綠色熒光蛋白GFP基因的克隆表達(dá)和粗提取

1、綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆、表達(dá)和粗提取南方醫(yī)科大學(xué)2011預(yù)防醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫） 摘 要目的：研究綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大腸桿菌中的基因克隆與重組表達(dá)，以及對(duì)其進(jìn)行粗提取。 方法：從E.coli DH5中用堿提取質(zhì)粒的方法提取質(zhì)粒pEGFP-N3和質(zhì)粒pET-28a。然后用質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)已經(jīng)提取的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，確定從大腸桿菌中成功提取了質(zhì)粒。再用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和NotI對(duì)成功提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切后的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用以確定已經(jīng)提取了GFP基因。將含有GFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.co

2、li BL-21中，用LB培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化后的E.coli進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。用IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達(dá)可以看到淺綠色菌落。最后對(duì)綠色熒光蛋白進(jìn)行粗提取。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)有助于學(xué)生掌握最基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白 基因克隆 重組表達(dá) 轉(zhuǎn)化 粗提取目錄1 前言32 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備44 材料及試劑55 實(shí)驗(yàn)操作步驟55.1 操作流程55.2 質(zhì)粒DNA的分離與純化65.2.1 質(zhì)粒的培養(yǎng)65.2.2 質(zhì)粒的DNA的堿提取法65.2.3 質(zhì)粒DNA的鑒定與純化75.3 酶切及連接85.3.1 雙酶切85.3.2 回收酶切產(chǎn)物（采用DNA回收試劑盒進(jìn)行回收）

3、85.3.3 連接95.4大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液體和固體培養(yǎng)基的配制（參考附錄）9感受態(tài)細(xì)胞的制備 (CaCl2法)95.4.3 轉(zhuǎn)化涂板105.5 GFP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)105.6 綠色熒光蛋白的粗提取11參 考 文 獻(xiàn)11附 錄121 LB培養(yǎng)基的配制：122. 溶液123. 溶液124. 溶液（100ml）125. DNase-free RNase A136.TE緩沖液（pH8.0）137. 20×TBE138. GeneFinder-溴酚藍(lán)上樣緩沖液139PEGFP-N3質(zhì)粒全圖譜1310pET-28a質(zhì)粒全圖譜141

4、前言綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一類(lèi)存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，GFP 發(fā)射綠色熒光。它產(chǎn)生熒光無(wú)需底物或輔因子發(fā)色團(tuán)是其蛋白質(zhì)一級(jí)序列固有的。1962 年，下村修等分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素，并發(fā)現(xiàn)一種綠色的熒光蛋白。1974 年，他們分離得到了這個(gè)蛋白，當(dāng)時(shí)稱(chēng)綠色蛋白，以后稱(chēng)綠色熒光蛋白(GFP)1 GFP 作為一種新的報(bào)告基因，其優(yōu)點(diǎn)在于熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性高；GFP 分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對(duì)受體無(wú)毒害，安全可靠；不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光，尤

5、其適用于體內(nèi)的即時(shí)檢測(cè)；GFP 不具有種屬依賴(lài)性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達(dá)；通過(guò)替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。近年來(lái)廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域 23 。采用GFP 作為標(biāo)記基因，可直接收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)，縮短了篩選時(shí)間、減少對(duì)細(xì)胞活性的影響并可作為活體標(biāo)記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機(jī)制提供了一種簡(jiǎn)潔有效的手段 4、5 。采用基因工程手段生產(chǎn)GFP標(biāo)記的方法，可建立一種簡(jiǎn)便、快速的免疫診斷技術(shù)6 。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞

6、是分子克隆的關(guān)鍵步驟7，是基因克隆以及DNA文庫(kù)構(gòu)建等研究中一項(xiàng)重要的常規(guī)操作。目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備主要采用CaCl2 法，該方法操作簡(jiǎn)單、容易掌握、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化率高，可廣泛應(yīng)用于一般的實(shí)驗(yàn)室。其原理是Ca2+ 破壞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)陣列，并與膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無(wú)機(jī)磷酸形成復(fù)合物以利于外源DNA的滲入8。大腸桿菌是第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長(zhǎng)繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點(diǎn)9。而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌中蛋白量的30%，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣

7、泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)10。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng),大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作,以及有大量可供選擇的克隆或表達(dá)載體,使之成為人們克隆表達(dá)外源基因的主要菌株11。 隨著科研的進(jìn)展，構(gòu)建出了多種具有不同特點(diǎn)的表達(dá)載體和工程菌株，以滿足表達(dá)不同性質(zhì)、要求的目的基因的需要。在原核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的載體常用啟動(dòng)子有T7啟動(dòng)子、Trp啟動(dòng)子-色氨酸啟動(dòng)子、Tac啟動(dòng)子、T7噬菌體中基因10 的啟動(dòng)子及Lac啟動(dòng)子等。Lac啟動(dòng)子受分解代謝系統(tǒng)活化蛋白和cAMP的正調(diào)控和阻遏物的負(fù)調(diào)控，當(dāng)加入乳糖或某些類(lèi)似物IPTG可與阻遏蛋白形成復(fù)合物，使阻遏蛋白構(gòu)型改變，阻遏蛋白不再能與操縱基

8、因結(jié)合，從而使結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。根據(jù)原核生物基因表達(dá)特點(diǎn)選擇載體進(jìn)行目的基因克隆，然后轉(zhuǎn)入相應(yīng)的菌種中表達(dá)目的蛋白質(zhì)12。 研究綠色熒光蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的基因克隆和表達(dá)。通過(guò)質(zhì)粒重組形成所需要的重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，通過(guò)酶切及用IPTG誘導(dǎo)檢測(cè)是否在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)成功。根據(jù)電泳結(jié)果及熒光現(xiàn)象得出結(jié)論，重組質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功誘導(dǎo)表達(dá)。2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)綠色熒光蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)整個(gè)過(guò)程中的每一步，掌握其方法。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)基因工程手段對(duì)目的基因EGFP進(jìn)行克隆，并進(jìn)行EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得GFP蛋白。

9、 學(xué)會(huì)最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法 學(xué)會(huì)常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)學(xué)會(huì)用限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA學(xué)會(huì)用瓊脂糖凝膠中回收DNA片段學(xué)會(huì)DNA片段的體外連接技術(shù)學(xué)會(huì)用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞學(xué)會(huì)用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌的基本操作技術(shù)學(xué)會(huì)用酶切法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌了解外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的方法學(xué)習(xí)SDS-PAGE膠的基本灌制方法和用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱，超凈臺(tái)，恒溫?fù)u床，制冰機(jī)，臺(tái)式離心機(jī)，核酸電泳儀，小型混合器，冰箱，藍(lán)盾可見(jiàn)光透射儀，移液器、電泳槽、振蕩器、制冰機(jī)、凝膠成像儀，水浴鍋，高壓滅菌鍋、振蕩培

10、養(yǎng)箱，手持式紫外燈。4 材料及試劑BamH I；NotI(10U/L)；T4 ligase；LB培養(yǎng)基；溶液；溶液；溶液；TE緩沖液；20×TBE；GeneFinder-溴酚藍(lán)上樣緩沖液。5 實(shí)驗(yàn)操作步驟5.1 操作流程E.coliDH-5（pET-28）E.coliDH-5（pEGFPN3）質(zhì)粒 提取 質(zhì)粒 提取質(zhì)粒pEGFPN3質(zhì)粒pET-28酶切 回收 酶切 回收載體片段插入片段連 接重組質(zhì)粒(pET-28-GFP)轉(zhuǎn) 化BL-21(pET-28-GFP)誘 導(dǎo)綠色熒光蛋白（粗提?。﹫D一 流程圖5.2 質(zhì)粒DNA的分離與純化5.2.1 質(zhì)粒的培養(yǎng)1）在含有pEGFPN3質(zhì)粒的D

11、H5平板上菌落上挑取菌種，置于含有5mL LB培養(yǎng)基的試管中。搖晃過(guò)夜。 2）有pET-28a質(zhì)粒的平板上挑取單菌落于另外一個(gè)試管中，同樣搖蕩培養(yǎng)過(guò)夜。5.2.2 質(zhì)粒的DNA的堿提取法1）取1.5ml DH5培養(yǎng)液倒入1.5mL eppendorf 管（微量離心管）中, 13000rpm離心1min。2）重復(fù)1。3）棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 4）菌體沉淀重懸浮于100L溶液中(需劇烈振蕩),室溫下放置10min。 5）加入新配制的溶液200l, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf 管5次,以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩),冰浴5min。 6）加入150L預(yù)冷的溶液,蓋

12、緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩3次,使沉淀混勻,冰浴中15分鐘,13000rpm離心5min。 7）上清液移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1),振蕩混勻, 13000rpm離心2min。 8）將水相移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)振蕩混勻, 13000rpm離心2min。 9）將水相移入干凈eppendorf 管中,加入2 倍體積的無(wú)水乙醇,振蕩混勻后，置于室溫下2min，然后13000rpm離心5min。 10）棄上清,將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1mL 70乙醇洗沉淀一次, 振蕩混勻后，13000rpm

13、離心5min。 11）吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,室溫干燥。 12）將沉淀溶于30L TE緩沖液(pH8.0，含20g/mL RNaseA)中，保存在-20冰箱中。 13）按照同樣的流程和方法將pET-28a的質(zhì)粒也提出來(lái)，保存在-20冰箱中。5.2.3 質(zhì)粒DNA的鑒定與純化1) 1%瓊脂糖凝膠的配制加20ml 1×TBE緩沖液于三角瓶中，精確稱(chēng)取0.2g瓊脂糖加到三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化，冷卻至60左右，2) 瓊脂糖凝膠電泳輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上，將膠板除去封膠帶，放入電泳緩沖液（TBE）中，使電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠約

14、1mm，輕輕拔除梳子，取5l質(zhì)粒DNA及2l GeneFinder混勻上樣50-100v約電泳0.5-1小時(shí)藍(lán)盾可見(jiàn)光透射儀觀察結(jié)果。3) 回收產(chǎn)物用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來(lái)，稱(chēng)取重量。以0.1g凝膠對(duì)應(yīng)300L的體積加入PN。50水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動(dòng)離心管至膠完全融解。將上一步得到的溶液加入到一個(gè)吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm離心60s，棄掉廢液。加入800L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。加入500L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。將離心吸附柱放回收集管，13000rpm離心2min。取出吸附柱，放入

15、一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適量洗脫緩沖液EB 30L，洗脫緩沖液先在65水浴預(yù)熱，室溫放置2min，13000rpm離心1min，然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，13000rpm離心1min。置于20保存。5.3 酶切及連接5.3.1 雙酶切按如下雙酶切體系（30L）混合:表1 雙酶切體系的配制反應(yīng)物（L）pEGFP-N3 pET-28a 質(zhì)粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10×buffer K 3 3 0.1%BSA緩沖液 3 3 滅菌雙蒸水至 30ul體系1) 離心10s，混勻。2) 37水浴酶切3-4h。3) 配制1.0%（M/V）

16、普通瓊脂糖凝膠30ml。4) 適當(dāng)放置冷卻，45左右倒于電泳膠板上，插好梳子。5) 待凝膠凝固好以后，撥下梳子。6) 酶切樣品中加入5µl溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液混勻，上樣。7) 1×TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳30min。8) 熒光激發(fā)器觀察質(zhì)粒DNA條帶的酶切情況，并照像。5.3.2 回收酶切產(chǎn)物（采用DNA回收試劑盒進(jìn)行回收） 1) 配30mL 1進(jìn)口瓊脂糖凝膠，盡量長(zhǎng)一些（用粗梳子），對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離； 2) 將酶切產(chǎn)物全部加入加樣孔中 3) 跑膠，觀察結(jié)果，并且拍照。 4) 用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來(lái)，稱(chēng)取

17、重量。 5) 以0.1g凝膠對(duì)應(yīng)300L的體積加入PN。 6) 50水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動(dòng)離心管至膠完全融解。 7) 將上一步得到的溶液加入到一個(gè)吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm離心60s，棄掉廢液。8) 加入800L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。9) 加入500L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。 10) 將離心吸附柱放回收集管，13000rpm離心2min。 11) 取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適量洗脫緩沖液EB 30L，洗脫緩沖液先在65水浴預(yù)熱，室溫放置2min，13000rpm離心1mi

18、n，然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，13000rpm離心1min。 12) 置于20保存。 5.3.3 連接按照連接體系進(jìn)行，16連接過(guò)夜。表2 連接體系反應(yīng)物 體積/L 回收純化的pET-28a質(zhì)粒 5gfp基因片段 12 T4連接酶 1 緩沖液（10×） 2 5.4大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化5.4.1 LB（Luria-Bertain）液體和固體培養(yǎng)基的配制（參考附錄）氨芐青霉素和卡那霉素等抗生素不抗熱，如果培養(yǎng)基溫度過(guò)高，容易導(dǎo)致抗生素失效，應(yīng)使培養(yǎng)基降溫至60左右后，再加入抗生素。但也不應(yīng)使培養(yǎng)基的溫度過(guò)低，否則容易出現(xiàn)氣泡。75mm直徑的培養(yǎng)皿約需15ml培養(yǎng)基。

19、感受態(tài)細(xì)胞的制備 (CaCl2法) 1) 挑一大腸桿菌單菌落放入3ml LB液體培養(yǎng)基（含Kan+），37培養(yǎng)過(guò)夜。2) 活化大腸桿菌：取3ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基加入50-150l的過(guò)夜菌，培養(yǎng)2-3個(gè)小時(shí)。3) 將昨夜搖出來(lái)的DH5或BL21培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10min,然后于4下4000rpm離心5min。 4) 棄去上清,用預(yù)冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液600L輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置20min, 4下4000rpm離心5min。 5) 棄去上清,加入300L預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置5min,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液，可-80長(zhǎng)期保存

20、。5.4.3 轉(zhuǎn)化涂板 1) 取2個(gè)無(wú)菌離心管，分別加入100L BL21感受態(tài)細(xì)胞懸液，第1管加5l無(wú)菌水，第2管加入質(zhì)粒DNA溶液5l,輕輕搖勻,冰上放置30min。2) 42水浴中熱激90s,熱激后迅速置于冰上冷卻5min。 3) 分別向管中加入100L LB液體培養(yǎng)基,混勻后在37振蕩培養(yǎng)30min。 4) 從管1中取50L涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,從管2中取50L和100L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置約10分鐘,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)20小時(shí)。管1 管1 管2 管250L 50L 50L 100L圖2 轉(zhuǎn)化涂板模式圖5.5 GFP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

21、1) 取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化BL21；2) 在含有Kan的固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20h；3) 挑取單菌落，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；4) 取4支無(wú)菌帶蓋試管，加入新鮮LB液體培養(yǎng)基（含有Kan）5ml，按1：20稀釋比例加入過(guò)夜菌，37培養(yǎng)至生長(zhǎng)期,約2-3小時(shí)。5) 加入IPTG（1：1000）至終濃度1mmol/L，分別誘導(dǎo)0h，1h，2h，4h。 6) 分別取1.5ml，10000rpm離心5min，去除上清，收集沉淀，再重復(fù)一次收集沉淀。7) 分別取IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)液20l涂布在含Kan的固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20小時(shí)。8) 觀察蛋白表達(dá)：用紫外線照射菌體沉淀及培養(yǎng)平板，可以看到綠色熒光。分

22、別對(duì)均勻涂布的平板以及表達(dá)蛋白的樣品管照相，保存照片。5.6 綠色熒光蛋白的粗提取1) 挑取上述鑒定正確的單菌落接入5 mL 液體LB 培養(yǎng)基( 含50 g/mL 卡那霉素) , 37 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜, 2) 將過(guò)夜培養(yǎng)菌以1: 500 體積比接種入新的LB 液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng), 37 培養(yǎng)1 h 后, 加入0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)3 h。3) 將上述誘導(dǎo)表達(dá)菌液4 、5 000×g 離心10 min 收集菌體, 4) 用提取緩沖液(2 mmol/L Tris, pH 8.0, 0.5 mmol/L PMSF,0.2 mmol/L NaN3)洗滌菌體一遍, 5) 將菌體

23、超聲破碎( 50 %功率, 超聲20 s, 共20 次, 兩次超聲間隔40 s) 后, 10 000 ×g離心20 min。6) 取離心后的上清，即為粗提取綠色熒光蛋白。參 考 文 獻(xiàn)1 Shimomura O,Johnson FH,Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, abioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea J. J Cell Como Physiok, 1962, 59: 223-239.2 Kain SR

24、,AdamsM, Kondepudi A, et al. Green fluorescent p rotein as a reporter of gene exp ression and p rotein localization. biotechniques, 1995, 19 (4) : 6503 Phillip s GJ. Green fluorescent p rotein - a bright idea for the study of bacterial p rotein localization. FEMSmicrobial Lett, 2001, 204 (1) : 94 Ch

25、alfieM, Tu, EKivchen G, et al. Green fluorescent p rotein as a marker forgene exp ression. Science, 1994, 263(5148) : 8025 ChalfieM. Green fluorescent p rotein. Photochem Photobiol, 1995, 62 (4) : 6516 Larrick JW, Balint RF, Youvan DC. Green fluorescent protein: untapped potential in immunotechnolog

26、y. Immunotechnology, 1995, 1 (2) : 837 薩姆布魯克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M. 金冬雁，黎孟楓，譯. 2版. 北京：科學(xué)出版，1995. 8 杜禎, 馬海利, 陳瑞芳.工程菌DH-5感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒pGEM的轉(zhuǎn)化研究 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2007 年第34卷第5期9 Nuc P. Nuc K. Recombinant protein production in Escherichia coliJ.Postepy Biochem,2006,52 (4):448-456.10 Dong X,Tang B,Li J,et al.E

27、xpression and Purification of Intact and Functional Soybean (Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli J.J Microbiol Biotechnol,2008,18 (2):299-307.11 呂素芳，劉崢，郭廣君，蔡永萍，邱德文 大腸桿菌中表達(dá)外源重組蛋白的研究 12 魏春紅，李毅主編 原核細(xì)胞中外源基因的表達(dá)和初步純化，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，高等教育出版社，2006.7:95-97附 錄1 LB培養(yǎng)基的配制：組成液體固體蛋白胨（Trypton）10g10g酵母提取物（Yeast Extract）5g5gNaCl10g10g瓊脂（Agar）15g蒸餾水定容至1000ml定容至1000