生物大分子分離技術(shù)綜述

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上生物大分子分離技術(shù)綜述摘要：生物大分子包括核酸DNA和RNA、多糖、酶、蛋白質(zhì)以及多肽等。生物大分子分離技術(shù)是生物研究中的核心技術(shù)之一，當(dāng)前醫(yī)學(xué)，藥學(xué)及生命科學(xué)學(xué)科之間的交叉滲透為大分子分離技術(shù)的發(fā)展提供了更多的契機(jī)。本文對(duì)以沉淀、透析、超濾和溶劑萃取為代表的傳統(tǒng)分離技術(shù),以及色譜,電泳等現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展概況、方法、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵字：分離技術(shù) 生物大分子 1前言生命科學(xué)的發(fā)展給生物大分子的分離技術(shù)提出了新的要求。各種生化、分子研究要求提取分離高純度，結(jié)構(gòu)完整和具有生物活性的活性的生物大分子樣品，這就使得分離技術(shù)在各項(xiàng)研究中起著至關(guān)重要的作用。對(duì)生物大分子

2、分離技術(shù)的研究也就隨之產(chǎn)生。同時(shí)，隨著各學(xué)科之間的交叉滲透，納米材料、計(jì)算機(jī)自動(dòng)化等技術(shù)的發(fā)展也為生物大分子技術(shù)的發(fā)展提供了更多的空間。生物大分子的制備具有如下特點(diǎn)：生物樣品的組成極其復(fù)雜，許多生物大分子在生物樣品中的含量極微，分離純化的步驟繁多，耗時(shí)長(zhǎng)；許多生物大分子在分離過(guò)程中就非常容易失活，因此分離過(guò)程中如何保證生物大分子的活性，也是提取制備的困難之處；生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的,溫度、PH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷。這些都要求生物大分子的分離技術(shù)以此為依據(jù)，突破這些難點(diǎn)，優(yōu)化分離程序以獲得符合要求的生物大分子試劑。2傳統(tǒng)分離技術(shù)被廣

3、泛應(yīng)用傳統(tǒng)的生物大分子分離方法有透析、溶劑萃取、沉淀和超濾等，它們都是一些較早就建立起來(lái)比較完善的的分離方法。2.1透析法1861年Thomas Graham發(fā)明透析方法 ,已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中最簡(jiǎn)易常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的分離過(guò)程中,除鹽、少量有機(jī)溶劑、生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都需用到透析?，F(xiàn)在，除半透膜的材料更加多樣化，透析方式也更加多樣。透析法主要是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過(guò)半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。例如分離和純化DNA、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等物質(zhì)時(shí)，可用透析法以除去無(wú)機(jī)鹽、單糖、雙糖等雜質(zhì)。反之也可將大分子的雜質(zhì)留在半透膜內(nèi)，而將小分子的

4、物質(zhì)通過(guò)半透膜進(jìn)入膜外溶液中，而加以分離精制：透析是否成功與透析膜的規(guī)格關(guān)系極大。透析膜的膜孔有大有小，要根據(jù)欲分離成分的具體情況而選擇。透析膜有動(dòng)物性膜、火棉膠膜、羊皮紙膜、蛋白質(zhì)膠膜、玻璃紙膜等。分離時(shí)，加入欲透析的樣品溶液，懸掛在純化水容器中，經(jīng)常更換水加大膜內(nèi)外溶液濃度壓，必要時(shí)適當(dāng)加熱，并加以攪拌，以利透析更快。最后，透析是否完全，須對(duì)透析膜內(nèi)溶液進(jìn)行檢測(cè)。2.2溶劑萃取法溶劑萃取法是在20世紀(jì)40年代興起的一項(xiàng)化工分離技術(shù)，很被快應(yīng)用到了生物分子的純化和分離上?；驹硎怯靡环N溶劑將產(chǎn)物自另一種溶劑中提取出來(lái)以達(dá)到濃縮和提純的目的。最初是用于抗生素有機(jī)酸，維生素等生物小分子的提取，

5、最近幾十年來(lái)隨著與其它技術(shù)的結(jié)合而產(chǎn)生了一系列新的分離技術(shù)，如超臨界萃取、逆膠束萃取、液膜萃取等，可以用于生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、生物堿等的提取和純化。在液體混合物溶液中加入某種溶劑，使溶液中的組分得到全部或部分分離的過(guò)程稱為萃取，溶劑萃取法是從稀溶液中提取物質(zhì)的一種有效方法2。2.3沉淀法 沉淀法是利用沉淀反應(yīng)，將被測(cè)組分轉(zhuǎn)化為難溶物，以沉淀形式從溶液中分離出來(lái)，并轉(zhuǎn)化為稱量過(guò)程，稱定其重量進(jìn)行檢測(cè)的方法。利用鹽析法將蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)的方法由來(lái)已久。其基本原理是蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃度升高而增加。球蛋白當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出。這是由于蛋白質(zhì)分

6、子內(nèi)和分子間的電荷的極性基團(tuán)有靜電引力。當(dāng)水中加入少量鹽時(shí)，鹽離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子一的極性基團(tuán)的影響。有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能產(chǎn)生沉淀作用。優(yōu)點(diǎn)是其分辨度比鹽析法高，溶劑容易除去且可回收，沉淀的蛋白質(zhì)不需要脫鹽。而缺點(diǎn)是有機(jī)溶劑易使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)常采用降低溫度的方法進(jìn)行控制，且有機(jī)試劑用量大，回收、儲(chǔ)存都較麻煩。2.4超濾法超濾技術(shù)是一種加壓膜分離技術(shù)。20世紀(jì)20年代問(wèn)世，至60年代以來(lái)其發(fā)展迅速，很快由實(shí)驗(yàn)室級(jí)的分離技術(shù)發(fā)展成重要的工業(yè)級(jí)操作技術(shù)。 超濾作為一種高效分離技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子的脫鹽、濃縮和分級(jí)分離?；驹硪猿瑸V膜

7、篩為中介，膜兩側(cè)的壓力差為動(dòng)力，當(dāng)原液流過(guò)膜表面時(shí)，超濾膜表面密布的許多細(xì)小的微孔只允許水及小分子物質(zhì)通過(guò)而成為透過(guò)液，而原液中體積大于膜表面微孔徑的物質(zhì)則被截留在膜的進(jìn)液側(cè)，成為濃縮液，因而實(shí)現(xiàn)對(duì)原液的凈化、分離和濃縮的目的。優(yōu)點(diǎn)是超濾技術(shù)分離效率高，對(duì)稀溶液中的微量成分的回收、低濃度溶液的濃縮均非常有效。其局限性是不能直接得到干粉制劑。對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到1050%的濃度。3. 現(xiàn)代分離技術(shù)3.1電泳技術(shù)帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的移動(dòng)，稱為電泳(electrop horesis, EP)。利用帶電粒子在電場(chǎng)中速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。1937 年學(xué)者 A.

8、W.K.蒂塞利烏斯設(shè)計(jì)制造了移動(dòng)界面電泳儀 ，分離了馬血清白蛋白的3種球蛋白，創(chuàng)建了。目前所采用的方法,大致可分為3類:電泳,自由和。隨著電泳支持物的改進(jìn)，電泳條件的完善，區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳等技術(shù)逐漸建立起來(lái)，同時(shí)，在電泳模式上也有了極大的發(fā)展，先后出現(xiàn)了圓盤(pán)電泳、垂直板電泳、柱狀()電泳等，電泳分辨率也隨之得到提高。目前應(yīng)用最為廣泛的有醋酸纖維薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向凝膠電泳技術(shù)等。3.1.1醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳，與紙電泳相似，只是換用了醋酸纖維薄膜作為支持介質(zhì)。將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨?，溶于丙酮后涂布成有均一細(xì)密微孔的薄膜，其厚度為0.10.15mm

9、。由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡(jiǎn)單、快速、價(jià)廉，目前已廣泛用于分析檢測(cè)血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、體液、脊髓液、脫氫酶、多肽、核酸及其他生物大分子，為心血管疾病、肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)，因而已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)3。3.1.2 SDSPAGE在聚丙烯酰胺凝膠電泳基礎(chǔ)上添加去污劑十二烷基硫酸鈉(簡(jiǎn)稱SDS)蛋白質(zhì)因?yàn)榕cSDS結(jié)合而帶有大量電荷。從而消除蛋白質(zhì)原有的電荷量差別，其泳動(dòng)速度便主要和分子大小有關(guān)。這種SDS-聚丙酰胺電泳是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度柱測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。SDSPAGE應(yīng)用于提純過(guò)程中純度的檢測(cè)純化的蛋白質(zhì)

10、通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶。但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的它在電泳中可能會(huì)形成分別對(duì)應(yīng)于各個(gè)亞基的幾條帶。SDSPAGE具有較高的靈敏度一般只需要不到微克級(jí)的蛋白質(zhì)，而且通過(guò)電泳還可以獲得關(guān)于分子量的情況4。3.1.3雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)技術(shù)又稱二維凝膠電泳技術(shù)，是目前常用的唯一一種能夠連續(xù)地在一塊膠上分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法，第一，采用等電聚集電泳。第二，采用了十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，其原理是將高分辨率的等電聚集電泳和SDS-PAGE電泳聯(lián)合組成雙向電泳。

11、3.1.4電泳與其他聯(lián)用技術(shù)毛細(xì)管電泳時(shí)帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中接其淌度或分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細(xì)管電泳。其分離模式有：毛細(xì)管區(qū)帶電泳、膠束電動(dòng)色譜、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等速電泳、毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦，毛細(xì)管電色譜。毛細(xì)管電棘(EE)作為一種分離技術(shù)與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用作為一種檢測(cè)方法，在食品分析領(lǐng)域具有重要優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗Y(jié)合了毛細(xì)管電泳的強(qiáng)分離能力以及質(zhì)譜在定性和確證方面的強(qiáng)大功能。近來(lái)，許多有關(guān)多維毛細(xì)管電泳分離技術(shù)的設(shè)想已被提出有些還得到了初步的嘗試，其分離的優(yōu)勢(shì)也得到人們的關(guān)注。與傳統(tǒng)的分離方法相比，CE具有分離效率高、分析速度快、樣品及試劑用量少

12、等特點(diǎn)，使其成為極為有效的分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)、糖類、核酸等物質(zhì)5。毛細(xì)管電色譜是將常規(guī)色譜填料填充到毛細(xì)管中 , 或在毛細(xì)管內(nèi)表面鍵合、涂敷固定相 , 以電滲流作為流動(dòng)相的推動(dòng)力 , 根據(jù)樣品中各組分在固定相和流動(dòng)相間分配系數(shù)的差異和在電場(chǎng)中遷移速率的不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種高效微分離技術(shù)。近年來(lái) CEC 在分離分析生物大分子中應(yīng)用較為廣泛。不少研究工作者開(kāi)始將研究方向轉(zhuǎn)移到CEC分離分析生物大分子。如 CEC 結(jié)合了 CE 的高效性和 HPLC 的高選擇性 , 是一種新型的微柱分離分析技術(shù) 7, 已成為蛋白質(zhì)等生物大分子分離分析的方法 , 它的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)的分離分析提供了一條新的有效

13、途徑8。但目前 CEC 主要是以電驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相為分離模式, 操作中易產(chǎn)生氣泡 , 使其受到很大的限制。加壓毛細(xì)管電色譜 (PEC) 的出現(xiàn)解決了長(zhǎng)期限制 CEC 廣泛使用的問(wèn)題 ,PEC克服了僅靠電滲流驅(qū)動(dòng)的一些限制因素 , 可方便地對(duì)流動(dòng)相組成、性質(zhì)、流速進(jìn)行調(diào)節(jié) , 抑制氣泡的形成 , 尤其能實(shí)現(xiàn)梯度洗脫 , 是 CEC 發(fā)展的重要方向9。3.2色譜技術(shù) 色譜法是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同，當(dāng)流動(dòng)相推動(dòng)樣品 中的組分通過(guò)固定相時(shí) ，在兩相中進(jìn)行連續(xù)反復(fù)多次分配，從而形成差速移動(dòng)，達(dá)到分離的方法。色譜被認(rèn)為是迄今人類掌握的對(duì)復(fù)雜混合物分離能力最強(qiáng)的手段。特別是液相色譜，大都在室溫條

14、件下進(jìn)行；所有的流動(dòng)相可以是與生理液相似的具有一定pH 值的含鹽的緩沖水溶液 ，有時(shí)也使用某些能與水互溶 的有機(jī)溶劑；所用填料的表面經(jīng)過(guò)了各種相應(yīng)的化學(xué)修飾和覆蓋，這樣就為生物大分子的分離提供了溫和的條件和軟接觸表面，有利于它們保持原有的構(gòu)象和生理活性。所以液相層析作為生物大分子的分離重要方法具有很大的發(fā)展前景 。據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分四大基礎(chǔ)類型 ：分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、凝膠色譜，可根據(jù)生物大分子結(jié)構(gòu) 、生物活性、分子量大小等性質(zhì)不同，選擇不同的分離純化模式。多維液相色譜法是利用兩根或多根性質(zhì)不同的色譜柱，通過(guò)一定的接口和切換技術(shù)對(duì)不同色譜分離模式的結(jié)合，或一根色譜柱內(nèi)通過(guò)

15、填充不同分離模式的色譜填料，完成對(duì)復(fù)雜樣品的待分析組分進(jìn)行分離。多位液相色譜具有分離樣品動(dòng)態(tài)范圍寬、分辨率高、分析速度快、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。近幾年來(lái)，多維液相色譜分離模式在蛋白質(zhì)組學(xué)和生物制藥領(lǐng)域得到了很廣泛的應(yīng)用。親和色譜是專門(mén)用于純化生物大分子的色譜分離技術(shù)，它是基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來(lái)進(jìn)行相互分離的。親和色譜的顯著特點(diǎn)：具有其他分離技術(shù)所不能比擬的高選擇性，且色譜過(guò)程操作條件溫和，能有效地保持生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，活性樣品的回收率也比較高。所以親和色譜被廣泛用于酶、治療蛋白、抗體、核酸、輔助因子等生物大分子以及細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等超分子物質(zhì)的分離與純

16、化。特別是對(duì)分離含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)最有效，經(jīng)一步親和色譜即可提純幾百至幾千倍。親和膜色譜親和膜色譜以膜為親和載體，偶聯(lián)親和配基，選擇性地吸收目標(biāo)物質(zhì)。親和膜色譜是在親和色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，是現(xiàn)代膜分離技術(shù)與親和色譜技術(shù)的結(jié)合。徑向色譜技術(shù)是最有效的復(fù)雜樣品快速分離、制備工具之一，尤其在生物樣品的制備、復(fù)雜樣品的初分離等方面與傳統(tǒng)軸向液相色譜相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)的發(fā)展可以追溯到60年前，1947年，Hopf發(fā)明了一種通過(guò)離心力分離液體溶液的裝置，在大規(guī)模制備分離方面得到很好的應(yīng)用10。1972年，Heftmann11將這種液體分離器的尺寸減小，轉(zhuǎn)速增加到1950rrain，分

17、離效率得到較大提高。帶有填充顆粒床的徑向流離心分離器最早應(yīng)用于化學(xué)反應(yīng)器，后來(lái)也被收入到分析化學(xué)中。Saxena12等在美國(guó)專利“徑向薄層色譜”中，對(duì)徑向色譜技術(shù)的特點(diǎn)、操作及原理進(jìn)行了闡述； Rice13等擱采用特殊設(shè)計(jì)解決了流體在床層中的分布問(wèn)題，使徑向色譜在上樣量、分離速度等諸多方面的優(yōu)勢(shì)明顯地表現(xiàn)出來(lái)，推動(dòng)了徑向色譜的實(shí)用化進(jìn)程，真正使徑向色譜走向產(chǎn)業(yè)化。隨著生物工程技術(shù)研究的不斷深入，徑向色譜的應(yīng)用前景非常廣闊。采用徑向色譜技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)類生物大分子進(jìn)行精制，不僅可以改善產(chǎn)品質(zhì)量，提高生產(chǎn)效率，也可以簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程的連續(xù)化和自動(dòng)化，將是今后一段時(shí)問(wèn)色譜方法與生物技術(shù)結(jié)合的重

18、要發(fā)展方向。4展望生命科學(xué)最為最具潛力的學(xué)科，其發(fā)展與進(jìn)步與生物大分子分離技術(shù)緊密聯(lián)系。隨著生物技術(shù)成果的不斷積累和生物技術(shù)在生產(chǎn)加工實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用，在理論和技術(shù)研究上都得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，生物制品的分離與純化技術(shù)也已經(jīng)已成為實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)是否可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)的關(guān)鍵。發(fā)展層析柱和凝膠過(guò)濾柱的放大技術(shù)，大規(guī)模分離過(guò)程的自動(dòng)控制下，游工程的集成優(yōu)化技術(shù)等成為工業(yè)化生產(chǎn)中的關(guān)鍵，液相色譜是工業(yè)生產(chǎn)上常用的有效方法，而模擬移動(dòng)床色譜和徑向色譜等將在生物工程領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。在研究和完善一些適用于生化工程的新型分離技術(shù)的同時(shí)，進(jìn)行各種分離技術(shù)的高效集成化，可以達(dá)到提高產(chǎn)品收率、降低過(guò)程能耗和增加產(chǎn)

19、率。在這個(gè)生命領(lǐng)域交叉快速發(fā)展，并與其他技術(shù)相互推動(dòng)促進(jìn)進(jìn)的世紀(jì)，生物大分子分離技術(shù)必將向著計(jì)算機(jī)自動(dòng)化或半自動(dòng)化方向發(fā)展，以其高效與簡(jiǎn)便使得生命科學(xué)領(lǐng)域再做突破。參考文獻(xiàn)：1 王鏡巖.生物化學(xué),北京:高等教育出版社,2002,307-313.2 蘇拔賢.生物化學(xué)制備技術(shù).北京:科學(xué)出版社，1986,5152.3 孫莉麗，李榮華醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)J實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2010，13(2)：58-624 蓋新娜，蔣輝用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法提純蛋白J實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理,2001，18(4)：44455 鄧延倬，何金蘭. 高效毛細(xì)管電泳.北京科學(xué)出版社,1996,272317

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