補(bǔ)腎益氣中藥對(duì)小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)及PR表達(dá)的影響

1、補(bǔ)腎益氣中藥對(duì)小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)及PR表達(dá)的影響         08-10-21 13:21:00     編輯：studa20              作者：劉艷娟 黃光英 楊明煒 陸付耳 【摘要】  目的探討補(bǔ)腎益氣中藥改善胚泡著床障礙小鼠著床期子宮內(nèi)膜微環(huán)境的機(jī)制。方法于妊娠第4天9AM利用米非司酮建立胚泡著床障礙小鼠

2、模型，予補(bǔ)腎益氣中藥進(jìn)行干預(yù)，于妊娠第4天9PM處死小鼠，觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化，采用免疫組化技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測(cè)子宮PR的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比，模型組子宮內(nèi)膜發(fā)育不良，中藥組子宮內(nèi)膜的發(fā)育與正常組相似；中藥組子宮內(nèi)膜腺體、間質(zhì)、腔上皮細(xì)胞PR表達(dá)范圍和強(qiáng)度及PR蛋白的表達(dá)均較模型組顯著增高，子宮PR蛋白的表達(dá)較模型組顯著增高，與正常組無(wú)顯著差異；結(jié)論補(bǔ)腎益氣中藥通過(guò)改善子宮內(nèi)膜發(fā)育,調(diào)節(jié)胚泡著床障礙小鼠子宮組織PR蛋白的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜著床微環(huán)境，利于胚泡著床。 【關(guān)鍵詞】  補(bǔ)腎益氣中藥；子宮內(nèi)膜著床微環(huán)境；孕激素受體Abstract: Objective

3、To explore effect of Bushen Yiqi Recipe（BSR）on endometrial microenvironment in embryo implantation dysfunction mice(EID). Methods Mice model of EID induced by mifepristone at 9AM on day 4 of pregnancy (Pd4) were intervened with BSR, and sacrificed at 9PM on Pd4. The structure of endometrium was obse

4、rved by lightmicroscope. The endometrial PR expressions were assessed by immunnohistochemical SP method and western blot. Results Endometrial morphology showed endometrial development retardation in model group ，while endometrial development in treatment group was significantly improved and nearly s

5、imilar to control group. Levels of PR in the BSR treated group were significantly higher than those in the model group respectively, and showed insignificant differences from those in the normal control group. Conclusion BSR could improve the embryo implantation by way of regulating development of e

6、ndometrium and the levels of PR expression in mice with EID.Key words： Bushen Yiqi Recipe; endometrial implantation microenvironment; progesterone receptor   不孕癥的發(fā)生率約占育齡婦女的15%，盡管人工助孕技術(shù)（IVFET）治療不孕癥已獲得較大的成功，但其妊娠率仍較低。胚泡著床障礙是導(dǎo)致IVFET臨床妊娠率低的主要原因之一，子宮內(nèi)膜著床微環(huán)境是影響胚泡著床的主要原因之一1。因此，改善子宮內(nèi)膜著床微環(huán)境，提高著

7、床率是提高人工助孕技術(shù)孕育成功率的關(guān)鍵。    補(bǔ)腎益氣中藥由桑寄生、黃芪、丹參等藥組成，具有補(bǔ)肝腎、益氣血之功效。前期研究已觀察到，在妊娠早期，補(bǔ)腎益氣中藥能提高胚泡著床障礙小鼠的胚泡著床率2。其配合IVFET治療不孕癥，可提高胚泡移植的成功率3。為探討補(bǔ)腎益氣中藥促進(jìn)胚泡著床的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察補(bǔ)腎益氣中藥對(duì)胚泡著床障礙小鼠圍著床期，子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、子宮孕激素受體（progesterone receptor，PR）的表達(dá)，進(jìn)一步闡述補(bǔ)腎益氣中藥對(duì)圍著床期子宮內(nèi)膜著床微環(huán)境的影響。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)

8、性成熟期、雌性未孕昆明小鼠，體重3035g，雄性小鼠40g左右，由湖北省衛(wèi)生防疫站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第19-082號(hào)。1.2  實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 補(bǔ)腎益氣中藥由同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所中藥制劑室提供，由桑寄生、黃芪、丹參等組成，采用水煎醇沉工藝制成144%無(wú)菌煎濟(jì)，分裝于無(wú)菌小瓶中，-20冰箱保存。將米非司酮片劑（北京第三制藥廠生產(chǎn)）研碎，溶解于丙二醇（國(guó)產(chǎn)分析純）中，配制成0.8mg/ml濃度。SP免疫組化試劑盒、ECL試劑盒為MBI公司產(chǎn)品；PR多克隆抗體為Santa Cruze 公司產(chǎn)品。1.3  動(dòng)物分組及處理 將雌(32±

9、;4g)、雄(40±4g)小鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，于每日以雌雄2:1的比例合籠，次日8:00檢查雌鼠陰道，發(fā)現(xiàn)陰栓計(jì)為妊娠第1天（pd1）。將孕鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和中藥組，每組各6只。于妊娠第4天（Pd4）9：00皮下注射米非司酮0.03mg/kg體重建立胚泡著床障礙模型，正常組皮下注射等量丙二醇溶劑。于妊娠第4天21:00，頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖腹，取出子宮，用于光鏡檢測(cè)、免疫組化及Western blot分析。1.4  光鏡觀察小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu) 子宮標(biāo)本用100ml/L福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色，制作組織切片，光鏡觀察子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)

10、胞、間質(zhì)細(xì)胞的變化；選用同批染色切片，每張切片在光鏡下（×40）隨機(jī)取5個(gè)不同的視野，以每張切片染色的背景作對(duì)照，經(jīng)HPIAS1000病理圖文分析系統(tǒng)（同濟(jì)醫(yī)學(xué)院千屏音像公司）分析，分別測(cè)定并計(jì)算子宮內(nèi)膜腺體面積、腺腔面積、腺上皮細(xì)胞面積及宮腔上皮厚度。1.5  小鼠子宮PR免疫組化分析 將子宮標(biāo)本制作石蠟切片，采用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素免疫組化法（SP法）染色，檢測(cè)子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)。按照試劑提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。免疫組化分析結(jié)果判斷：PR的陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，主要位于子宮內(nèi)膜腺體、間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。選用同批染色切片，每張切片在光鏡下（×40）隨機(jī)取5個(gè)不同的視野，以每張切片染色的背景作對(duì)照，經(jīng)HPIAS1000病理圖文分析系統(tǒng)分析，分別測(cè)定并計(jì)算子宮內(nèi)膜腺體、間質(zhì)、腔上皮細(xì)胞的陽(yáng)性信號(hào)所占的各自面積比和平均光度，表示陽(yáng)性信號(hào)的表達(dá)范圍和表達(dá)強(qiáng)度。以PBS代替抗做陰性對(duì)照。1.6  小鼠子