細(xì)胞穩(wěn)定鈣離子內(nèi)流抑制劑羧基胺基咪唑抑制人肝癌誘導(dǎo)的血管形成

1、    細(xì)胞穩(wěn)定鈣離子內(nèi)流抑制劑羧基胺基咪唑 抑制人肝癌誘導(dǎo)的血管形成        【摘要】目的觀察細(xì)胞穩(wěn)定鈣離子內(nèi)流抑制劑羧基胺基咪唑(CAI)抑制內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建新生血管和人肝癌誘導(dǎo)血管形成的作用。方法應(yīng)用MTT、Boyden培養(yǎng)皿和人工基質(zhì)，研究CAI對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、遷移、降解基質(zhì)和構(gòu)建血管能力的影響，利用LCID-20瘤株裸鼠角膜模型觀察CAI對人肝癌誘導(dǎo)血管形成能力的影響。結(jié)果CAI的濃度超過10mmol/L時，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖明顯抑制；

2、與對照組相比，CAI組細(xì)胞的遷移、降解基質(zhì)和構(gòu)建血管的能力下降(P0.05)；2l CAI(100mol/L)軟膏動物涂眼，每日2次，CAI組動物角膜新生血管的數(shù)目和長度分別小于和短于對照組(P0.05)。結(jié)論CAI能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建新生血管和人肝癌誘導(dǎo)的血管形成?！娟P(guān)鍵詞】鈣離子內(nèi)流抑制劑，羧基胺基咪唑內(nèi)皮細(xì)胞血管形成，病理性腫瘤，人肝癌 Cytostatic calcium influx inhibitor carboxyamido-triazole inhibited angiogenesis induced by human hepatocellular carcinomaLI

3、Xiaoming, SUN Huichuan, TANG Zhaoyou.Liver Cancer Institute, Shanghai Medical University, Shanghai 200032【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effects of carboxyamido-triazole (CAI) on angiogenesis induced by human hepatocellular carcinoma (HCC). Methods MTT, boyden chamber and matrigel

4、 were used as models to study the effect of CAI on proliferation, motility and tube formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Tumor spheroids from the metastatic tumor line of HCC were implanted into the corneal micropockets of nude mice, and 2 l CAI (100 mol/L) was given as loti

5、on on the nude mice eyes twice every day. Results CAI suppressed proliferation of HUVECs, reduced motility through the matrigel and inhibited tube formation (P0.05). Compared with control group, the neovascularization induced by HCC on corneal was markedly inhibited in CAI-treated group (P0.05). Con

6、clusion CAI could inhibit neovascularization formed by HUVECs and angiogenesis induced by HCC.【Key words】 Calcium influx inhibitor Carboxyamido-triazole HUVECs Angiogenesis Human hepatocellular carcinoma羧基胺基咪唑(CAI)是一種鈣離子非電位通道抑制劑，具有抑制血管生長因子誘導(dǎo)的血管形成，延緩腫瘤病程，穩(wěn)定病情的藥理作用。我們利用裸鼠角膜血管形成模型等手段，探討了CAI對人肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管形成

7、的抑制作用。     材料和方法1. 細(xì)胞培養(yǎng)和人肝癌高轉(zhuǎn)移瘤株CAI由美國國立癌癥研究院Kohn E.C博士惠贈，溶于二甲亞砜制成母液(10mmol/L)。內(nèi)皮細(xì)胞取自胎兒臍靜脈，體外M199培養(yǎng)液加體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清(美國GIBCO公司)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF，1nmol/L，英國PeproTech公司)培養(yǎng)，傳代49次后用于實驗。腫瘤組織取自本所建立的人肝癌高轉(zhuǎn)移瘤株LCI D-201。2. MTT實驗將內(nèi)皮細(xì)胞接種96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，設(shè)對照、二甲亞砜(DMSO)、CAI共3組，用梯度稀釋的CAI與內(nèi)皮細(xì)胞共孵

8、育24小時后，常規(guī)操作，酶標(biāo)儀檢測OD值。3. 內(nèi)皮細(xì)胞運動和酶解分析將人工基質(zhì)Matrigel(北京醫(yī)科大學(xué)病理教研室)稀釋于無血清M199培養(yǎng)液中300mg/L，50l加入Boyden培養(yǎng)皿(美國Costor公司)的上室，上室的底部封有8m微孔濾膜，室溫放置1小時，下室加入3T3無血清培養(yǎng)液，內(nèi)皮細(xì)胞與10mol/L的CAI孵育24小時后，重懸于含0.1%牛白蛋白和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(1nmol/L)的無血清M199培養(yǎng)液中，1×103個細(xì)胞加入Boyden上室，37培養(yǎng)12小時后，擦凈上室內(nèi)培養(yǎng)液，小室底膜HE染色，選擇5個高倍鏡視野細(xì)胞計數(shù)。4. 內(nèi)皮細(xì)胞血管構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞重

9、懸于0.1%牛白蛋白、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和50mg/L Marigel的無血清M199培養(yǎng)液中，按1×104個孔接種24孔板，CAI為10mol/L，37培養(yǎng)24小時。5. 角膜血管形成模型在手術(shù)顯微鏡下將LCI D-20腫瘤組織切成0.3mm3的小塊，然后接種于BALB/c-nu/nu裸鼠角膜上的微囊，將CAI與紅霉素軟膏混合，終濃度為100mol/L。2l涂眼，每日2次，微循環(huán)檢測儀觀察。將裸鼠角膜圓周分成鐘表樣12等份，以“小時”為單位計算角膜血管形成扇區(qū)的大小，將角膜緣到中心的距離分成5份，計算新生血管的長度，以及新生血管的條數(shù)。6. 統(tǒng)計學(xué)方法采用方差分析和t檢驗。結(jié)果1

10、. CAI對內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制作用1所示，當(dāng)CAI的濃度在0.6255mol/L時，內(nèi)皮細(xì)胞的生長沒有受到影響，但是當(dāng)超過10mol/L時，內(nèi)皮細(xì)胞的生長速度明顯受到抑制，細(xì)胞由多角形和梭形變成長條形，沒有發(fā)現(xiàn)死亡細(xì)胞。DMSO組和空白對照組細(xì)胞的生長沒有受到影響。         1CAI對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制作用2. CAI對內(nèi)皮細(xì)胞運動和降解基質(zhì)的抑制CAI處理組內(nèi)皮細(xì)胞作變形運動，降解人工基質(zhì)，穿過微孔濾膜的數(shù)目(3.8±2.3)明顯少于對照組(13.8±4.4)，兩組差異有顯著性

11、(P0.05)。穿過微孔濾膜的內(nèi)皮細(xì)胞，CAI組明顯少于對照組，且形態(tài)也有所改變。3. CAI對內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建血管的抑制CAI抑制了內(nèi)皮細(xì)胞在含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和人工基質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中構(gòu)建血管的能力，CAI組形成的血管樣結(jié)構(gòu)較為稀疏和松散，而對照組血管樣結(jié)構(gòu)較為致密和整齊。4. CAI抑制人肝癌誘導(dǎo)的血管形成荷人肝癌LCI D-20裸鼠角膜應(yīng)用CAI軟膏涂眼4天后，腫瘤誘導(dǎo)的血管形成開始少于對照組，用藥第7天時，治療組動物角膜新生血管的數(shù)目(5.7±2.1)條明顯少于對照組(12.3±2.5)條且所形成的新生血管長度(2.7±1.5)亦較對照組(5.3

12、77;0.6)短。討論本研究結(jié)果顯示，當(dāng)CAI的濃度超過10mol/L時，VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到抑制，具有明顯的劑量依賴性，細(xì)胞由多角形或梭形變成細(xì)長形，而且，這種抑制是非細(xì)胞毒作用，沒有發(fā)現(xiàn)死亡細(xì)胞。在Boyden上室中的內(nèi)皮細(xì)胞，由于受到下室中3T3細(xì)胞上清的趨化，必須降解和穿過在濾膜上方的人工基質(zhì)，并且作變形運動穿過直徑8m的微孔，才能到達(dá)濾膜的背面，10mol/L的CAI明顯抑制了內(nèi)皮細(xì)胞降解并穿過基質(zhì)和微孔的能力，從而抑制了血管形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在含有Matrigel的無血清培養(yǎng)基中，VEGF能夠誘導(dǎo) 內(nèi)皮細(xì)胞排列成血管樣結(jié)構(gòu)，形成縱橫交錯的網(wǎng)，當(dāng)加入CAI(10mol/L)后，形成的血管網(wǎng)明顯稀疏，排列亦較為整齊。VEGF誘導(dǎo)的血管形成的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)均受到了CAI不同程度的抑制。本研究結(jié)果表明，CAI能夠通過改變血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲性生物學(xué)特征，抑制人肝癌誘導(dǎo)的血管形成，抗腫瘤血管形成將成為預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新途徑。作者單位：200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所參考文獻(xiàn)1Sun F, T