藤黃微球菌Rpf基因的克隆表達(dá)及純化鑒定

1、藤黃微球菌Rpf基因的克隆表達(dá)及純化鑒定              作者：樊愛琳，師長(zhǎng)宏，蘇明權(quán)，薛瑩，柏銀蘭，馬靜，劉家云，張建芳，程曉東，郝曉柯 【摘要】  目的： 克隆藤黃微球菌Rpf基因,序列測(cè)定正確后進(jìn)行融合表達(dá)純化. 方法： 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，從藤黃微球菌基因組中擴(kuò)增出藤黃微球菌Rpf基因,用限制性內(nèi)切酶消化后插入到pUC19克隆載體中,測(cè)序正確后再亞克隆到融合表達(dá)載體pProEXHT中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5,目的基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo),由T7啟

2、動(dòng)子調(diào)控表達(dá)了氨基端帶6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的Rpf蛋白,在變性條件下對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化. 結(jié)果： 獲得藤黃微球菌Rpf基因,得到融合6個(gè)組氨酸殘基的藤黃微球菌Rpf蛋白,可溶性分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要在包涵體中存在，最后在變性條件下，用Ni2+NTA 親和色譜柱純化目的融合蛋白，純化獲得的融合蛋白純度大于90%，WesternBlot證實(shí)獲得的蛋白為所需要的目的蛋白. 結(jié)論： 構(gòu)建了藤黃微球菌Rpf基因的重組表達(dá)載體,并獲得了高純度的融合表達(dá)蛋白,為以后的深入研究奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】  微球菌，藤黃；分枝桿菌，結(jié)核；克隆，分子；基因表達(dá)；純化   0引言 

3、  結(jié)核病（TB）是現(xiàn)今全世界范圍內(nèi)最重要的致病和致死因素之一. 結(jié)核分枝桿菌的休眠狀態(tài)和生長(zhǎng)緩慢是研究結(jié)核病的主要障礙. Mukamolova等1發(fā)現(xiàn)在Micrococcus Luteus（藤黃色微球菌）中發(fā)現(xiàn)了一種能促進(jìn)細(xì)菌復(fù)蘇生長(zhǎng)的因子并命名為復(fù)活促進(jìn)因子（Resuscitationpromoting factor, Rpf ）. Biketov等2發(fā)現(xiàn)Rpf可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)受損的休眠期的結(jié)核桿菌進(jìn)入活化增殖狀態(tài),且還是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的靶抗原. 通過同源性分析發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌基因組可編碼5 種Rpf樣蛋白3. 我們擬克隆表達(dá)藤黃微球菌Rpf蛋白，進(jìn)一步研究其生物學(xué)和免疫學(xué)特性

4、，以建立臨床結(jié)核分枝桿菌的快速分離培養(yǎng)方法，并評(píng)價(jià)其是否可作為候選結(jié)核亞單位疫苗的組分.   1材料和方法   1.1材料藤黃微球菌標(biāo)準(zhǔn)株為西京醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室保存；Taq DNA聚合酶、dNTPs，T4連接酶、Hind，BamH及DNA電泳膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取純化試劑盒（Promega公司）；E.coli DH5為本室保存，pProEXHT質(zhì)粒為第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心師長(zhǎng)宏博士饋贈(zèng)；金屬鰲合親和層析介質(zhì)（NiNTA）（Qiagen公司）.   12方法   1.2.1引物設(shè)計(jì)登陸GenBank，根據(jù)藤黃微球菌

5、Rpf基因序列(AC: Z96935)設(shè)計(jì)引物.  P1：5CGA GGA TCC ACC ATG GAC ACC ATG ACT CTC TTC AC3含BamH酶切位點(diǎn)p2：5TCA AAGCTT TCA GGC CTG CGG CAG GAC GAG CTC CT3含Hind酶切位點(diǎn)和終止碼. 擴(kuò)增片段為697 bp，由TaKaRa公司合成.   1.2.2藤黃微球菌基因組DNA提取刮取適量藤黃微球菌落，TE(pH 8.0)洗滌后重懸，加SDS至終濃度為10 g/L，蛋白酶K至終濃度0.1 g/L，5560水浴過夜，分別用等體積酚氯仿異戊醇(25241)、氯

6、仿異戊醇(241)各抽提1次，上層水相加2.5倍預(yù)冷的無水乙醇，1/10體積的3 mol/L乙酸鈉后置-20冰浴1 h沉淀DNA，用無水乙醇、700 mL/L乙醇先后洗滌沉淀2次，抽干后溶于適量無菌水中.    1.2.3藤黃微球菌Rpf基因的擴(kuò)增、克隆及測(cè)序以藤黃微球菌基因組為模板，以P1和P2為引物，擴(kuò)增目的基因. PCR反應(yīng)條件：94  60 s， 52  60 s， 72  90 s， 共30個(gè)循環(huán)，再于72延伸7 min. 回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)BamH和Hind消化后，然后用T4連接酶連接入經(jīng)同樣酶消化的pUC19中，轉(zhuǎn)化E.

7、coli  DH5感受態(tài)細(xì)胞. 然后涂布于LB平板（含氨芐青霉素100 mg/L），隨機(jī)篩選4個(gè)菌落，分別接種于5  mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，用Hind和BamH雙酶切，37 過夜，進(jìn)行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000為分子質(zhì)量參照，觀察有無約697 bp大小的片段，將陽(yáng)性克隆命名為pUC19Rpf,然后隨機(jī)挑取3個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序.   1.2.4重組質(zhì)粒表達(dá)提取測(cè)序正確的重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)Hind和BamH雙酶切后，回收目的基因條帶，溶于50 L雙蒸水中. 取目的片段和同樣用Hind和BamH雙酶切的p

8、ProEXHT質(zhì)粒以 31的比例混合，用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5感受態(tài)細(xì)胞. 然后涂布于LB平板（含氨芐青霉素100 mg/L），37培養(yǎng)過夜.  隨機(jī)挑取2個(gè)菌落，分別接種于5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)過夜. 各取1.5 mL提取質(zhì)粒DNA，再以Hind和BamH雙酶切鑒定，挑選陽(yáng)性克隆. 挑取1個(gè)陽(yáng)性克隆接種于5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)18 h，取100 L加到10 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)23 h，以終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)4 h，取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)菌液以及未誘導(dǎo)的菌液離心，回收菌

9、體沉淀. 將誘導(dǎo)前后的樣本重懸到去離子水中，加入2×樣品緩沖液，100沸水浴5 min，12 000 g離心10 min，取10 L 上清進(jìn)行100 g/L SDSPAGE，電泳條件為200 V恒壓. 凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色5 h，脫色液脫色13 h，觀察目的蛋白表達(dá)條帶. 并通過凝膠薄層掃描測(cè)定其表達(dá)量.   125表達(dá)產(chǎn)物鑒定將上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用10 g/L BSA封閉過夜，加6×His mAb作用1 h，以10 mmol/L PBS（pH 7.2）洗滌后，加HRP羊抗鼠IgG作用1 h，以DAB顯色觀察結(jié)果

10、.   1.2.6純化樣品制備將平衡胍裂解液溫至37（pH 7.8），收集250 mL誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)菌，5000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀重懸于10 mL胍裂解液中，室溫緩慢搖動(dòng)510 min，至細(xì)胞完全裂解，冰浴條件下超聲5次，每次10 s，10 000 g離心10   min，上清移至干凈離心管，-20保存?zhèn)溆?   1.2.7融合藤黃微球菌Rpf蛋白在變性條件下純化4采用Invitrogen的Ni2+NTA純化試劑盒純化目的蛋白. 將250 mL的誘導(dǎo)菌液離心，制備上柱樣品，按照變性條件進(jìn)行親和色譜純化，收集洗脫液進(jìn)行1

11、00 g/L SDSPAGE 分析.   1.2.8表達(dá)蛋白的復(fù)性采取逐步降低尿素濃度的方法，除去蛋白溶液中的尿素，使變性的蛋白在此過程中自然復(fù)性，先用含6 mol/L尿素的緩沖液4透析過夜，然后分別用4， 3， 2， 1， 0.5 mol/L尿素的梯度透析各4 h以上，最后用PBS緩沖液再透析4 h以上. 透析結(jié)束后將蛋白溶液在4，12 000 g離心10 min，上清即為可溶的復(fù)性蛋白，將其分裝后凍干備用.   2結(jié)果   2.1藤黃微球菌Rpf基因的擴(kuò)增、克隆及序列分析應(yīng)用上述合成的兩種引物，以藤黃微球菌基因組為模板，擴(kuò)增藤黃微

12、球菌Rpf基因序列，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示見圖1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為697 bp的片段. 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于PUC19中，挑選經(jīng)酶切鑒定正確的克隆見圖2，送上海聯(lián)合基因公司測(cè)序，所得序列結(jié)果與GenBank報(bào)道的完全一致.            2.2藤黃微球菌Rpf基因表達(dá)載體的鑒定將純化的重組質(zhì)粒PUC19Rpf雙酶切后回收，與用相同酶切的pProEXHT質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，隨機(jī)挑選2個(gè)克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定，2個(gè)克隆均切出697 bp的片段，將1號(hào)陽(yáng)性克隆命名為pProEXHT

13、Rpf(圖3).   2.3重組質(zhì)粒的表達(dá)及其產(chǎn)物的鑒定將重組質(zhì)粒pProEXHTRpf接種于LB培養(yǎng)液中，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)，SDSPAGE分析，發(fā)現(xiàn)約在Mr 30 000處有1條蛋白帶，同預(yù)計(jì)的大小相吻合(圖4). 經(jīng)凝膠薄層掃描，測(cè)得重組菌表達(dá)帶的蛋白量約占菌體總蛋白量的23.5%. 對(duì)表達(dá)蛋白的可溶性分析證明，融合表達(dá)產(chǎn)物主要以不可溶的包涵體形式存在. 將表達(dá)蛋白與抗組氨酸的特異性mAb做免疫印跡，發(fā)現(xiàn)在Mr約為30 000處有一條帶，表明此表達(dá)產(chǎn)物含有能與抗組氨酸的特異性mAb相結(jié)合的表位(圖5).   2.4表達(dá)蛋白的親和層析純化Ni2+NTA

14、 親和色譜柱純化蛋白后100 g/L的SDSPAGE證明了這種方法的有效性，經(jīng)薄層掃描分析融合蛋白純度可達(dá)90%以上(圖6).   3討論   Rpf蛋白是一種原核生長(zhǎng)因子，它在細(xì)胞外以1×10-12 g水平通過自分泌和旁分泌形式發(fā)揮促進(jìn)休眠期細(xì)菌復(fù)活的作用,它可以促進(jìn)休眠期結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)5. 由于Rpf的功能類似于真核生物的生長(zhǎng)因子，因此被稱為細(xì)菌的細(xì)胞因子. Vladimir等6的實(shí)驗(yàn)證明藤黃微球菌中的Rpf 蛋白有很強(qiáng)的免疫原性，在免疫C57BL/6小鼠之后，可以誘發(fā)IgG1與IgG2a反應(yīng)，T細(xì)胞增殖，干擾素, IL10, IL12

15、 升高而IL4, IL5不變，而且免疫血清可以抑制結(jié)核分枝桿菌 H37Rv毒株的生長(zhǎng)與增殖. Cole等7認(rèn)為MTB中也存在著Rpf樣基因，可以編碼幾種膜結(jié)合或分泌的Rpf樣蛋白. Mukamolova等8對(duì)MTB全基因序列分析表明，其中Rv0867c（RpfA）, Rv1009（RpfB）, Rv1884c（RpfC）, Rv2389c（RpfD）和Rv2450c（RpfE）五個(gè)基因與藤黃微球菌Rpf基因同源.   我們以藤黃微球菌基因組為模板,克隆了藤黃微球菌Rpf基因,構(gòu)建了融合表達(dá)載體pProEXHTRpf,并融合表達(dá)了氨基端帶有6個(gè)組氨酸殘基的Rpf蛋白，該蛋白以

16、包涵體的形式存在，在變性條件下利用金屬鰲合親和層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化，并利用緩慢透析的方法使大部分目的蛋白得到了復(fù)性，得到了純度在90以上的目的蛋白，將表達(dá)的蛋白與抗組氨酸的特異性mAb做Western Blot，發(fā)現(xiàn)在Mr約為30 000處表達(dá)有一條帶，表明此表達(dá)產(chǎn)物含有能與抗組氨酸的特異性mAb相結(jié)合的表位，也間接證實(shí)了表達(dá)的蛋白為需要的目的蛋白. 利用得到的目的蛋白，研究其生物學(xué)特性，進(jìn)一步探究包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的富含GC的革蘭陽(yáng)性菌所表達(dá)的Rpf家族蛋白的功能，以便建立結(jié)核分枝桿菌快速、敏感的分離培養(yǎng)方法. 同時(shí)將深入探討Rpf蛋白的免疫學(xué)特性,探究其是否可以做為預(yù)防和治療結(jié)核分枝

17、桿菌感染的疫苗組分. 【參考文獻(xiàn)】  1 Mukamolova GV, Obolbek AT, Konstantir K, et al. The rpf gene of micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factorJ. Molecular Microbiology, 2002,46(3):611-621.2 Biketov S, Mukamolova GV, Potapov V, et al. Culturability of Mycobacterium tuberculosis cells i

18、solated from murine macrophages: A bacterial growth factor promotes recoveryJ. FEMS Immunol Med Microbiol, 2000,29(4):233-240.3 Mukamolova GV,Murzin AG, Salina EG, et al. Muralytic activity of micococcus luteus Rpf and relationship to physiological activity in promoting bacterial growth and resuscitationJ. MolMicrobiol, 2006,59(1):84-89.4 薛瑩，姜泓，高雪，等. 結(jié)核分枝桿菌Rv2450基因的克隆、表達(dá)及純化J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,25(19):1778-1781.5 Muka