實時熒光定量PCR——TaqMan探針法及設(shè)計原則

1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1.實時熒光定量實時熒光定量PCRTaqMan探針法探針法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2. 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段； 避免引物自身或與引物之間形成避免引物自身或與引物之間形成4個或個或4個以上連續(xù)配對，個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)； 典型的引物典型的引物18到到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目

2、的序列位點的可能性。列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。 Tm值在值在5565，GC含量在含量在40%60%； 引物之間的引物之間的TM相差避免超過相差避免超過2； 引物的引物的3端避免使用堿基端避免使用堿基A，引物的，引物的3端避免出現(xiàn)端避免出現(xiàn)3個或個或3個以上連續(xù)相同的堿基；個以上連續(xù)相同的堿基； 為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子； Taqman探針技術(shù)要求片段長度在探針技術(shù)要求片段長度在50bp150bp； 引物末端（最后引物末端（最后5個核苷酸）不能有超過個核苷酸）不能有超過2個的個的G和和C。 TaqMan

3、技術(shù)引物設(shè)計原則技術(shù)引物設(shè)計原則Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics3.TaqMan探針設(shè)計原則探針設(shè)計原則 先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針；先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針； 探針長度應(yīng)在探針長度應(yīng)在15-45bp（最好是（最好是20-30bp)，以保證結(jié)合特異性；，以保證結(jié)合特異性； 探針的探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)；盡量避開二級結(jié)構(gòu)；折疊和二級結(jié)構(gòu)；盡量避開二級結(jié)構(gòu)； Tm值在值在65-70，通常比引物，通常比引物TM值高值高5-10（至少要（至少要5），），以確保在退火過程中探針先于引物與目的片段結(jié)

4、合，以確保在退火過程中探針先于引物與目的片段結(jié)合，GC含量在含量在40%70%； 探針的探針的5端應(yīng)避免使用端應(yīng)避免使用G鳥嘌呤鳥嘌呤因為因為5G會有淬滅作用，而會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用；且即使是被切割下來還會存在淬滅作用； 整條探針中，堿基整條探針中，堿基C的含量要明顯高于的含量要明顯高于G的含量的含量G含量高會含量高會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針；降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針； 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在blast中核實中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重

5、新設(shè)計引物探針。一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4.Taqman MGB 探針設(shè)計探針設(shè)計 探針的探針的5端避免出現(xiàn)端避免出現(xiàn)G，即使探針?biāo)鉃閱蝹€堿基，與報，即使探針?biāo)鉃閱蝹€堿基，與報告基團(tuán)相相連的告基團(tuán)相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號。堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號。 Tm值應(yīng)為值應(yīng)為65-67。 盡量縮短盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于探針，但探針長度不少于13bp。 盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或個或4個以上的個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。重復(fù)出現(xiàn)。 原則上原則上MGB探針只要有一個堿基突變，探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢探針就會檢測