全腦缺血再灌注損傷后ERK在大鼠海馬的表達及熱休克預處理對其

1、全腦缺血再灌注損傷后ERK在大鼠海馬的表達及熱休克預處理對其表達論文【關鍵詞】 腦缺血；再灌注損傷；熱休克預處理；細胞外信號調節(jié)MAP激酶類Expression of ERK in rat hippocampus after global cerebral ischemia/reperfusion and effect of heat shock preconditioning on it【Abstract】 AIM: To investigate the expression of ERK in hippocampus of SD rats after global cerebral isc

2、hemia/reperfusion and the effect of heat shock preconditioning on it, and to clarify the role of ERK in global cerebral ischemia/reperfusion injury. METHODS: Ninety healthy male SD rats were divided into 3 groups randomly: sham operation group (SO group, n=30), ischemia/reperfusion group (IR group,

3、n=30) and heat shock preconditioning group (HSP group, n=30). Global cerebral ischemia/reperfusion model was produced by 4VO method. The rats were put in 42 for 15 min as heat shock preconditioning, then subjected to 6 min ischemia followed by 2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d reperfusion, and all rats were ex

4、ecuted at corresponding time points. HE staining, immunohistochemical staining and TUNEL staining of brain tissue section were performed. RESULTS: In CA1 of IR group, ERK was expressed 2 h after global cerebral ischemia/reperfusion, peaked at 24 h and still lasted at 5 d. Expression in CA3 was weake

5、r than that in CA1 and cellular damage in CA1 was more obvious. Expression of ERK in CA1 and CA3 of HSP group were weaker than that in IR group at each time points (P<0.05). At the same time, cellular damage was weaker and apoptotic cells decreased(P<0.05). CONCLUSION: Overexpression of ERK af

6、ter global cerebral ischemia/reperfusion participated in the neuronal injury procedure and heat shock preconditioning exerted its brain protective function through its suppressive effect on the overexpression of ERK.【Keywords】 brain ischemia; reperfusion injury; heat shock preconditioning; extracell

7、ular signalregulated MAP kinases【摘要】 目的： 研究全腦缺血再灌注損傷后ERK在SD大鼠海馬的表達及熱休克預處理對其表達的影響，以闡明ERK在腦缺血再灌注損傷中作用機制. 方法： 健康雄性SD大鼠90只，隨機分為假手術組（SO組，n=30），缺血再灌注組（IR組，n=30），熱休克預處理組（HSP組，n=30），以四血管法建立全腦缺血再灌注模型，將大鼠置于42中15 min行熱休克預處理，全腦缺血6 min后2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d再灌注后處死，取海馬組織行HE染色，ERK免疫組化染色，TUNEL法檢測凋亡細胞. 結果： IR缺血再灌注后2

8、 h ERK在CA1區(qū)開始表達，24 h達到高峰，5 d仍有表達，CA3區(qū)弱于CA1區(qū)，同時CA1區(qū)細胞損傷明顯，HSP組ERK在CA1和CA3區(qū)相應時點均弱于IR組（P<0.05），細胞損傷輕微，凋亡細胞減少（P<0.05）. 結論： 全腦缺血再灌注損傷后ERK過度表達參與了神經元損傷過程，熱休克預處理通過下調ERK過度表達具有腦保護作用. 【關鍵詞】 腦缺血；再灌注損傷；熱休克預處理；細胞外信號調節(jié)MAP激酶類0引言近來研究發(fā)現，腦血流中斷和再灌注使腦組織細胞產生損傷級聯反應至少涉及4個不同機制：能量障礙、興奮性氨基酸毒性、梗死周圍去極化、炎癥及程序性細胞死亡，上述機制均與信號

9、通路調節(jié)有關1. 絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）家族成員是連接細胞膜表面受體與決定性基因表達之間重要調節(jié)酶，但對其成員之一ERK1/2（細胞外信號調節(jié)激酶）在腦缺血再灌注損傷中作用的研究結果卻相互矛盾，熱休克預處理可通過誘發(fā)產生熱休克蛋白而具有腦保護作用2，因此我們觀察SD大鼠全腦缺血再灌注損傷后ERK蛋白在海馬的表達及熱休克預處理對其表達的影響，以闡明ERK在全腦缺血再灌注損傷中的作用機制.1材料和方法1.1材料健康雄性SD大鼠90只，由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供，鼠齡5060 d，體質量(300±12) g，隨機分為3組，假手術組（SO, n=30），缺血再灌注組（IR, n

10、=30）和熱休克預處理組（HSP, n=30），各組6個時間段每時段5只. TUNEL試劑盒購自德國寶靈曼公司，ERK多克隆兔抗鼠抗體及辣根酶標記鏈霉卵白素試劑盒由美國Santa Gruz Bioteohnolgy公司生產. 1.2方法1.2.1動物模型制備所有動物均以20 g/L戊巴比妥鈉40 mg/kg行腹腔內注射麻醉，待翻正反射消失后俯臥固定于手術臺上，在大鼠枕頸正中切開皮膚顯露枕后三角，在顯微鏡下于枕后三角外側與第一橫突之間找到椎動脈博動后，以25 mV電凝器凝斷雙側椎動脈，逐層縫合，術畢回籠，使其體溫維持37左右. 24 h后以同樣方法麻醉，在胸鎖乳突肌后氣管旁，顯露頸總動脈，用無創(chuàng)

11、動脈夾同時夾閉6 min，期間密切觀察其瞳孔變化，無瞳孔散大者予以剔除，逐層縫合后回籠. 給予2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d再灌注后處死. HSP組： 將SD大鼠置于可控溫箱中42 15 min，于24 h后和IR組同樣處理. SO組： 除不凝斷椎動脈和夾閉頸總動脈外，其他處理同IR組. 1.2.2組織學檢查到要求時間時麻醉后于劍突下橫向剪開腹壁顯露膈肌，將其沿胸壁左右向剪開，將胸前壁離斷掀起，顯露心臟，用9號針從心尖插入心室，剪開右心房，先用生理鹽水然后再用4 g/L多聚甲醛200 mL灌注至肝臟變白、四肢僵硬，斷頭取腦，在視交叉后1 mm及4 mm處冠狀切面切開，取中間塊，固

12、定后石蠟包埋，在海馬齒狀回互包平面連續(xù)冠狀切片，片厚4 m. 行HE染色，光鏡下觀察SD大鼠海馬CA1，CA3區(qū)細胞形態(tài)學變化，采用TUNEL法原位檢測凋亡細胞，顯示細胞核有明顯的黃棕色顆?；虬咂瑸殛栃约毎?，即凋亡細胞，定量分析方法為： 光鏡下計算凋亡指數. 凋亡指數（apoptosis index, AI）計算方法： 每只動物隨機兩張切片，每張切片觀察CA1或CA3區(qū)，分別計算各區(qū)凋亡細胞數和總細胞數. AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%. 1.2.3免疫組織化學將切片脫蠟，微波修復抗原，置入30 mL/L H2O2室溫下孵育10 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min，滴加ERK多克隆抗體，為濃縮一抗，使用時用PBS稀釋為150進行滴定，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37孵育30 min, DAB顯色試劑顯色. 組織切片中顯示細胞漿或細胞核有明顯黃棕色顆粒或斑片為ERK陽性. 1.2.4灰度測定及結果判斷采用德國LeicaQ550E高清晰彩色圖文分析計算機系統(tǒng)對陽性結果進行半定量測定，將攝