整理單克隆抗體技術(shù)

1、第十章單克隆抗體技術(shù)(Monoclonal antibody technique )原理B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下,能夠分化、增殖形成具有針對(duì)這種抗原分泌特異 性抗體的水平.B細(xì)胞的這種水平和量是有限的,不可能持續(xù)分化增殖下去,因此 產(chǎn)生免疫球蛋白的水平也是極其微小的.將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞,再進(jìn)一步克隆化,這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無(wú)限 生長(zhǎng)的水平,又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的水平,將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、單一的特異性抗體.這種技 術(shù)即稱(chēng)為單克隆抗體技術(shù).制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或

2、胸腺嘧啶核苷酸酶 的瘤細(xì)胞變異株與脾臟的B細(xì)胞融合.采用 HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加次黃嘌呤HyPoxanthine H,氨基喋呤 Aminoopterin A 及胸腺嘧啶核苷 Thymidine T ,在 這種選擇性培養(yǎng)基中,由于變異的瘤細(xì)胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧 啶核苷激酶,所以不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA.而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA,這一途徑又被氨基喋呤所阻斷,所以未融合的瘤細(xì)胞不可預(yù)防也要死亡.融合的雜交瘤細(xì)胞由于脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤 磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶,可以通過(guò)次黃嘌呤合成DNA,克服氨基喋呤的阻斷,因此雜交瘤細(xì)胞大量繁殖而被篩選

3、出來(lái).B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)基中不能長(zhǎng)期生長(zhǎng),一般于二周內(nèi)均死亡.單克隆抗體與常規(guī)抗體相比有如下優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)我惶禺愋?與一個(gè)抗原決定簇反 應(yīng)； 可重復(fù)性,能夠提供完全一樣的抗體制劑；一經(jīng)制出,可無(wú)限量地供給； 生產(chǎn)單克隆抗體,不一定需要純的抗原；能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查 不出的少量成分.單克隆抗體與常規(guī)的血清抗體的性質(zhì)比擬,見(jiàn)表10-1.表10-1 單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比擬性 質(zhì)常規(guī)血清抗體單克隆抗體抗體含量少卩g/ml多 mg/ml無(wú)關(guān)的Ig多少或幾乎無(wú)其它血清蛋白有少,培養(yǎng)物上清常有10%胎牛血清Ag-Ab結(jié)合免疫原的全部成分的全部免疫原中的一種成分的抗原決定簇一個(gè)抗原決定簇特異

4、性親和力的重復(fù)性與其它抗原的交叉反響不同批號(hào)間有變化無(wú)變化& ft r"力+ 人 K r 丨-4-Uv-l-t與帶有共同抗原決疋族的般無(wú).結(jié)到共同決定抗原有局部交叉簇那么是完全的免疫球蛋白的種類(lèi)與亞類(lèi)完全是混合的只是一種或幾種免疫球蛋白的物理性質(zhì)典型光譜抗體的單一性質(zhì)二、動(dòng)物的選擇與免疫一動(dòng)物的選擇目前應(yīng)用最廣的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠為好.就品系而言以Balb/c小白鼠應(yīng)用最廣,由于所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導(dǎo)出來(lái).Balb/c系小白鼠必須用純系的,雌雄均可,以 812周齡為宜.大白鼠也可,能產(chǎn)生較多量的單克隆抗體.現(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的根底上, 開(kāi)

5、展了小鼠-大鼠,小鼠-人以及人-人雜交瘤技術(shù).二免疫一般而言,抗原的純度不很重要,特別是免疫原性較強(qiáng)的抗原.免疫程序、劑量和方法是關(guān)系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關(guān)鍵之一.正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞,一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0X 1075.0X 107種不同的抗體.因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓 瘤融合,只能有千萬(wàn)分之一的時(shí)機(jī)獲得某一種特定抗體.所以為了提升得到某種雜 交瘤的時(shí)機(jī),必須增強(qiáng)免疫,使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加.B淋巴細(xì)胞的不同發(fā)育階段對(duì)獲得陽(yáng)性雜交瘤也有很大影響.有人認(rèn)為處在轉(zhuǎn) 化時(shí)期的B淋巴細(xì)胞可能更易于融合,而免疫以后78天,雖然是

6、抗體產(chǎn)生的頂峰時(shí)期,但形成有活力的雜交瘤細(xì)胞的可能反而減少.故一般認(rèn)為增強(qiáng)免疫后的第三 天應(yīng)殺鼠取脾做細(xì)胞融合.1. 可溶性抗原蛋白質(zhì)以1mg/ml5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化,分多點(diǎn)小鼠皮下注射,總量為 0.3ml0.6ml,間隔35周再同樣注射一次,10天后,斷尾取血一滴,測(cè)抗體效價(jià),選滴度高的小鼠做融合試驗(yàn).一個(gè)月 后可以經(jīng)靜脈(尾靜脈)給予無(wú)佐劑抗原0.2ml0.4ml ,34天后,殺死小鼠取脾做融合用.2 顆粒性抗原如抗原來(lái)源方便,可以不加佐劑而增加免疫次數(shù),縮短間隔時(shí)間.例如用羊紅血球免疫小白鼠,以1%濃度每只皮下注射0 .2 ml,每周2次,共免疫58次,取脾前3天

7、,再免疫一次即可.有人認(rèn)為最后一次免疫劑量要大,大到 近于免疫耐受的程度更好.三、細(xì)胞的選擇(一) 脾細(xì)胞1材料(1) 免疫過(guò)的血清抗體滴度高的 Balb/c 鼠.(2) 1640 培養(yǎng)液(3) 2.5% FCS1640 營(yíng)養(yǎng)液2操作方法(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠.(2) 將小鼠放于 70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在無(wú)菌條件下取脾.(3) 把脾放入5ml含有2.5% FCS的1640液中,冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球.(4) 用鑷子輕輕擠壓脾,做成脾細(xì)胞懸液,用毛細(xì)管將懸液移入小試管中.(5) 直立小試管3min,使大塊的結(jié)締組織下沉,把細(xì)胞懸液移入離心管中.(6) 以 2.5%F

8、CS1640 充滿(mǎn)離心管,并以 400g 離心 7min10min (與此同時(shí) 應(yīng)開(kāi)始制備骨髓細(xì)胞).(7) 把沉淀用約 10ml 的新鮮培養(yǎng)液再懸浮.(8) 重復(fù)、步驟.(9) 計(jì)算細(xì)胞, 以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查, 活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于 80%為合格.(二) 骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白,這樣的瘤細(xì)胞融合后,可能影響 或降低所分泌抗體的滴度, 所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞.選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件： 該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系, 以便兩者的組織相容性抗原一致；骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài),不產(chǎn)生丫球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)

9、較高的細(xì)胞密度,最好106個(gè)細(xì)胞/ml ;生長(zhǎng)速度快,繁殖時(shí)間短.目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：S194/5XXO BU 1 ,SP2/ 0Ag14 (簡(jiǎn)稱(chēng) SP2): P2 X ？ Ag8 6 5 3 (簡(jiǎn)稱(chēng) 653 ); FO以653最為常用,它是由礦物油 4甲基15烷(Pristane,降植烷)誘發(fā)出來(lái) 的一種漿細(xì)胞瘤( Minerol Oil plasmacy toma , MOPC )并經(jīng)過(guò)培育形成一株 8-氮鳥(niǎo) 嘌呤有反抗力的亞系.骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入,保存于-195 C液氮罐中,試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可.由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài),很容易脫落,因此

10、不需要胰酶處理.為了預(yù)防出現(xiàn)返祖現(xiàn)象,在融合前,可將培養(yǎng)基內(nèi)參加 15卩g/ml 8 氮鳥(niǎo)嘌呤.取約1 x 107 6X 107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(即培養(yǎng) 15h20h)的骨髓瘤細(xì)胞,在室溫離心(400g) 10min , 沉淀以2.5% FCS1640液再懸浮并計(jì)數(shù).(三) 飼養(yǎng)細(xì)胞 在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中,單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖,必須參加其 它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖,參加的細(xì)胞稱(chēng)之為飼養(yǎng)細(xì)胞(Feeder cell).在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中,就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的根底上使其生長(zhǎng)繁殖成群 體,因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞. 許多種類(lèi)的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞, 如正常的脾細(xì)

11、胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等,常選用腹腔滲出細(xì)胞,其中主要是 巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞.應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞,另一方面 巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片,為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境.腹 腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠.也可以是其他種類(lèi)的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等.1 材料(1) 小鼠(Balb/c或C57小白鼠)假設(shè)干只.(2) 11.6%蔗糖溶液(經(jīng) 10磅30min高壓滅菌).2操作方法( 1)拉頸處死小鼠.(2) 70 %酒精浸泡消毒 10min.( 3)用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開(kāi)一小口,剝開(kāi)皮膚,露出腹腔.(4) 用注射器將 4ml 11.6%蔗糖溶液注入

12、腹腔,用手指輕揉 1min 仍用該注射 器回抽腹腔液體,參加離心管.(5) 1 000rmin 離心 10min.( 6)取上清,以 HAT 選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液.臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞, 使每毫升含 40 萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞.7以 1ml 吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿,每孔0.05ml ,含 2 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng),即可供細(xì)胞融合和克隆化之用.如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼 養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少,那么可以在細(xì)胞換液時(shí)再參加一些.四、細(xì)胞融合一融合劑 細(xì)胞融合的方法有物理法,如電融合、激光融合,化學(xué)融合法和生物融合法, 如仙臺(tái)病毒,此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融合法.聚乙二醇PEG,在分子量

13、為200700時(shí),呈無(wú)色、無(wú)臭的粘稠狀液體,分 子量大于 1 000 時(shí),呈乳白色蠟狀固體,能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑,對(duì) 熱穩(wěn)定,與許多化學(xué)藥品不起作用.用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為 4 000者,常用濃度為 50, pH8.0pH8.2 用 10 NaHCO 3調(diào)整 ,分子量小的 PEG,融合效應(yīng)差,又有毒性,分子量過(guò)大,那么粘性太大,不易操作.50%濃度,pH 偏堿時(shí)融合效應(yīng)最高.也有采用30%50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜.不同批號(hào)的PEG,即使分子量相同,但融合率卻有明顯差異,選用時(shí)必須注意.每批都必須進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)前方可應(yīng)用.要買(mǎi)高純度的,一般選供氣相色譜

14、用的PEG.二融合過(guò)程融合的方法很多,常用的有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法.融合時(shí)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例為 1:1至10:1不等. 3:1或5:1最為常用.1 試劑與材料1供融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞.21640 培養(yǎng)液 100ml.3完全 1640 液 100ml. 2.5 % FCS 1640 液 50ml.5HAT 培養(yǎng)液 100ml.650 % PEG :取分子量 4 000,高純度的日本進(jìn)口或 Serva PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌,使用前用預(yù)熱于40C的1640液10ml等量W/V 混合,以酚紅檢查pH,一般不必調(diào)pH.如pH有改變,可用 HCI或NaHCOs調(diào)整.710ml 和 5

15、0ml 的滅菌沉淀管或瓶.(8) 40 孔塑料培養(yǎng)盤(pán).2操作方法 準(zhǔn)備好脾細(xì)胞. 在 50ml 沉淀管中混合 108 脾細(xì)胞和 107 小鼠骨髓瘤細(xì)胞,并參加 50ml 2.5 FCS1640 液. 室溫 400g 離心 3min ,使細(xì)胞沉淀. 移去上清液. 輕敲管底部,使沉淀流動(dòng),把沉淀管放于40 C水浴中,使其達(dá)融合溫度.加預(yù)熱至40C的50% PEG 0.8ml,用1ml吸管緩慢滴加,邊加邊搖沉淀管,肉眼觀察可見(jiàn)有顆粒出現(xiàn),滴加過(guò)程要求持續(xù) 2min . 加 1ml1640 液,邊加邊搖動(dòng),持續(xù) 1min.重復(fù)一次. 加1ml 1640液,邊加邊搖動(dòng),持續(xù) 0.5min. 重復(fù)一次.(

16、11) 加 1640 液 15ml.(12) 室溫,400g離心1min,使細(xì)胞沉淀.(13) 去上清,輕敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液.往已于前一日種有飼養(yǎng)細(xì)胞的40孔塑料培養(yǎng)盤(pán)中滴加融合的細(xì)胞液,每孔1 滴(約 0.05ml).(15) 輕搖后,放入5% CO2飽和濕度的37C溫箱中培育.(16) 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液.注意輕輕吸取上清液, 勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出,根據(jù)需要參加適量的飼養(yǎng)細(xì)胞.(17) 于第12、15日參加含有HAT的完全1640培養(yǎng)液.在每次換液前用倒置顯 微鏡觀察, 大約在 10天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)出來(lái). 大多

17、數(shù)雜交瘤細(xì)胞在 1020 天內(nèi)出現(xiàn),但也有在 1 個(gè)月左右才能出現(xiàn)的.雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后,吸取上清 液,檢查抗體.(18) 對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代.在傳代過(guò)程中,依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS 1640液.同時(shí)保存于液氮和進(jìn)行克隆化, 在這 期間每代都要檢查抗體,以預(yù)防產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和喪失.(三) 細(xì)胞融合的關(guān)鍵1 技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗. 例如,供者淋巴細(xì)胞沒(méi)有查到免疫應(yīng)答. 這必然要失敗的.2. 融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染,融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境,以及適宜的無(wú)菌操作技術(shù).五、抗體檢測(cè)及雜交瘤細(xì)胞的選擇(一) 抗體檢測(cè) 用檢測(cè)抗體的

18、方法從雜交細(xì)胞中篩選出生產(chǎn)指定抗體的雜交株是很重要的.檢 測(cè)抗體的方法很多,從沉淀反響到放射免疫測(cè)定.由于細(xì)胞培養(yǎng)液中的抗體濃度通 常是很低的,而且傳統(tǒng)的檢測(cè)方法多是以多價(jià)抗原與多克隆抗血清相反響.雜交瘤 產(chǎn)生的抗體那么是單克隆的,所以并不是每項(xiàng)方法都能適用.一定要選擇敏感的、快 速的、一次又能檢測(cè)多份樣品的方法.常用的檢測(cè)方法如下：1. 試管溶血反響檢測(cè)法(1) 材料：雜交瘤細(xì)胞,換液后至少兩天才收取培養(yǎng)液；綿羊紅血球,洗滌三次后,配成1 %懸液；豚鼠補(bǔ)體,無(wú)菌采取補(bǔ)體,以 pH7.2PBS稀釋成20% 溶液,分裝小瓶,于-40C保存.使用時(shí)以補(bǔ)體和壓積紅血球 5:1 (V/V )的量進(jìn)行

19、吸收,4 C 30min ,然后2 OOOr/min離心10min ,去紅血球,取上清液備用；0.01Mol/L pH7.2PBS 液.(2) 操作方法：在小試管中,參加0.1ml雜交瘤細(xì)胞用過(guò)的培養(yǎng)液,再參加 0.1ml pH7.2的PBS液,然后倍比稀釋至一定的稀釋度；參加 0.1ml補(bǔ)體和1%綿 羊紅血球0.1ml,混勻后置37C水浴1h；觀察結(jié)果,以綿羊紅血球完全溶解的雜 交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的最高稀釋倍數(shù)為抗體的溶血效價(jià).2. 斑點(diǎn)檢測(cè)法抗紅血球外表的單克隆抗體與澆灌在瓊脂板的紅血球結(jié)合, 進(jìn)而結(jié)合補(bǔ)體,而發(fā)生溶血斑點(diǎn),對(duì)著光源用肉眼即可判定.(1) 材料：綿羊紅血球,處理同試管法,最后配

20、成25%紅血球懸液；新 鮮豚鼠血清(同試管法處理)；瓊脂糖,配成0.6% PBS液,水浴中溶化；0.01MOI/L PH7.2PBS液；兔抗羊紅血球抗體.(2) 操作方法：將溶化的0.6%瓊脂糖倒入一試管中,置45C48 C水浴中；加0.1ml 25 %紅血球懸液,0.1ml豚鼠補(bǔ)體,迅速混勻,傾注一干凈載玻片上； 凝固后,在凝膠外表固定區(qū)域滴加2ml待測(cè)樣品,標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和對(duì)照試液；待溶液全部滲入凝膠后,置濕盤(pán)；37 C溫育1h2h,觀察并判定結(jié)果.強(qiáng)陽(yáng)性( +)中等陽(yáng)性( +)弱陽(yáng)性(+)陰性(-)必要時(shí)可置室溫過(guò)夜,再判定一次.3. 膜熒光檢測(cè)法(1) 材料：培養(yǎng)液HEM或RPMI -

21、1640;熒光試劑：異硫氰酸熒光素(FITC) 標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白； 50%甘油緩沖液：1份甘油加1份體積0.05MOI/L pH 7.2 PBS液混合即成；熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸管等.(2) 操作方法：用培養(yǎng)液洗滌二次細(xì)胞,懸浮成 2.0 X 107/ml :50 pl細(xì)胞懸液加50 p l培養(yǎng)上清液混合,置 4 C 30min,用培養(yǎng)液洗滌3次,1 000r/min離心； 以50/FITC 抗小鼠免疫球蛋白重新懸浮壓積細(xì)胞,水浴30min60min ;用冷培養(yǎng)液洗3次細(xì)胞,重新懸浮；取一滴細(xì)胞懸液滴在玻片上,復(fù)蓋片,用甘油緩 沖液封固,置熒光顯微鏡下觀察.著色細(xì)胞也可以在固定后

22、觀察,一滴細(xì)胞懸液,涂片、風(fēng)干,用95%酒精固定10min,固定后的載玻片用 PBS洗滌,蓋上蓋玻片, 進(jìn)行觀察.4免疫球蛋白和亞類(lèi)球蛋白的檢測(cè)以瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)法進(jìn)行, 此法簡(jiǎn)單易操作,特異性好.注意必須將培養(yǎng)液濃縮1050倍,否那么做雙向瓊擴(kuò)不出現(xiàn)沉淀線.其檢測(cè)方法為：(1) 制備各種兔抗小鼠IgGz、lgM12、IgA 12和K、入抗血清,也可直接購(gòu)置.( 2)取 5ml 培養(yǎng)物的上清液緩慢參加 0.5ml 的飽和硫酸銨溶液,混勻,靜置 3h,離心沉淀,去上清,沉淀加 0.05ml蒸餾水溶解.(3) 制成1%瓊脂糖凝膠板,打孔.中間孔加20卩l(xiāng)濃縮上清液,周?chē)准?0認(rèn) 特異性抗血清,以

23、10p l 正常小鼠血清作對(duì)照.也可以采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)以及放射免疫等方法檢測(cè).(二) 雜交瘤細(xì)胞的選擇經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)1014天,未經(jīng)融合的骨髓瘤細(xì)胞相繼死去,而雜交 瘤細(xì)胞即可逐漸長(zhǎng)成細(xì)胞集落.停用 HAT 液后,改用 HT 培養(yǎng)基.當(dāng)細(xì)胞集落面積 超過(guò)培養(yǎng)孔的 1/10以上時(shí),即可用敏感的免疫學(xué)方法檢測(cè)出陽(yáng)性孔.連續(xù)三次檢 測(cè)逐漸升高或維持在同一水平者,那么可以做克隆化,一局部那么冷藏起來(lái)做長(zhǎng)期保種 用.六、克隆化經(jīng)過(guò)抗體測(cè)定的陽(yáng)性孔,可以擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行克隆,以得到單個(gè)細(xì)胞的后代分 泌單克隆抗體.克隆的時(shí)間一般說(shuō)來(lái)越早越好.由于在這個(gè)時(shí)期各種雜交瘤細(xì)胞同 時(shí)旺盛生長(zhǎng)

24、, 互相爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)和空間, 而產(chǎn)生指定抗體的細(xì)胞有被淹沒(méi)和淘汰的可能. 但克隆時(shí)間也不宜太早,太早細(xì)胞性狀不穩(wěn)定,數(shù)量少也易喪失.克隆化的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)過(guò)一段時(shí)期培養(yǎng)之后,也還會(huì)由于細(xì)胞突變或特定染色體的喪失,使局部細(xì)胞喪失產(chǎn)生抗體的水平,所以需要再次或?qū)掖慰寺』?養(yǎng).克隆化次數(shù)的多少由分泌水平強(qiáng)弱和抗原的免疫性強(qiáng)弱而決定.一般說(shuō),免疫 性強(qiáng)的抗原克隆次數(shù)可少一些,但至少要35次克隆才能穩(wěn)定.克隆化的方法很多,包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活 別離法等.(一) 有限稀釋法1材料( 1)微量培養(yǎng)盤(pán),盤(pán)內(nèi)各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細(xì)胞(即飼養(yǎng)細(xì)胞) 每孔 2 萬(wàn) 4 萬(wàn).

25、( 2) HT 培養(yǎng)基2操作方法( 1)取出抗體陽(yáng)性孔細(xì)胞,用 HT 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液.并取樣進(jìn)行臺(tái)盼蘭染 色,計(jì)數(shù).(2) 用HT培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成 200個(gè)/ml、40個(gè)/ml、20個(gè)/ml和的懸液.(3) 用吸管將細(xì)胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤(pán),每孔0.05ml,細(xì)胞含量分別為 10個(gè)/孔、 2個(gè)/孔、 1個(gè)/孔和 0.5個(gè)/孔.(4) 5%CO2飽和濕度,37C培養(yǎng).( 5)每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長(zhǎng)情況,選擇只有一個(gè)集落生長(zhǎng)的孔, 棄掉兩個(gè)以上和沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)的孔.( 6)克隆大量繁殖后,布滿(mǎn)孔底的1/3 1/2 時(shí),測(cè)培養(yǎng)液抗體.(7)抗體陽(yáng)性孔細(xì)胞,移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中,并傳

26、24代就可以脫離飼養(yǎng)細(xì)胞,建成克隆株.(二) 軟瓊脂克隆化 借助撒在軟瓊脂上單個(gè)細(xì)胞定位生長(zhǎng),而到達(dá)克隆化,具體操作如下：1. 配2.5%的瓊脂糖30ml,水浴溶化后,移入 45C水浴中.2. 將117ml完全DMEM 液和3ml 10倍濃度的DMEM 液混合,置45C水浴預(yù) 熱.3. 將瓊脂糖與 DMEM 液混合, 即為含 0.5%瓊脂糖的完全 DMEM 液, 并加 75 X 108脾細(xì)胞.4. 每塊平皿加10ml,于室溫中凝固.5. DMEM中的細(xì)胞與DMEM 瓊脂1:1混合,將細(xì)胞瓊脂混合物 2ml鋪于凝 固的平板上,使其全部覆蓋.6. 放入CO2箱飽和濕度,37 C培養(yǎng)10天.7. 用

27、PBS配制0.6%瓊脂糖,于沸水浴溶解后,置45C,在保溫情況下取一試管,迅速參加 0.1ml 25羊紅血球, 0.2ml 豚鼠補(bǔ)體, 2.7ml 0.6 瓊脂糖.8. 用3ml瓊脂糖一羊紅血球混合液覆蓋克隆.于37 C CO2箱孵育1h2h.從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍,可篩選抗羊紅血球Ig .三顯微鏡操作法在直徑6cm培養(yǎng)皿中,參加1ml 1.0 x 108細(xì)胞懸液放置5 % CO?飽和濕度,37 C溫箱中放置30min以上,倒置顯微鏡下,尋找那些與周?chē)嗑嗌踹h(yuǎn)的單個(gè)細(xì)胞, 將毛細(xì)管口一頭有直角彎頭毛細(xì)管,一頭連接一尺長(zhǎng)乳膠管,用口限制液體進(jìn)入 水平置放于液面上,左右微動(dòng),直到看見(jiàn)管口

28、,對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞,吸入毛細(xì)管,將管中細(xì) 胞移到預(yù)先加有2.0X 1045.0X 104飼養(yǎng)細(xì)胞96孔板內(nèi),培養(yǎng)后,即可獲得單個(gè)細(xì)胞 形成的克隆.四熒光激活別離法用一種熒光激活細(xì)胞分類(lèi)器 Fluorescein Activafed Cell Sorter , FACS .其基 本原理是：將細(xì)胞經(jīng)熒光抗體染色后,經(jīng)噴嘴形成單個(gè)細(xì)胞的線形液滴,在萊塞光 激發(fā)下,熒光素發(fā)射熒光,此信號(hào)由光電倍增管接收,再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)大小產(chǎn)生光 散射信號(hào),經(jīng)電腦處理,產(chǎn)生信號(hào)并與預(yù)定的信號(hào)比照,根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度及細(xì)胞 大小不同,將細(xì)胞分成不同級(jí)別,在電場(chǎng)中發(fā)生偏離,而分別收集于不同容器中.七、單克隆抗體的制備一雜交瘤細(xì)胞的大

29、量繁殖 克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng),收集上清液而獲得大量的單一的克隆 化抗體.不過(guò)體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限,其不能超過(guò)特定的細(xì)胞濃度,且 每天要換培養(yǎng)液.而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制.雜交瘤細(xì)胞具有從親 代淋巴細(xì)胞得來(lái)的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性.如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排 斥雜交瘤的小鼠無(wú)胸腺的裸鼠,雜交瘤細(xì)胞就開(kāi)始無(wú)限地繁殖,直至宿主死亡. 產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體,這種 抗體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的 1001 000倍.利用免疫抑制劑,如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血清等,可以加速和促進(jìn) 腫瘤的生長(zhǎng).1 .材料 1

30、經(jīng)高壓滅菌的降植烷.2Balb/c 鼠：58周齡.3雜交瘤細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞.(4) RPMI 1640 培養(yǎng)液(5) 新生牛血清2操作方法(1) 于小鼠腹腔注射 0.5ml降植烷,注射后19周內(nèi)種植細(xì)胞.(2) 收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞,用5%FCS1640液洗滌一次,1 000r/min離心 10min .(3) 取樣,用臺(tái)盼蘭染色,計(jì)活細(xì)胞數(shù),重新用5% FCS1640液配成1.0X 107細(xì)胞 /ml 的懸液. 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞,每只腹腔注射1ml (含1.0X 107個(gè)細(xì)胞 /ml ).(5) 接種后 10天左右時(shí)間腫瘤體積最大,此時(shí)可由腹腔抽取腹水,每隔

31、 13天 取 1 次,可取 10次.血清可由腋下動(dòng)脈或心臟采血后別離.(二)單克隆抗體的提純1 材料(1) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 緩沖液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 緩沖液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 緩沖液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 緩沖液(5) 飽和硫酸銨液(6) DEAE 纖維素柱 2操作方法5(1) 小鼠腹水用冷 PBS液稀釋4倍后,于1.00 X 10轉(zhuǎn)離心30min,去沉淀.(2)

32、 在4 C于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液,邊加邊攪拌,使溶液最終為50 %硫酸銨濃度.(3) 此溶液置冰中 30min60min,然后5 000r/min離心10min,去上清.(4) 將沉淀溶于 TrisHCl 緩沖液( 40mMol/L NaCl )中(溶液可能混濁).(5) 裝入透析袋于 TrisHCl 緩沖液( 20 mMol/L NaCl )中透析除鹽. ( 6)離心去沉淀.(7) 溶液稀釋(1: 100或更高倍稀釋)后,于 280nm測(cè)蛋白含量,估計(jì)蛋白質(zhì)含量1A 280unit=0.8mg 蛋白質(zhì)A280unitsA2S0unils mgl 或=14一般每ml腹水中,含有總蛋白約

33、25mg36mg.8過(guò)DEAE 纖維素柱：纖維素柱高 40cm,以20mMol/L NaCI Tris 緩沖液 平衡.透析樣品以 Tris緩沖液等量稀釋.樣品進(jìn)入柱床速度為1ml2ml/min,以NaCI線形梯度洗脫.大局部單克隆 IgG 于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫,也有極少例外的單克隆抗體于 120 mMol/L 150 mMol/L NaCl 洗脫.測(cè)OD280nm收集蛋白峰,單克隆IgG保存?zhèn)溆?雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白,但主要是IgG和IgM,究竟是哪種為主,那么決定于抗原的免疫程序.免疫一次,且3天后就取脾,多為產(chǎn)生 IgM的B淋巴細(xì)胞.免疫屢次的多為IgG

34、.三單克隆抗體的鑒定1 雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查采用秋水仙素裂解法進(jìn)行.2單克隆抗體的類(lèi)型、亞型的測(cè)定：購(gòu)置兔抗小鼠lg類(lèi)型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清,采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測(cè)定單抗的Ig類(lèi)型和亞型.3. 單抗的特異性鑒定可以采用各種方法,如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等,同時(shí)還需做免疫阻斷試驗(yàn)等.4. 單抗的效價(jià)測(cè)定可采用凝集反響、ELISA或放射免疫測(cè)定.不同的測(cè)定方 法效價(jià)不同.培養(yǎng)上清液的效價(jià)遠(yuǎn)不如腹水的效價(jià).采用凝集反響,腹水效價(jià)可達(dá)5X 104.而采用ELISA檢查,腹水效價(jià)可達(dá) 1.0X 106.單抗的效價(jià)以培養(yǎng)上清和腹 水的稀釋度表示.5. 必要時(shí)還可以測(cè)定

35、單抗的親和力和識(shí)別抗原表位的水平測(cè)定.八、雜交瘤細(xì)胞的保存一保存當(dāng)獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞后,必須將一局部雜交瘤細(xì)胞保存,否那么在連續(xù)傳代的過(guò)程中,可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或喪失 產(chǎn)生抗體的特性.另外在長(zhǎng)期的培養(yǎng)過(guò)程中,難免不發(fā)生污染以至于消滅.所以必 須冷藏保存一局部.保存方法如下：1材料(1) 細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞.(2) 10 二甲基亞砜保護(hù)液(二甲基亞砜能損壞濾器,而又被高壓所破壞,所以 不能過(guò)濾或高壓消毒.其本身就是毒品,無(wú)菌)：含10二甲基亞砜、 20滅活胎牛血清, 70RPMI 1640 液.(3) 20 % FCS 1640培養(yǎng)液：含青霉素 1

36、00U/ml,鏈霉素100卩g/ml.(4) 滅菌的 2ml 安瓶等2操作方法(1)去掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的舊的培養(yǎng)液,參加10% FCS1640液,使細(xì)胞懸浮.(3) 1 000r/min離心10min,去上清.細(xì)胞沉淀用10%二甲基亞砜保護(hù)液制成懸液,使成1.0 x 107細(xì)胞/ ml.(3) 取樣,臺(tái)盼蘭染色,計(jì)數(shù)活細(xì)胞,應(yīng)在 95%以上.(4) 用注射器將細(xì)胞分裝安瓶,每瓶 0.5ml1.0ml,熔封安瓶.(5) 放 4C 2h.(6) 放液氮罐氣態(tài)局部(-70 C) 15h.(7) 轉(zhuǎn)入液氮局部.(二)復(fù)蘇1 從液氮罐中取出安瓶立即放37 C水浴中速溶.2無(wú)菌操作翻開(kāi)安瓶,取出細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)

37、入組織培養(yǎng)瓶.3逐滴緩慢參加 20% FCS- 1640培養(yǎng)液3.5ml,這個(gè)過(guò)程延續(xù) 3min.4. 5% CO2飽和濕度,37C培養(yǎng).5. 4h后棄去培養(yǎng)液上清,參加新鮮的20% FCS- 1640培養(yǎng)液.6. 繼續(xù)培養(yǎng),換液,以至形成單層.九、試劑配制1. RPMI - 1640 培養(yǎng)液 取 1640 粉 10.5g 加水 1 000ml 加溫溶解 (不要超過(guò) 50C立即用G6漏斗過(guò)濾,分裝,冰凍保存.2 DMEM 培養(yǎng)液13.38g干粉溶于1 000ml水中,并加以下試劑:0.11g3.60g20 萬(wàn) U20 萬(wàn) U丙酮酸鈉 碳酸氫鈉青霉素 鏈霉素培養(yǎng)液用 CO2 正壓除菌過(guò)濾, 使變

38、酸呈橙色, 參加 20的新生小牛血清后即可使用,4C保存.3 HAT 培養(yǎng)液DMEM 培養(yǎng)液490ml,力口 HT和A各5ml.100 X HT的配制：次黃嘌呤 H 胸腺嘧啶核苷 T稱(chēng)取次黃嘌呤136.1mg和胸腺嘧啶核苷 38.8mg溶于100ml水,過(guò)濾除菌-20避光保存.100X A 的配制：氨基喋呤A:稱(chēng)氨基喋呤 1.8mg溶于20ml水中,加0.5ml 1Mol/L NaOH 助 溶,然后以 0.5ml 1Mol/L HCl 中和,再加水至 100ml.4HT 培養(yǎng)液500mlRPMI 1640 液加 HT 母液 5ml 即可.5. 完全 RPMI 1640 液：RPMI495.0mlHopes 緩沖液1Mol/L 10.5mlL 谷胺酰胺5.0ml抗菌素液5.0ml滅活小牛血清50.0ml6. 以上配試劑用水均為雙蒸餾水.十、 馬傳貧病毒單克隆抗體的制備一材料與方法1抗原動(dòng)物及免疫方法抗原為哈爾濱獸醫(yī)研究所保存的馬傳貧病毒株培養(yǎng)物制備的可溶性抗原. 免疫動(dòng)物為68周齡的Balb/c鼠.初次免疫用含完全佐劑抗原 0.2ml 病毒含量為1.0X 108/ml制備的可溶性抗原腹腔接種,經(jīng)2周再次免疫接種,應(yīng)用不完全佐劑抗原 0.2m