農(nóng)桿菌介導的ZmHSD1基因轉(zhuǎn)化玉米自交系

1、農(nóng)桿菌介導的ZmHSD基因轉(zhuǎn)化玉米自交系糖皮質(zhì)激素是一類動物激素， 參與糖、 脂肪和蛋白質(zhì)的生物 合成和代謝等過程，還具有抗炎的作用1。11B -羥基類固醇脫 氫酶(11 B -hydroxysteroid dehydrogenase , 11 B -HSD)是調(diào) 節(jié)糖皮質(zhì)激素的關鍵酶， 它促進活性糖皮質(zhì)激素與非活性激素之 間的相互轉(zhuǎn)換 2，3。雖然目前在植物中還沒有鑒定出 11B -HSD， 但是隨著擬南芥基因組測序工作的完成，發(fā)現(xiàn)了八個類似HSD的基因。最先鑒定出的是一種油菜籽 HSD它在利用ABA類似物抑 制種子萌發(fā)的過程中過量表達 4 ；Jolivet 等5 證實在芝麻和 油料作物中只

2、存在微量的 HSD這些HSD編碼的蛋白表現(xiàn)出與 NADP所依賴的11 B -HSD 17 B -HSD/17 B -類固醇脫氫酶相同的 性能。AtHSD1基因包括6個外顯子和5個內(nèi)含子，它編碼的 蛋白由389個氨基酸組成，李鳳玲等7將AtHSD1的cDNA連接 到35S啟動子后整合到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株明顯比野生株 粗壯，其分支和長角果的數(shù)量也明顯增多，轉(zhuǎn)AtHSD1基因植株的表型與過量產(chǎn)生BR或過量表達BR受體基因BRI1的表型一致 810;同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性比野生植株高 7。因此， 該基因在改善農(nóng)作物植株生長、提高產(chǎn)量方面有很大的潛力。本研究利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，嘗試將

3、 ZmHSD基 因轉(zhuǎn)入玉米自交系品種， 以期獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株， 拓寬玉米種 質(zhì)的遺傳背景，為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)玉米品種的選育服務。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 植物材料玉米( Zea maysL. )自交系 18-599 、齊 319 和昌 7-2 。1.1.2目的基因、載體、菌株 ZmHSD表達載體由山東農(nóng)業(yè) 大學生命科學學院基因工程實驗室構建。 表達載體中， 目的基因 為ZmHSD,其啟動子為Ubi ;篩選標記基因為 NPTI，其啟動子 為CaMV35(圖1)。本研究所用質(zhì)粒為 PZP211,大腸桿菌菌株 為DH5況，農(nóng)桿菌菌株為 LBA44041.2 試驗方法1.2.1培養(yǎng)基在N6改

4、良培養(yǎng)基11的基礎上，添加 0.25mg/L Na2MnO3 0.025 mg/L CuSO4 5H2O 和 0.025 mg/LCoCl2 6H2O1.2.2 幼胚愈傷組織受體系統(tǒng)參照孫慶泉等 11 的方法，取 幼胚接種于誘導培養(yǎng)基上，2425 C暗培養(yǎng)，繼代，選擇誘口型 愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體。1.2.3 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與活化：將低溫保存的農(nóng)桿菌菌種LBA4404接種到添加25 mg/L Spe的YEB固體培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落 接種于含 25 mg/L Spe 的 YEB 液體培養(yǎng)基中，置于搖床上預活 化(28C, 200 r/min )，取預活化的菌液培養(yǎng)至對數(shù)生長期

5、備 用。 愈傷組織浸染： 浸染前將新培養(yǎng)的菌液離心沉淀菌體， 用 液體N6培養(yǎng)基重懸，并稀釋到所需0D值。將型愈傷組織分離 成米粒大小的小塊， 投放到稀釋好的菌液中浸染。 用滅菌的濾紙 吸干愈傷表面的菌液， 并將其擺放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng) 3 d， 用頭孢水洗菌。將洗好的愈傷放到恢復培養(yǎng)基上恢復培養(yǎng)。 抗性愈傷的篩選、 分化和再生： 恢復培養(yǎng)后的愈傷組織依 次轉(zhuǎn)移到 1次、2次、3 次篩選培養(yǎng)基上，進行抗性篩選，篩選 劑為巴龍霉素。將篩選后存活的愈傷轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上分化成 苗。分化苗苗高45 cm時轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上。當苗適度生 根后轉(zhuǎn)到基質(zhì)（基質(zhì)：蛭石=1 ： 1）中。成活植株轉(zhuǎn)到大田隔

6、離 區(qū)。1.2.4轉(zhuǎn)基因植株的PCR僉測CTAB法提取基因組DNA對轉(zhuǎn) 化植株、陽性對照（質(zhì)粒）和陰性對照（未轉(zhuǎn)化植株）進行 PCR 檢測，檢測對象為目的基因 ZmHSD和標記基因NPTI。根據(jù)已 知的ZmHSD基因序列，利用primer premier 5.0軟件設計ZmHSDI 的引物，上游引物在啟動子內(nèi)部，下游引物在編碼區(qū)內(nèi)，S：CACGATTCTTCCTCGGCTC， CTAC：T TGCTACTCCTTCCTTTCCTG；GCT 標記基因 NPTI 的弓I物為 S: GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG AGCTCTTCAGCAATATCACGGG引物由上海生工生物工

7、程公司合 成。用25卩l(xiāng) PCF反應體系。擴增反應程序：94C預變性5 min;94C變性1 min , 59C退火50 s , 72C延伸50 s , 35個循環(huán)； 72C終延伸10 min ; 4C保存。1%瓊脂糖凝膠、1%TBEt泳緩沖液電泳，溴化乙錠染色，紫外分析，拍照。2 結果與分析2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得將玉米幼胚（授粉后1015 d ）接種于誘導培養(yǎng)基上，誘 導出胚性愈傷組織（圖 2-1 ，2-2 ，2-3 ）；將經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后的 愈傷（圖 2-4 ），恢復培養(yǎng) 1 周，愈傷組織生長狀態(tài)有所改善， 轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基篩選， 1 輪后有些愈傷開始變褐， 3 輪后大部分 未轉(zhuǎn)化愈傷褐化死

8、亡， 愈傷組織上出現(xiàn)的小塊鮮活愈傷組織突起 基本上為抗性愈傷，抗性愈傷在篩選培養(yǎng)基上生長正常（圖2-5 ） ；將經(jīng)過 3輪篩選的愈傷轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，25 d后愈傷表面開始出現(xiàn)綠色芽點， 之后綠色芽點逐漸分化成巴龍抗 性苗（圖 2-6 ）；將幼苗轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上（圖 2-7），使 苗生根，期間有少量白化苗出現(xiàn)； 待苗長出 2 3條根、高約 10 15 cm時，打開封口膜，煉苗 5 d后移栽花盆 （圖2-8） ; 3周 后移栽轉(zhuǎn)基因隔離區(qū)，開花期進行人工自交結實（圖 2-9 ）；最 終獲得轉(zhuǎn)基因種子（圖 2-10 ）。2.2 轉(zhuǎn)基因植株分子檢測221目的基因ZmHSD的PCR檢測利用

9、ZmHSDl物對抗性 苗基因組DNA進行PCR檢測，有33株抗性苗出現(xiàn)與陽性對照一 致的 444 bp 的特異性擴增條帶（圖 3），表明該 33株轉(zhuǎn)基因植 株已將外源基因整合到基因組中。2.2.2標記基因NPTH的PCR檢測對已知陽性轉(zhuǎn)基因植株的 基因組DNA進行標記基因NPT 的PCR擴增，均得到與陽性對 照一致的 650 bp 的特異性擴增條帶（圖 4），表明目的基因 PCR 檢測的陽性株也全為標記基因陽性株。 對標記基因的檢測可以排 除玉米基因組中ZmHSD基因的干擾。3 結論3個供試玉米自交系 18-599 、齊 319和昌 7-2 的幼胚都能誘 導產(chǎn)生H型愈傷組織，其中18-599所獲愈傷組織質(zhì)量好、數(shù)量 多，適于大量轉(zhuǎn)化；齊 319 和昌 7-2 愈傷顆粒松散、質(zhì)量不高， 尤其是昌 7-2 ，胚性愈傷數(shù)量較少。經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化共得到899株轉(zhuǎn)化株，通過PCR僉測初步證明 有 33株為陽性轉(zhuǎn)化植株， 其中