熒光共振能量轉(zhuǎn)移

1、FRET技術(shù)研究PEDF和目標(biāo)蛋白之間在小鼠神經(jīng)元（神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）的相互作用一、FRET技術(shù)基本原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移（即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移）。FRET是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程，使供體熒光強(qiáng)度降低，而受體可以發(fā)射更強(qiáng)于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發(fā)熒光（熒光猝滅），同時也伴隨著熒光壽命的相應(yīng)縮短或延長。能量轉(zhuǎn)移的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的

2、躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等因素有關(guān)。作為共振能量轉(zhuǎn)移供、受體對，熒光物質(zhì)必須滿足以下條件：受、供體的激發(fā)光要足夠分得開；供體的發(fā)光光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊。人們已經(jīng)利用生物體自身的熒光或者將有機(jī)熒光染料標(biāo)記到所研究的對象上，成功地應(yīng)用于核酸檢測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能分析、免疫分析及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)功能檢測等諸多方面。（傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料吸收光譜窄，發(fā)射光譜常常伴有拖尾，這樣會影響供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，而且供、受體發(fā)射光譜產(chǎn)生相互干擾。最新的一些報道將發(fā)光量子點用于共振能量轉(zhuǎn)移研究，克服了有機(jī)熒光染料的不足之處。相對于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料分子，量子點的發(fā)射光譜很窄而且不拖尾，減

3、少了供體與受體發(fā)射光譜的重疊，避免了相互間的干擾；由于量子點具有較寬的光譜激發(fā)范圍，當(dāng)它作為能量供體時，可以更自由地選擇激發(fā)波長，可以最大限度地避免對能量受體的直接激發(fā)；通過改變量子點的組成或尺寸，可以使其發(fā)射可見光區(qū)任一波長的光，也就是說它可以為吸收光譜在可見區(qū)的任一生色團(tuán)作能量供體，并且保證了供體發(fā)射波長與受體吸收波長的良好重疊，增加了共振能量轉(zhuǎn)移效率。） 以GFP的兩個突變體CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）為例簡要說明其原理：CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時

4、，用CFP的吸收波長激發(fā)，CFP的發(fā)色基團(tuán)將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏。例如要研究兩種蛋白質(zhì)a和b間的相互作用，可以根據(jù)FRET原理構(gòu)建融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白質(zhì)b、YFP（yellow fluorescent protein）。用CFP吸收波長433nm作為激發(fā)波長，實驗靈巧設(shè)計，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒有發(fā)生相互作用時，CFP與YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光

5、共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是CFP的發(fā)射波長為476nm的熒光；但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是YFP的發(fā)射波長為527nm的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì)胞生理條件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。黃色熒光蛋白報告載體，如下圖：青色熒光蛋白報告載體，如下圖：一質(zhì)粒的選擇及載體構(gòu)建：訂購：1.帶有Sal I和Sac II兩個酶切位點的小鼠PEDF過表達(dá)克隆質(zhì)粒2.帶有Kpn I和Xba I兩個酶切位點的小鼠目標(biāo)蛋白過表達(dá)克隆質(zhì)粒3.pECFPC

6、1質(zhì)粒4.pEYFPC1質(zhì)粒5. Sal I、Sac II、Kpn I、Xba I內(nèi)切酶6.dna合成酶等二 PEDF核青色熒光蛋白（pECFP-C1）表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定小鼠c57PEDF序列blst獲得：1 atgcaggccc tggtgctact cctctggact ggagccctgc tcgggcacgg cagcagccag61 aacgtcccca gcagctctga gggctcccca gtcccggaca gcacgggcga gcccgtggag121 gaggaggacc ccttcttcaa ggtccctgtg aacaagctgg cagcagctgt ct

7、ccaacttc181 ggctacgatc tgtaccgcct gagatccagt gccagcccaa cgggcaacgt cctgctgtct241 ccactcagcg tggccacggc cctctctgcc ctttctctgg gagctgaaca tcgaacagag301 tctgtcattc accgggctct ctactacgac ctgatcacca accctgacat ccacagcacc361 tacaaggagc tccttgcctc tgttactgcc cctgagaaga acctcaagag tgcttccaga421 attgtgtttg a

8、gaggaaact tcgagtcaaa tccagctttg ttgcccctct ggagaagtcc481 tatgggacca ggccccggat cctcacgggc aaccctcgag tagaccttca ggagattaac541 aactgggtgc aggcccagat gaaagggaag attgcccggt ccacgaggga aatgcccagt601 gccctcagca tccttctcct tggcgtggct tacttcaagg ggcagtgggt aaccaagttt661 gactcgagaa agacgaccct ccaggatttt cat

9、ttggacg aggacaggac cgtgagagtc721 cccatgatgt cagatcctaa ggccatctta cgatacggct tggactctga tctcaactgc781 aagattgccc agctgccctt gacaggaagt atgagcatca tcttcttcct gcccctgacc841 gtgacccaga acttgaccat gatagaagag agcctcacct ctgagttcat tcatgacatc901 gaccgagaac tgaagactat ccaagctgtg ctgactgtcc ccaagctgaa gctga

10、gcttc961 gaaggcgaac ttaccaagtc tctgcaggac atgaagctac agtcgttgtt tgaatcaccc1021 gacttcagca agattactgg caaacccgtg aagctcaccc aagtggaaca cagggctgct1081 ttcgagtgga atgaagaggg ggcaggaagc agccccagcc caggcctcca gcccgtccgc1141 ctcaccttcc cgctagacta tcaccttaac caacctttcc tctttgttct gagggacacg1201 gacacggggg

11、ccctcctctt cataggcaga atcctggacc ccagtagtac ttaa分別在上游引物序列的5端和下游引物的5分別加入Sal I和Sac II兩個酶切位點序列。設(shè)計引物序列如下：Primer F：5、GTCGAC- atgcaggccctggtgctact-3、Primer R：5、CCGCGG-ttaagtactactggggtcca-3、其中GTCGAC為酶切位點Sal I，CCGCGG為酶切位點Sac II。引物中未加入保護(hù)堿基。具體構(gòu)建質(zhì)粒pECFP-C1-pedf步驟：1. pedf片段的pcr擴(kuò)增，提取和純化2. 有文獻(xiàn)報道利用一次中間載體topo載體的構(gòu)建

12、可以相對容易的將pedf構(gòu)建到pECFP-C1中，不知道這個實驗需要不需要做這一步？3. pECFP-C1質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取和純化4. pECFP-C1質(zhì)粒的酶切5. pECFP-C1片段的去磷酸化用去磷酸化試劑盒Cloned Alkaline Phosphatase(CIAP)將pECFP-C1片段切口去磷酸化。（不知道是不是必須做這一步）6. pECFP-C1酶切片段的純化(47kb)試劑盒(瓊脂糖凝膠DNAPCR產(chǎn)物小量回收試劑盒TaKaR A：DV805A)12瓊脂糖凝膠回收的DNA量應(yīng)大于200ngul7. pECFP-C1-pedf質(zhì)粒的連接和轉(zhuǎn)化8. pECFP-C1-pedf質(zhì)粒

13、的擴(kuò)增、提取和純化（菌液pcr）9. pECFP-C1-pedf質(zhì)粒的鑒定（送公司測序）三目標(biāo)蛋白基因序列及引物設(shè)計：分別在上游引物序列的5端和下游引物的5分別加入Kpn I和Xba I兩個酶切位點序列。設(shè)計引物序列如下：Primer F：5、ATGGTACC- 。-3、Primer R：5、ATTCTAGA- 。-3、其中GTCGAC為酶切位點Kpn I，CCGCGG為酶切位點點Xba I。引物中5，端加入保護(hù)堿基AT。pEYFP-C1-目標(biāo)蛋白載體的構(gòu)建與上述步驟類似。四陽性對照質(zhì)粒pECFP-C1-YFP的構(gòu)建及鑒定Primer F：5、-GTCGACATGGTGAGCAAG-3、Pri

14、mer R：5、-CCGCGGTCTAGATCCGGTG-3、其中GTCGAC為Sal I酶切位點，CCGCGG為Sac II酶切位點。載體具體構(gòu)建過程與上述過程相同。五PEDF和目標(biāo)蛋白在神經(jīng)細(xì)胞（或膠質(zhì)細(xì)胞）中的FRET研究1.神經(jīng)細(xì)胞（或膠質(zhì)細(xì)胞）的培養(yǎng)2. PEDF蛋白和目標(biāo)蛋白在神經(jīng)細(xì)胞（或膠質(zhì)細(xì)胞）中的免疫熒光定位：將神經(jīng)細(xì)胞（或膠質(zhì)細(xì)胞）均勻種植在petri皿里，24h后待細(xì)胞貼壁。PBS液洗細(xì)胞3次，再用4多聚甲醛固定15min，PBS液洗3次。用0.5Triton穿孔15min，再用PBS洗3次每次5min。然后用IBSA封閉30min。將petri皿小室內(nèi)液體吸干凈，加入用IBSA按1：1000稀釋好的PEDF和目標(biāo)蛋白抗體，4過夜后，用PBS洗3次，加入二抗，37。C孵育1h。用PBS洗3次。此過程注意避光。加200ulFluoAnti fading medium防止熒光淬滅，在共聚焦顯微鏡下觀察。3. 熒光融合蛋白在神經(jīng)細(xì)胞（或膠質(zhì)細(xì)胞）中的表達(dá)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下觀察并拍照后，細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行免疫蛋白印跡分析4.激光共聚焦顯微鏡檢測FRE