東南亞缺失型α地中海貧血的聚合酶鏈反應(yīng)快速診斷技術(shù)及產(chǎn)前診斷

1、    東南亞缺失型地中海貧血的 聚合酶鏈反應(yīng)快速診斷技術(shù)及產(chǎn)前診斷        【摘要】目的針對東南亞缺失型地中海貧血（-SEA）建立一種快速、簡便的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基因診斷技術(shù)，并初步應(yīng)用于高危胎兒的產(chǎn)前診斷。方法采用跨越斷裂點的PCR設(shè)計方案，其中一對引物用于擴(kuò)增-SEA缺失基因，另一對引物設(shè)計在-SEA、-3.7、-4.2的公共缺失區(qū)域，用于擴(kuò)增正常的珠蛋白基因，兩對引物在單管中反應(yīng)。用該方法對8例高風(fēng)險Barts水腫胎進(jìn)行產(chǎn)前診斷。結(jié)果-SEA缺失

2、基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為740bp，正常等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為1052bp。進(jìn)行產(chǎn)前診斷的8例高風(fēng)險Barts水腫胎，檢出正常胎兒3例，-SEA雜合子3例，Hb Barts水腫胎兒2例。結(jié)論該法快速、準(zhǔn)確，可作為常規(guī)方法用于臨床樣品的分子篩查及Barts水腫胎和缺失型HbH病的產(chǎn)前診斷?！娟P(guān)鍵詞】地中海貧血；聚合酶鏈反應(yīng)；產(chǎn)前診斷；基因 Rapid detection of -thalassemia of Southeast Asian deletion by polymerase chain reaction and its application to prenatal diagnosisXIAO

3、Weiwei, XU Xiangmin，LIU Zhongying. Institute of Molecular Biology, First Military Medical University,Guangzhou510515,China【Abstract】ObjectiveTo establish a rapid and simple polymerase chain reaction(PCR) method for detecting -thalassemia of Southeast Asia deletion，and apply it to the prenatal diagno

4、sis for high risk fetuses. Methods Two pairs of primers were designed：one pair bridging the breakpoints to identify the specific deletion, the other located in the common deletion region of -SEA, -3.7 and -4.2 gene to detect the normal chromosomes. In this system, the two amplifications ran in the s

5、ame PCR tube under identical condition. ResultsA 740bp fragment was amplified in chromosomes with -SEA determinant and a 1052bp fragment in normal chromosomes. For prenatal diagnosis, 3 of 8 at-risk cases were diagnosed as normal, 3 as heterozygotes, and 2 as homozygotes of -SEA deletion. Conclusion

6、This detection method is rapid and accurate and can be used as a routine method for carrier detection and prenatal diagnosis.【Key words】alpha-Thalassemia;Polymerase chain reaction；Prenatal diagnosis；Gene地中海貧血（地貧）是具有高度異質(zhì)性的單基因遺傳病，其主要特征是珠蛋白鏈合成減少h（+地貧）或缺如（0地貧）。地貧分子缺陷有基因的大片段缺失和非缺失突變兩大類1。珠蛋白基因缺失是導(dǎo)致地貧的主要原因

7、，迄今世界上至少報道了35種此類突變，其中包括6種地貧2和29種地貧12。中國人中常見的缺失型地貧基因為-SEA、-3.7和-4.2，-SEA自身或與-3.7(或-4.2)相互組合是構(gòu)成中國人Hb Bart's水腫胎和缺失型HbH病的主要分子病理基礎(chǔ)2。Hb Bart's水腫胎多在出生前或出生后數(shù)小時內(nèi)死亡，缺失型HbH病患者常有中重度貧血，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。對地貧目前尚無根本有效的治療方法，通過遺傳篩查和產(chǎn)前診斷選擇性淘汰重癥地貧胎兒是控制該病發(fā)生的唯一途徑。經(jīng)典的Southern雜交技術(shù)能診斷Hb Bart's水腫胎和缺失型HbH病，但該法存在操作繁瑣、實驗周期

8、長及使用放射性核素標(biāo)記等諸多限制，不利于臨床推廣應(yīng)用。Chang等3創(chuàng)立的跨越斷裂點聚合酶鏈反應(yīng)（gap-PCR）技術(shù)，簡便、準(zhǔn)確，能有效地對-SEA基因進(jìn)行分子篩查和對Hb Bart's水腫胎進(jìn)行產(chǎn)前診斷，但不能對缺失型HbH病進(jìn)行診斷。我們在gap-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過對內(nèi)對照引物的設(shè)計，形成一種新型、快速、簡便的PCR診斷技術(shù)。該技術(shù)既能用于-SEA基因的分子篩查，又能用于Hb Bart's水腫胎和缺失型HbH病的產(chǎn)前診斷，而且能鑒別臨床常見的缺失型HbH病和非缺失型HbH病。材料和方法1DNA樣品1.16份已知基因型標(biāo)準(zhǔn)樣品：/，/-SEA，-SEA/-3.7，-S

9、EA/-4.2，-SEA/-SEA各1份,其基因型經(jīng)Southern雜交法確定；-SEA/CS樣品經(jīng)Southern雜交法和我室用PCR限制性內(nèi)切酶譜分析法4確定。上述Southern雜交樣品由曾瑞萍教授（中山醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室）和美國加利福尼亞大學(xué)Kan教授惠贈。1.2產(chǎn)前診斷樣品：8例高風(fēng)險Bart's水腫胎兒及其父母的DNA樣品。胎兒樣品由第一軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，其父母均有Bart's水腫胎生育史。胎兒取樣采用羊膜穿刺術(shù)，父母樣品取自靜脈血。胎兒及其父母的DNA按氯仿/酚抽提法，從羊水細(xì)胞或白細(xì)胞中提取。正常分娩后或引產(chǎn)后進(jìn)一步用分子診斷法驗證。2引物設(shè)

10、計檢測-SEA缺失基因的引物采用gap-PCR設(shè)計方案，即在缺失基因-SEA5端斷裂點上游和3端斷裂點下游設(shè)計一對特異性引物P1/P2，在正常等位基因上該對引物相距太遠(yuǎn)，無法形成PCR反應(yīng)，而在-SEA等位基因上因基因大片段缺失而靠近，從而能特異地擴(kuò)增出代表該缺失突變存在的一740bp的DNA片段。內(nèi)對照引物對P3/P4位于常見缺失基因-SEA、-3.7和-4.2的公共缺失區(qū)域，用以擴(kuò)增正常珠蛋白等位基因，其擴(kuò)增產(chǎn)物為1052bp。此外,為利于雙重PCR,在每條引物的特異性基因序列的5端連上一段由20個核苷酸組成的與人類基因不同源的高GC含量尾序列。兩對寡核苷酸引物的序列及其在珠蛋白基因簇中的

11、位置如表1和1中所示。3PCR擴(kuò)增Taq聚合酶及反應(yīng)緩沖液購自加拿大真達(dá)科技有限公司，dNTP為德國Boehringer Mannheim產(chǎn)品。4引物在單管中擴(kuò)增，25l反應(yīng)總體積中含基因組DNA0.1g，dNTPs 0.2mmol/L，4引物各6.25pmol，Taq DNA聚合酶1U。PCR在PE-480（美國Perkin-Elmer公司）擴(kuò)增儀上進(jìn)行，循環(huán)參數(shù)為99變性3min，85加酶，55退火1min，72延伸3min；然后95 1min，55 1min，72 2min，進(jìn)行30個循環(huán)；最后一個循環(huán)72 5min。PCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察攝片。表1引物的

12、序列及位置引物位置(GenBank編號)序列(53)P1HUMHBA4/J00153CTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG(2551-2572)P2HSCOS12/Z69706ATATATGGGTCTGGAAGTGTATC(3177-3155)P3HUMHBA4/J00153CACTTCCTGTGTCACGGT(7956-7973)P4HUMHBA4/J00153CTCCGACCAGCTTAGCAAT(8967-8949)     結(jié)果 為檢驗引物的特異性，先用6份已知基因型的DNA樣本作對照進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示這兩對引物能分別特異性地擴(kuò)增相應(yīng)的D

13、NA片段（2）。從2可以看出，正常人的DNA樣本只產(chǎn)生一條1052bp的片段；標(biāo)準(zhǔn)型地貧患者（-SEA/）除有1052bp的片段外，還有一條740bp的片段；缺失型HbH病患者（-SEA/-3.7，-SEA/-4.2）一條染色體上有-SEA大片段缺失，另一條染色體上珠蛋白基因也部分缺失，引物對P3/P4不能與模板退火，因此只能擴(kuò)增出一條740bp的片段；而非缺失型HbH病患者（-SEA/CS），由于尚有一條染色體上的珠蛋白基因未缺失，故有1052bp和740bp兩個片段；Hb Bart's水腫胎兒只能擴(kuò)增出740bp的片段。進(jìn)行產(chǎn)前診斷的8例高風(fēng)險Bart's水腫胎兒，其父母均

14、有Bart's水腫胎生育史。產(chǎn)前診斷結(jié)果為Bart's水腫胎2例，-SEA雜合子3例，正常胎兒3例，8例胎兒的父母均為-SEA雜合子。3為其中2例高風(fēng)險Bart's水腫胎兒及其父母的產(chǎn)前基因診斷結(jié)果：胎兒1為正常胎兒，胎兒2為Bart's水腫胎兒。到目前為止，8例胎兒均已完成了流產(chǎn)后或正常分娩后的基因分析驗證，結(jié)果與產(chǎn)前診斷完全一致。     1引物P1、P2、P3、P4在珠蛋白基因簇中的位置     1：PCR markers（華美公司）；2：陰性對照；3：/；4：/-SEA；5：

15、-SEA/CS；6：-SEA/-3.7；7：-SEA/-4.2；8：-SEA/-SEA26份標(biāo)準(zhǔn)樣品的PCR分析結(jié)果     1：PCR markers（華美公司）；2：父親1；3：母親1；4：胎兒1；5：父親2；6：母親2；7：胎兒232例高風(fēng)險Bart's水腫胎兒的產(chǎn)前診斷結(jié)果討 論-SEA是中國人中最常見的地貧基因。目前本室和國內(nèi)外一些實驗室建立了檢測-SEA突變的gap-PCR技術(shù)3，5-8。在本法中，我們作了兩大方面的改進(jìn)：通過引物和反應(yīng)體系的調(diào)整，兩對特異性引物不是分管，而是在單管中一起進(jìn)行反應(yīng)，即進(jìn)行雙重PCR。雙重PCR技術(shù)能簡化

16、操作步驟，減少加樣機(jī)會，降低污染的可能性，并可節(jié)約樣品和試劑，降低費用。此外，由于正?；蚝腿笔Щ蛟谕惑w系中擴(kuò)增，有利于PCR的質(zhì)量控制，提高反應(yīng)體系結(jié)果的可靠性。在中國人常見的-SEA、-3.7、-4.2突變的公共缺失區(qū)域設(shè)計引物，而不是在-SEA某一個缺失斷裂點上、下游分別設(shè)計引物擴(kuò)增珠蛋白基因作為內(nèi)對照，其擴(kuò)增產(chǎn)物可用作缺失型地貧基因與非缺失型地貧基因的判別標(biāo)志。內(nèi)對照引物的設(shè)計策略是本法的一個重要創(chuàng)新點。除能檢測-SEA突變外，該設(shè)計優(yōu)勢還表現(xiàn)在能用于鑒別臨床上常見的缺失型HbH病與非缺失型HbH病。缺失型HbH病標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后，電泳結(jié)果只有一條代表-SEA缺失基因的擴(kuò)增片段，

17、非缺失型HbH病標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后，既有代表-SEA缺失基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，也有作為內(nèi)對照的珠蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物（見2中泳道57），故本法除能對Hb Bart's水腫胎進(jìn)行診斷外，還可結(jié)合家系分析對缺失型HbH病進(jìn)行診斷。此前對地貧進(jìn)行產(chǎn)前診斷的gap-PCR技術(shù)，主要局限于對Hb Bart's水腫胎的診斷3，5-8。Hb Bart's水腫胎和缺失型HbH病胎兒，兩者PCR擴(kuò)增后電泳的結(jié)果相同，均只有740bp的擴(kuò)增片段（參見2中泳道68），但在家系分析中Hb Bart's水腫胎兒的父母雙方均有740bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；而缺失型HbH病胎兒的父母，僅一方有740bp的擴(kuò)

18、增產(chǎn)物。在所進(jìn)行產(chǎn)前診斷的8例胎兒樣品中，未檢測到缺失型HbH病基因，這是由于樣品數(shù)量少、病例來源的不隨機(jī)性所造成的。在常見缺失基因的公共缺失區(qū)域設(shè)計內(nèi)對照引物，拓寬了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，利于推廣到基層醫(yī)院，作為常規(guī)方法用于臨床樣品-SEA基因的分子篩查、Hb Bart's水腫胎和缺失型HbH病的產(chǎn)前診斷及缺失型HbH病和非缺失型HbH病的鑒別。該方法的建立，為地貧的防治提供了一種新方法，對優(yōu)生優(yōu)育和提高人口素質(zhì)具有積極的意義。 基金項目:廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生重點項目基金資助項目(1996A0036)作者單位：肖維威（510515廣州，第一軍醫(yī)

19、大學(xué)分子生物學(xué)研究所）徐湘民（510515廣州，第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所）劉忠英（510515廣州，第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所）參 考 文 獻(xiàn)1，Higgs DR, Vickers MA, Wilkie AOM, et al. A review of the molecular genetics of the human -globin gene cluster. Blood, 1989, 73:1081-1104.2，肖維威，徐湘民，徐鈐. 中國人缺失型地中海貧血的分子基礎(chǔ)及產(chǎn)前基因診斷. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1998，18：68-72.3，Chang JG, Lee LS, Lin CP, et al. Rapid diagnosis of -thalassemia-1 of Southeast Asia type and hydrops fatalis by polymerase chain reaction. Blood, 1991, 78:853-854.4，徐湘民，張基增，李上奎. 應(yīng)用限制性內(nèi)切酶分析PCR產(chǎn)物快速診斷Hb CS基因突變. 中華血液學(xué)雜志，1994，1