atorvastatin against hyperhomocysteinemia-inducedatherosclerosisBAO Xiao-mei , ZHENG Hong-chao(Department of Cardiology , Central Hospital , Shanghai Xuhui District , Shanghai

5、200031, China AbstractAIM :To study the protective effects of atorvastatin on hyperhomocysteinemia (HHcy -induced atherosclerosis and possible mechanismsMETHODS :Seven-week-old male ApoE-/-mice were fed with 20g /LL-methionine for 3months to establish an atherosclerosis plaque model with HHcyIn the

6、divided groups (without or with atorvastatin pretreatment for 1month , plasma Hcy levels were measured by high-performance liquid chromatographyAortic roots were isolated for morphologic pathology and immunohistochemistry and TUNEL analysis were conducted to investigate the apoptosis index in the le

7、sionAortic OSproduction was measured by nitroblue tetrazolium (NBT formazan and lucigenin-enhanced chemiluminescence , aortic NADPH oxidase activity was evaluated with lucigenin-enhanced chemiluminescence , and NADPH oxidase 4(Nox4 was evaluated with Western blotESULTS:Three-month high methionine di

8、et induced the formation of atherosclerosis plaque in the aorta of ApoE-/-mice accompanied by an increase of Hcy in plasmaAdministration of atorvastatin for 1month reduced plasma Hcy level ,suppressed development of atherosclerosis plaque , inhibited apoptosis in atherosclerosis plaque and NBT forma

9、zan deposit , and decreased OSformation , NADPH oxidase activation and Nox4expression in the vessel wallCONCLUSION :Atorvastatin attenuates HHcy-induced atherosclerosis in ApoE-/-miceIts mechanism may be related to the inhibition of Nox4-derived oxidative stress and the subsequent decrease of apopto

10、sis of endothelial cells1心 臟 雜 志 (Chin Heart J 2015,27(1Key words :hyperhomocysteinemia ; atherosclerosis ; atorvastatin ; apoptosis ; oxidative stress ; NADPH oxidase大量流行病學(xué)調(diào)查和臨床病例研究已證實(shí) 1:高同型半胱氨酸血癥 (hyperhomocysteinemia , HHcy 是動脈粥樣硬化 (atherosclerosis , AS 性心血管疾病 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 。 同型半胱氨酸 (Hcy 不僅對血管 內(nèi)皮有直接的細(xì)胞

11、毒作用 , 還可通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致 內(nèi)皮功能障礙 , AS 斑塊形成 2。 近年來 , 他汀類藥 物降低膽固醇以外的作用越來越受到重視 。 他汀類 藥物可阻止低密度脂蛋白 (LDL 氧化 , 而且抑制了 平滑肌細(xì)胞增殖 , 使斑塊趨于穩(wěn)定 , 減少臨床心血管 事件的發(fā)生 3。 有研究證明辛伐他汀不僅可減低 大鼠的膽固醇 。 還可作用于血管細(xì)胞 NADPH 氧化 酶來增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)及 mNA穩(wěn)定性 , 改善血管內(nèi)皮舒張功能 4。 阿托伐他汀能通過異 戊二烯通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞 NADPH 氧化酶 (NADPH oxidase , Nox 依賴性活性氧 (reactive oxygen sp

12、ecies , OS 形成 , 這被認(rèn)為是阿托伐他汀的抗氧化應(yīng)激的 重要途徑之一 5。 本研究通過建立載脂蛋白 (Apo E 基因敲除小鼠 HHcy 的動物模型 , 觀察阿托伐他汀 干預(yù)性治療 , 對 AS 斑塊的影響 ; 并對阿托伐他汀的 作用機(jī)制進(jìn)行初步探討 。1材料和方法11材 料 清 潔 級 ApoE-/-小 鼠 (雄 性 、 6周 、 C57BL /6J系 :北京實(shí)驗(yàn)動物中心 ; L-蛋氨酸 、 NAD-PH 、 光澤精 、 SM-actin , Nox4單克隆抗體 :Sigma 公 司 (美國 ; 阿托伐他汀鈣 :輝瑞公司 (美國 ; Hcy 檢 測試劑盒 :Drew Scient

13、ific 公司 (英國 ; 細(xì)胞凋亡原 位檢測試劑盒 (in situ cell death detection kit , POD :oche公司 (美國 ; 蘇木素 、 伊紅 、 多聚甲醛 :上海試 劑二廠 ; HP標(biāo)記的抗小鼠二抗 :Santa Cruz 公司 (美國 ; 正常山羊血清封閉液 、 DAB 顯色試劑盒 :博 士德公司 。12動物分組及模型建立 所有小鼠在瑞金醫(yī)院 動物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后 (即 7周齡 開始 實(shí)驗(yàn) 。 小鼠共 80只 , 隨機(jī)分為 4組 , 分別為 :A 組 :對照組 (20只 , 每天 1ml 生理鹽水灌胃 , 共 4個(gè) 月 ; B 組 :蛋氨酸組

14、(20只 每天 1ml 20g /LL-蛋氨 酸灌胃 , 共 4個(gè)月 ; C 組 :低劑量阿托伐他汀組 (20只 每天 1ml 20g /LL-蛋氨酸灌胃 3個(gè)月后 , 2mg / (kg d 阿托伐他汀 +20g /LL-蛋氨酸 , 每天 1ml 灌 胃 1個(gè)月 ; D 組 :高劑量阿托伐他汀組 (20只 每天 1ml 20g /LL-蛋氨酸灌胃 3個(gè)月后 , 4mg /(kg d 阿托伐他汀 +20g /LL-蛋氨酸 , 每天 1ml 灌胃 1個(gè) 月 。 各組均以普通飲食飼養(yǎng) , 飲水不限 。 4個(gè)月后 全部處死采血 , 取材 。13標(biāo)本采集 飼養(yǎng) 4個(gè)月后處死動物 , 摘眼球方 式取血

15、, 分離血漿 , 70 低溫保存?zhèn)溆?。 摘取主動 脈根部 , 40g /L多聚甲醛再固定 24h 后行石蠟包 埋 , 以備病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測 。14血清總 Hcy 檢測 將血清從 70 冰箱取 出 , 采用高效液相色譜法成批測定血清總 Hcy 濃 度 。 取血清 100l 加入 100g /L三正丁基膦的 N , N-二甲基甲酰胺溶液 10l 混勻 , 冰浴 10min 。 加 入 100g /L三氯乙酸 100l 混勻 , 室溫放置 10min , 5000g 離心 5min 。 取上清 25l 加入 12. 5mmol /L硼酸緩沖液 (pH9. 5 62. 5l 、 1. 55m

16、ol /L氫氧化鈉 5l 和 ABDF 7. 5l 混勻后 , 60 孵育 1h , 冰水終 止反應(yīng) 。 3000g 離心 3min , 取上清 10l 作高效液 相色譜分析 。 色譜條件 :色譜柱 :惠普公司 ODS C18 5m 反相分析柱 (250 4mm ID ; 流動相 :V (0. 1 mol /L磷酸二氫鉀 , 以正磷酸調(diào)至 pH2. 1 V (120 g /L乙腈 =90 10; 流速 :1. 0ml /min; 柱溫 :24 ; 檢測波長 :激發(fā)波長 385nm , 發(fā)射波長 515nm 。 按 上述條件 , 將 Hcy 標(biāo)準(zhǔn)樣本和血漿樣本進(jìn)行 HPLC 測定 。15病理形態(tài)

17、學(xué)觀察動脈斑塊面積半定量分析 將取下來的血管組織 100g /L甲醛固定 , 石蠟包埋 、 切片 、 蘇木精 -伊紅 (H-E 染色 , 封片 。 放置 Olym-pus 顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察 。 在 10倍物鏡下將 完整的動脈橫截面 HE 染色圖象攝入圖象分析軟件 Qwin 2. 0, 測定血管壁全層厚度 、 斑塊面積并計(jì)算斑 塊和血管面積的百分比 。 每只小鼠隨機(jī)選取 3張切 片測定 , 每張切片分別隨機(jī)測量 4處數(shù)值后取均數(shù) 。 16組織免疫化學(xué) 石蠟切片以二甲苯脫脂和梯 度乙醇脫水 , 采用 S-P 法 (鏈霉菌抗生物素蛋白 -過 氧化 物 酶 連 接 法 , Streptavidi

18、n Peroxidase conjugate method , 參照 SM-actin 試劑盒說明書進(jìn)行觀察 , 磷酸緩沖液代替一抗為陰性對照 , 顯微鏡下全自動 圖像分析觀察 5個(gè)高倍視野 , SM-actin 陽性表達(dá) 呈棕黃色 。 PCNA 陽性細(xì)胞率 =PCNA 陽性細(xì)胞數(shù) /總細(xì)胞數(shù) 。17TUNEL 技術(shù)檢測小鼠主動脈血管組織中的凋 亡細(xì)胞 按細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒 (oche公司 說明書處理石蠟切片 , 應(yīng)用 Axioplan 2imaging 顯微2心 臟 雜 志 (Chin Heart J 2015, 27(1圖象分析系統(tǒng)計(jì)數(shù) TUNEL 染色陽性細(xì)胞數(shù) , 計(jì)算凋亡指數(shù) (

19、apoptosis index ,AI , AI =(陽性細(xì)胞數(shù) /總 細(xì)胞數(shù) 100%。 每張切片數(shù) 5個(gè)以上高倍視野 ,不少于 500個(gè)細(xì)胞 。 18NBT 染色法檢測血管壁 OS水平 將取下來的血管組織剪成 5mm 長的 血 管 環(huán) ,轉(zhuǎn) 移 至 含 有 10g /L硝基氮藍(lán)四唑 (nitro blue tetrazolium , NBT 的緩沖 液 中 ,37 孵 箱 中 孵 育 , 30min 后 加 入 0. 5mmol /LHCl 終止反應(yīng) 。 血管環(huán)以 40g /L多聚甲醛固定 、 包埋 。 5m 厚度連續(xù)切片 , 脫蠟 復(fù)水 核 快紅復(fù)染 脫水 透明 封藏 。 中性樹脂封片

20、、 干燥 ,放置顯微鏡下觀察 。 計(jì)算 NBT 染色陽性面積占 整個(gè)血管壁面積的百分率 , 并取平均數(shù) 。19光澤精化學(xué)發(fā)光法檢測血管環(huán) OS水平 新 鮮摘取的主動脈 , 剪成 1cm 長的血管環(huán) , 放入新鮮 配置的 Krebs 液 (pH 7. 4 中 37 孵育 30min 后上 機(jī)檢測 。 96孔檢測板每孔加入 200l Krebs 液 , 將主動脈環(huán)放入其中 , 再加入 1mmol /L光澤精母液 1l , 稀釋至工作濃度為 5mol /L, 每個(gè)樣品檢測 20次 , 每次 10s , 檢測平均光強(qiáng)度 。 對照組光強(qiáng)度定為 1, 而其它各組的光強(qiáng)度值均為相對對照組來說的相 對值 。1

21、10光澤精化學(xué)發(fā)光法檢測血管環(huán) NADPH 氧化 酶活性 新鮮摘取的主動脈 , 剪成 1cm 長的血管 環(huán) ,放入新鮮配置的 Krebs 液 (pH 7. 4 中 37 孵育 30min 后上機(jī)檢測 , 96孔檢測板每孔加入 200l Krebs 液 , 將主動脈環(huán)放入其中 , 加入 1mmol /L光澤 精母液 1l , 稀釋至工作濃度為 5mol /L, 再加入 20mmol /LNADPH 母液 1l , 稀釋至工作濃度為 100mol /L。 每個(gè)樣品檢測 20次 , 每次 10s , 檢測 平均光強(qiáng)度 。 對照組光強(qiáng)度定為 1, 而其它各組的 光強(qiáng)度值均為相對對照組來說的相對值 。

22、111Western 印跡法 采用 SDS-PAGE 法 (十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝 膠 電 泳 檢 測 動 脈 血 管 NOX4蛋白表達(dá) 。 制備十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠 , 蛋白變性后上樣 ,100V 、 120mA 電泳分離 樣品蛋白 , 轉(zhuǎn)膜 , 封閉 , 一抗 (1 1500 40 孵育過 夜 , 二抗 (1 2000 室溫孵育 2h 。 ECL 顯影 , 曝光 。 -actin 的表達(dá)水平作為內(nèi)參 。 112統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析 ,計(jì)量資料以 s 表示 , 組間比較 采用單因素方差分析 (ANOVA 。 計(jì)數(shù)資料以百分率表示 ,

23、組間比較采用 2檢驗(yàn) 。 以 P 0. 05為差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。 2結(jié)果21各組 ApoE-/-小鼠血清 Hcy 濃度比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后 , 比較各組血漿 Hcy 水平 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) B 組 Hcy 水平較 A 組明顯上升 (P 0. 05 , 經(jīng)不同劑量阿托 伐他汀干預(yù)后 , 血漿 Hcy 水平有一定程度下降 , 但 C 組小鼠血漿 Hcy 濃度與 B 組相比 , 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義 。 D 組小鼠血漿 Hcy 濃度降低 , 與 B 組相比差異 有顯著性意義 (P 0. 05 , 高劑量阿托伐他汀組降 低血清 Hcy 的作用顯著強(qiáng)于低劑量組 (P 0. 05 , 見表 1。表 1各組小鼠血

24、清 Hcy 濃度 、 主動脈根部斑塊面積 、S-M -actin 的表達(dá) 、 凋亡指數(shù)變化( s 組別 n Hcy 濃度(mol /L 斑塊面積 (mm 2 SM-actin 表達(dá)率 (% 凋亡指數(shù)(% A 組 203 7007 001216 3918 08B 組 2056 7a 247 007a 634 64a 241 58a C 組 2046 5205 009ac462 54ac146 43ac D 組2035 5ace167 008ace 314 24ace66 20ace與 A 組比較 ,a P 0.05; 與 B 組比較 , c P 0.05; 與 C 組比較 , e P 0.05。

25、 22各組 ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊形態(tài)改變B 組小鼠主動脈根部斑塊面積較 A 組顯著增加 ,阿托伐他汀干預(yù) 1個(gè)月后 ,C 組和 D 組主動脈根部 斑塊面積與 B 組相比顯著減少 , 其中 D 組減少更明 顯 (P 0. 05 , 見表 1, 圖 1 。圖 1各組 ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積比較 ( 400A :對照組 ; B :蛋氨酸組 ; C :低劑量阿托伐他汀組 ; D :高劑量阿托伐他汀組 。3心 臟 雜 志 (Chin Heart J 2015,27(123各組小鼠主動脈根部 SM-actin 的表達(dá) 組織免疫化學(xué)結(jié)果顯示 ,SM-actin 陽性細(xì)胞率在 B 組增加

26、至 (63 6 %。 經(jīng)不同劑量阿托伐他汀干預(yù)后 , 主動脈根部血管壁 SM-actin 陽性細(xì)胞率均顯 著下降 , 其中 D 組抑制作用更強(qiáng) (P 0. 05 , 見表 1, 圖 2 。圖 2各組 ApoE-/-小鼠主動脈根部 SM-actin 表達(dá) ( 400 A :對照組 ; B :蛋氨酸組 ; C :低劑量阿托伐他汀組 ; D :高劑量阿托伐他汀組 。24各組小鼠主動脈血管壁中的凋亡細(xì)胞比較 TUNEL 技術(shù)檢測小鼠主動脈血管壁中的凋亡細(xì)胞 , 結(jié)果顯示 :A 組為 (1. 8 0. 8 %。 B 組增加至 (24 6 %。 經(jīng)不同劑量阿托伐他汀干預(yù)后 , C 組與 D 組主動脈根部血

27、管壁凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著下降 (與 B 組 比較 , 均 P 0. 05 。 D 組與 C 組相比 , 降低更明顯 (P 0. 05 , 見表 1, 圖 3 。圖 3各組 ApoE-/-小鼠主動脈壁凋亡細(xì)胞的表達(dá) ( 400A :對照組 ; B :蛋氨酸組 ; C :低劑量阿托伐他汀組 ; D :高劑量阿托伐他汀組 。25各組小鼠主動脈血管壁 OS水平比較 NBT法檢測主動脈血管壁 OS水平 , 結(jié)果顯示 :A 組 NBT 染色陽性面積占整個(gè)血管壁面積的百分率為 (3. 5 0. 8 %, B 組增加至 (31. 7 4. 0 %, 且在血管壁全 層均有分布 , 見表 2, 圖 4。 經(jīng)不同劑量阿

28、托伐他汀 干預(yù)后 , 主動脈根部血管壁 NBT 染色陽性面積明顯 下降 , 與 B 組比較 , P 0. 05。 D 組與 C 組相比 , NBT 染色陽性面積降低更明顯 (P 0. 05 。表 2各組小鼠主動脈血管壁 NBT 染色率 、 血管環(huán) OS水平 、NADPH 氧化酶活性 、 Nox4蛋白表達(dá)( s 組別 NBT 染色率(% OSNADPH 氧化酶活性 Nox4蛋白表達(dá) A 組35 08100 000100 000100 000B 組 317 40a 551 048a 486 072a 221 016a C 組 166 47ac364 068ac312 051ac191 024ac

29、D 組 102 17ace 227 041ace 206 069ace114 019ace與 A 組比較 ,a P 0.05; 與 B 組比較 , c P 0.05; 與 C 組比較 , e P 0.05 。 圖 4各組 ApoE-/-小鼠主動脈根部 NBT 藍(lán)色沉積 ( 400A :對照組 ; B :蛋氨酸組 ; C :低劑量阿托伐他汀組 ; D :高劑量阿托伐他汀組 。4心 臟 雜 志 (Chin Heart J 2015,27(126各組小鼠主動脈血管環(huán) OS水平比較 光澤精化學(xué)發(fā)光法檢測血管環(huán) OS水平 , 結(jié)果顯示 :B 組 血管環(huán) OS水平是 A 組的 (5. 51 0. 48 倍

30、 。 經(jīng)不同劑量阿托伐他汀干預(yù)后 ,C 組與 D 組主動脈血管環(huán) OS水平均顯著下降 (與 B 組比較 , 均 P 0. 05 , 且D 組與 C 組相比 , OS水平降低更明顯 (P 0. 05 ,詳見表 2。27各組小鼠主動脈血管環(huán) Nox 活性比較 光澤 精化學(xué)發(fā)光法檢測血管環(huán) Nox 活性 , 結(jié)果顯示 :B 組 血管環(huán) Nox 是 A 組的 (4. 86 0. 72 倍 。 經(jīng)不同劑量阿托伐他汀干預(yù)后 ,C 組與 D 組主動脈血管環(huán) Nox 活性均顯著下降 (與 B 組比較 , 均 P 0. 05 , 且 D 組與 C 組相比 , Nox 活性降低更明顯 (P 0. 05 (表 2

31、。 28各組小鼠主動脈 Nox4蛋白表達(dá) B 組小鼠主動脈 Nox4蛋 白 表 達(dá) 水 平 較 A 組 顯 著 增 高 (P 0. 05 , 阿托伐他汀干預(yù)后 , 主動脈 Nox4蛋白表達(dá)水 平均有所下降 ,D 組 Nox 表達(dá)水平的降低有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義 (P 0. 05 (表 2、 圖 5 。圖 5Western blot 檢驗(yàn)小鼠主動脈 Nox4蛋白表達(dá)A :對照組 ; B :蛋氨酸組 ; C :低劑量阿托伐他汀組 ; D :高劑量阿托伐他汀組 。3討論自從發(fā)現(xiàn) AS 血管壁及斑塊中存在凋亡現(xiàn)象 , 大量研究證實(shí) 6:細(xì)胞凋亡是 AS 產(chǎn)生和發(fā)展的重要因 素 , 并參與影響斑塊穩(wěn)定性 。 A

32、S 斑塊內(nèi)細(xì)胞增殖與 凋亡伴隨斑塊發(fā)生發(fā)展的全過程 。 AS 早期 、 中期細(xì) 胞增殖大于凋亡 ; 后期則相反 。 細(xì)胞凋亡在斑塊易 損性中發(fā)揮了重要作用 。 內(nèi)皮細(xì)胞 、 平滑肌細(xì)胞凋 亡 ,細(xì)胞外基質(zhì)合成減少 , 纖維帽膠原修復(fù)障礙 , 斑 塊易于破裂 。 凋亡物質(zhì)還可促進(jìn)炎細(xì)胞趨化并激 活 , 分泌各種炎癥和細(xì)胞因子 , 進(jìn)一步吸引和激活炎 細(xì)胞 , 誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移 、 增殖 , 并可作為凝血酶 產(chǎn)生的底物 , 誘發(fā)血栓形成 。 這說明細(xì)胞凋亡會促進(jìn) AS 形成及增加斑塊易損性 7。高血糖 、 血管緊張 、 氧化的 LDL 、 脂蛋白 ( Lp ( 以及炎性因子等多種因素均可誘導(dǎo)血管

33、壁 內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等發(fā)生凋亡 , 而氧化應(yīng)激是其誘導(dǎo)各種血管壁細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制 8。 本研究 通過 NBT 法及光澤精化學(xué)發(fā)光法檢測了血管局部 OS水平 。 NBT 法作用原理為 OS中的 O 2極不穩(wěn)定 , 生成的 O 2在有氧條件下很快發(fā)生再氧化 , 將氧 化型 NBT (黃色 還原為藍(lán)色的甲腙 。 藍(lán)色愈深 , 說明生 成 的 O 2越 多 。 我 們 的 結(jié) 果 顯 示 ,蛋 氨 酸 組 ApoE-/-小鼠血管局部藍(lán)色結(jié)晶顯著增多 , 阿托伐他 汀組藍(lán)色結(jié)晶減少 。 光澤精 , 又稱硝酸雙 -N-甲基丫啶翁 , 是一種帶正電的發(fā)光劑 , 單價(jià)還原后生成光澤精自由基 , 再與 O

34、 2反應(yīng) , 生成不穩(wěn)定的中間物光澤 精二惡二酮 , 由此分解成電激發(fā)狀態(tài) (N-甲基丫啶酮 , 通過釋放光子 , 恢復(fù)到基態(tài) 。 光澤精作為探針 ,可特異性地檢測細(xì)胞內(nèi) O 2, 其發(fā)光強(qiáng)度與 O 2水平 成正相關(guān) 。 我們的結(jié)果顯示 , 蛋氨酸組 ApoE-/-小鼠 血管環(huán)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng) , 阿托伐他汀組較之減弱 。 這兩項(xiàng) 試 驗(yàn) 均 表 明 , 蛋 氨 酸 飲 食 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生 HHcy ApoE-/-小鼠 , 并通過氧化應(yīng)激損傷 , 導(dǎo)致 AS 形成 , 阿托伐他汀的抗動脈硬化作用可能與其參與下調(diào)血 管局部 O 2水平有關(guān) 。細(xì)胞膜上的 Nox 被認(rèn)為是催化生成 O 2的主要 途

35、徑 , 而血管內(nèi)皮細(xì)胞及斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞則是血 管壁中 O 2最重要的來源 。 在給兔喂高膽固醇食物后 ,其血管細(xì)胞 Nox 活性明顯升高 , 同時(shí)主動脈內(nèi) O 2持續(xù)增加 , 給予超氧化物歧化酶 (SOD 、 過氧化 氫酶 (CAT 或丙丁酚抗氧化治療可逆轉(zhuǎn)上述變化 。用敲除 P47phox 的 ApoE 缺乏小鼠作實(shí)驗(yàn) , 同樣顯示其主 AS 病變顯著減輕 ,表明 Nox 產(chǎn)生的 OS在致 AS 中 起 著 重 要 作 用 9。 在 高 蛋 氨 酸 飲 食 誘 導(dǎo) 的HHcy 大鼠模型中 , 可檢測到明顯增高的 O 2水平和 Nox 活性 , 同時(shí)主動脈 Nox 的亞基 p22phox 的

36、表達(dá)明顯增高 。 給予 Nox 的抑制劑 apocynin ,不僅能減少 O 2產(chǎn)生 , 還能恢復(fù) HHcy 大鼠內(nèi)皮依賴性的血管舒 張功能 ,而 p22phox siNA轉(zhuǎn)染的人內(nèi)皮細(xì)胞或平 滑肌細(xì)胞可消除 Hcy 誘導(dǎo)的 O 2形成 10。 這表明 HHcy 可通過 Nox 來源的 O 2損傷內(nèi)皮功能 , 并導(dǎo)致導(dǎo)致 AS 形成 。 本研究以光澤精為指示劑 , NADPH 為底物 , 化學(xué)發(fā)光法檢測了 HHcy ApoE-/-小鼠主動脈環(huán) Nox 活性 , 同樣證實(shí)了 HHcy 水平與 Nox 活性呈 正相關(guān) , 而阿托伐他汀在降低血漿 Hcy 水平的同時(shí) , 可抑制 Nox 的激活 。3

37、羥基 3甲基戊二酰輔酶 A (HMG-coA 還原酶抑制劑 他汀類藥物是脂質(zhì)代謝的限速酶 。 其不僅 有顯著調(diào)脂的作用 , 還能夠抑制細(xì)胞膜上鳥苷酸結(jié) 合調(diào)節(jié)蛋白的 hoA和 ac1通過異戊二烯化激活 。 ac1是 Nox 必須的組成部分之一 , 參與 Nox 的活 化 。 有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能通過異戊二烯通路抑制 ac1及 Nox 活化 , 發(fā)揮抗氧化作用 11。 在血管 緊張 誘發(fā)的 C57BL /6小鼠高血壓模型及高脂飲食5心 臟 雜 志 (Chin Heart J 2015,27(1 6 誘發(fā)的 ApoE-/ 小鼠 AS 模型中， 阿托伐他汀均能抑 制 OS 的產(chǎn)生， 下調(diào)主動脈 N

38、ox4 mNA 的表達(dá)及 ac1 向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移。 在 Nox1 缺陷小鼠模型中， 阿 12 托伐他汀上述作用明顯減弱 。 在既往離體細(xì)胞 ： 阿托伐他汀抑制 Hcy 誘導(dǎo)的 血管內(nèi)皮 細(xì) 胞 及 內(nèi) 皮 祖 細(xì) 胞 OS 產(chǎn) 生， 涉及抑制 實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn) Nox 活性及下調(diào) Nox4 表達(dá)。 本次研究證實(shí)阿托伐 他汀降 低 HHcy ApoE-/ 小 鼠 血 管 局 部 Nox 活 性， Nox4 蛋白的表達(dá)。 綜上所述， 我們認(rèn)為阿托伐他汀可能通過減少 HHcy ApoE-/ 小鼠主動脈壁細(xì)胞凋亡， 抑制平滑肌 細(xì)胞增殖， 來延緩 HHcy ApoE-/ 小鼠 AS 病變進(jìn)程。 而阿托伐他

39、汀抑制血管壁 Nox 來源的 OS 引起的 氧化應(yīng)激反應(yīng)是其主要保護(hù)機(jī)制之一 。 參考文獻(xiàn)： 1 Homocysteine Studies Collaboration Homocysteine and risk of ischemic heart disease and stroke： a metaanalysisJ JAMA， 2002 ， 288 （ 16 ） ： 2015 2022 2 Moat SJ，Lang D，Mcdowell IF，et al Folate，homocysteine，endothelial function and caldiovascular disease J

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