食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)

1、技能訓(xùn)練庫(kù)綜合技能實(shí)訓(xùn)指導(dǎo)書實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目名稱食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)學(xué)時(shí)6學(xué)時(shí)實(shí)訓(xùn)目的1.掌握大腸菌群計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序2.學(xué)會(huì)國(guó)標(biāo)法測(cè)定大腸菌群計(jì)數(shù)的方法和技能一、術(shù)語(yǔ)和定義 （一）大腸菌群 在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。 （二）最可能數(shù) most probable number，MPN 基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。 二、設(shè)備和材料 恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴箱、天平、均質(zhì)器、1 mL和10 mL無(wú)菌吸管或微量移液器及吸頭、250 mL無(wú)菌錐形瓶、90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿、pH 計(jì)或精密pH 試紙。三、培養(yǎng)基和試劑（制法見附錄A） 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST

2、 ）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ）、磷酸鹽緩沖液、無(wú)菌生理鹽水、無(wú)菌 1 mol/L NaOH、無(wú)菌 1 mol/L HCl。 四、操作步驟 （一）樣品的稀釋 1固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi), 8000 r/min10000 r/min 均質(zhì) 1 min2 min，或放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min，制成 1:10 的樣品勻液。 2液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形

3、瓶 （瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。 3樣品勻液的pH 值應(yīng)在 6.57.5 之間，必要時(shí)分別用 1 mol/L NaOH或 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。4用 1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1支1 mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋 1 次，換用 1 支 1 mL 無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品

4、勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 min。 （二）初發(fā)酵試驗(yàn) 每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST 肉湯），36 ±1培養(yǎng)24 h±2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h±2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h±2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。 （三）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB ）管中，36

5、77;1 培養(yǎng)48 h±2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。 （四）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告按復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B ），報(bào)告每g（mL ）樣品中大腸菌群的 MPN值。 附錄AA.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯 A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氫鉀（KH 2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸鈉 0.1 g 蒸餾水 1 000 mL A.1.2 制法 將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 6.8±0.2 。

6、分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅菌 15 min。A.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛膽粉溶液 200 mL 0.1%煌綠水溶液 13.3 mL 蒸餾水 800 mLA.2.2 制法 將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL （將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.07.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1 000 mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121

7、高壓滅菌15 min。 A.4 磷酸鹽緩沖液 A.4.1 成分 磷酸二氫鉀（KH2 PO4） 34.0 g 蒸餾水 500 mL A.4.2 制法 貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH7.2，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。 稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 高壓滅菌15 min。 A.5 無(wú)菌生理鹽水 A.5.1 成分 氯化鈉 8.5 g 蒸餾水 1 000 mL A.5.2 制法 稱取8.5 g 氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 高壓

8、滅菌15 min。 A.6 1 mol/L NaOH A.6.1 成分 NaOH 40.0 g 蒸餾水 1000 mL A.6.2 制法 稱取40 g氫氧化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 高壓滅菌15 min。 A.7 1 mol/L HCl A.7.1 成分 HCl 90 mL 蒸餾水 1 000 mL A.7.2 制法 移取濃鹽酸90 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，121 高壓滅菌15 min。 附錄B B.1 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表-420>1100333948.72721241001801100233424.520112200090460133423.7

9、15012100042240033424.520202100090290323423.61410243040210223381.49.200242037150123424.5160314201893023424.51512142040160313423.61102142037120213383.6111112001775113201.37.4011180943013383.6112011801764203181.37.21011108.738103180.173.6001944.623003383.69.4030948.736132181.26.2020948.729032181.26.1110948.735222110.153.0010948.7281229.60.153.0100424.5210229.5-<3.0000高低0.0010.010.10高低 0.0010.010.1095%置信區(qū)間MPN陽(yáng)性管數(shù)95%置信區(qū)間MPN陽(yáng)性管數(shù)注 1：本表采用3 個(gè)稀釋度0.1 g(mL)、0.01 g