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1、第六章第六章 基因的表達與調控基因的表達與調控( (上上) ) 原核基因表達調控模式原核基因表達調控模式DNARNA蛋白質復制轉錄翻譯逆轉錄RNA復制Contents5 51 1 原核基因表達調控總論原核基因表達調控總論5 52 2 乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)5 53 3 色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)5 54 4 轉錄后調控轉錄后調控原核生物和單細胞真核生物:環(huán)境影響蛋白質合成原核生物和單細胞真核生物:環(huán)境影響蛋白質合成高等真核生物出現細胞分化:不同細胞所合高等真核生物出現細胞分化:不同細胞所合成蛋白質在質和量上均有差異成蛋白質在質和量上均有差異因

2、此,不論真核還是原核細胞都有一套準確因此,不論真核還是原核細胞都有一套準確地調節(jié)基因表達和蛋白質合成的機制地調節(jié)基因表達和蛋白質合成的機制如果每個基因等同翻譯,每一個多肽應有相同的拷貝數。如果每個基因等同翻譯,每一個多肽應有相同的拷貝數。 結論是否定的,基因的表達是被控制的。結論是否定的,基因的表達是被控制的。 組成型合成蛋白質組成型合成蛋白質 適應型或調節(jié)型合成蛋白質適應型或調節(jié)型合成蛋白質如如DNADNA合成酶,合成酶,RNARNA聚合酶等聚合酶等如如-半乳糖苷酶及參與糖代謝的酶,半乳糖苷酶及參與糖代謝的酶,氨基氨基 酸、核苷酸合成系統(tǒng)的酶類等酸、核苷酸合成系統(tǒng)的酶類等一個系統(tǒng)處于一個系統(tǒng)

3、處于“off”off”狀態(tài)時可能是狀態(tài)時可能是本底水平的基本底水平的基因表達因表達,常常是每世代每個細胞合成,常常是每世代每個細胞合成1 12 2個個mRNAmRNA分分子和極少量的蛋白質分子。必須明白所謂子和極少量的蛋白質分子。必須明白所謂“關關”實實際的意思是基因表達量特別低,或者無法檢測。際的意思是基因表達量特別低,或者無法檢測。細菌中的基本調控機制有如下規(guī)律細菌中的基本調控機制有如下規(guī)律: :一個體系在需要一個體系在需要時被打開,不需要時被關閉。這種時被打開,不需要時被關閉。這種“開開- -關關”(on-off)(on-off)活性是通過活性是通過調節(jié)轉錄調節(jié)轉錄來建立的。來建立的。即

4、通過即通過調節(jié)調節(jié)mRNAmRNA的合成的合成來實現的來實現的51 原核基因表達調控總論原核基因表達調控總論生物信息生物信息DNARNAProtein執(zhí)行生命活動執(zhí)行生命活動調調 節(jié)節(jié)基因表達調控基因表達調控基因表達調控在兩個水平上體現基因表達調控在兩個水平上體現 (1)轉錄水平上的調控轉錄水平上的調控(transcriptional regulation);(2)轉錄后水平上的調控轉錄后水平上的調控(post-transcriptional regulation) mRNA加工成熟水平上的調控加工成熟水平上的調控(differential processing of RNA transcri

5、pt) 翻譯水平上的調控翻譯水平上的調控(differential translation of mRNA)指揮基因調控的信號不同指揮基因調控的信號不同 Prok中,營養(yǎng)狀況和環(huán)境因素中,營養(yǎng)狀況和環(huán)境因素主要主要 Euk中,中, 激素水平和發(fā)育階段激素水平和發(fā)育階段主要主要 在轉錄水平上對基因表達調控取決于在轉錄水平上對基因表達調控取決于DNADNA的結的結構、構、RNARNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。配基的相互作用。5.1.1 5.1.1 原核基因調控機制的類型與特點原核基因調控機制的類型與特點 原核生物的基因調控主要發(fā)生在轉錄水平

6、上,根原核生物的基因調控主要發(fā)生在轉錄水平上,根據調控機制的不同可分為:據調控機制的不同可分為: 負轉錄調控負轉錄調控(negative transcription regulation)(negative transcription regulation) 正轉錄調控正轉錄調控(Positive transcription regulation)(Positive transcription regulation)負轉錄調控系統(tǒng)負轉錄調控系統(tǒng)在負轉錄調控系統(tǒng)中,調節(jié)基因的物質是在負轉錄調控系統(tǒng)中,調節(jié)基因的物質是阻阻遏蛋白遏蛋白(repressor)(repressor)阻止結構基因轉錄。阻

7、止結構基因轉錄。其作用部位是操縱區(qū)。它與操縱區(qū)結合,轉其作用部位是操縱區(qū)。它與操縱區(qū)結合,轉錄受阻。錄受阻。調節(jié)基因調節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因阻遏蛋白阻遏蛋白激活蛋白激活蛋白正轉錄調控正轉錄調控負轉錄調控負轉錄調控負轉錄調控在沒有調節(jié)蛋白質存在時基因是表達的,加入這種調節(jié)蛋白質后基因表達活性便被關閉,這樣的調控負轉錄調控。 負控誘導系統(tǒng)負控誘導系統(tǒng)阻遏蛋白不與誘導物阻遏蛋白不與誘導物結合時,阻遏蛋白與結合時,阻遏蛋白與操縱區(qū)相結合,結構操縱區(qū)相結合,結構基因不轉錄,阻遏蛋基因不轉錄,阻遏蛋白結合上誘導物時,白結合上誘導物時,阻遏蛋白與操縱區(qū)分阻遏蛋白與操縱區(qū)分離,結構基因轉錄。離

8、,結構基因轉錄。 負控阻遏系統(tǒng)負控阻遏系統(tǒng)阻遏蛋白與效應阻遏蛋白與效應物結合時,結構基物結合時,結構基因不轉錄。因不轉錄。正轉錄調控系統(tǒng)正轉錄調控系統(tǒng)在正轉錄調控系統(tǒng)中,調節(jié)基因的產物是在正轉錄調控系統(tǒng)中,調節(jié)基因的產物是激活蛋白激活蛋白(activator)(activator),激活蛋白結合與,激活蛋白結合與DNADNA的啟動子及的啟動子及RNARNA聚合酶后,轉錄才會進聚合酶后,轉錄才會進行。行。調節(jié)基因調節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因阻遏蛋白阻遏蛋白激活蛋白激活蛋白正轉錄調控正轉錄調控負轉錄調控負轉錄調控正轉錄調控正轉錄調控如果在沒有調節(jié)蛋白質存在時基因是關閉的,加入這種調節(jié)蛋

9、白質后基因活性就被開啟,這樣的調控正轉錄調控。 在在正控誘導系統(tǒng)正控誘導系統(tǒng)中,誘導物的存在使中,誘導物的存在使激活蛋白處于活性狀激活蛋白處于活性狀態(tài),轉錄進行。態(tài),轉錄進行。 在在正控阻遏系統(tǒng)正控阻遏系統(tǒng)中,中,效應物分子的存在使效應物分子的存在使激活蛋白處于非活性激活蛋白處于非活性狀態(tài),轉錄不進行。狀態(tài),轉錄不進行。 可誘導調節(jié):指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下,由原來關閉的狀態(tài)轉變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài),即在某些物質的誘導下使基因活化。 例:大腸桿菌的乳糖操縱子 分解代謝蛋白的基因2、根據操縱子對某些能調節(jié)它們的小分子的應答,可分為可誘導調節(jié)和可阻遏調節(jié)兩大類:調節(jié)基因調節(jié)基因操縱基因操縱基

10、因結構基因結構基因阻遏蛋白阻遏蛋白調節(jié)基因調節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因阻遏蛋白阻遏蛋白誘導物誘導物mRNA酶蛋白酶蛋白酶合成的誘導操縱子模型酶合成的誘導操縱子模型誘導物如果某種物質能夠促使細菌產生酶來分解它,這種物質就是誘導物。 可阻遏調節(jié):可阻遏調節(jié):基因平時是開啟的,處在產生蛋白質基因平時是開啟的,處在產生蛋白質或酶的工作過程中,由于一些特殊代謝物或化合物或酶的工作過程中,由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關閉,阻遏了基因的表達。的積累而將其關閉,阻遏了基因的表達。 例:例:色氨酸操縱子色氨酸操縱子 合成代謝蛋白的基因酶合成的酶合成的阻遏阻遏操縱子模型操縱子模型調節(jié)基因調節(jié)

11、基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白調節(jié)基因調節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因輔阻遏物輔阻遏物輻阻遏物如果某種物質能夠阻止細菌產生合成這種物質的酶,這種物質就是輔阻遏物。一一 般般 規(guī)規(guī) 律律 可誘導的操縱子是一可誘導的操縱子是一些編碼分解代謝糖和氨基些編碼分解代謝糖和氨基酸的蛋白的基因。這些操酸的蛋白的基因。這些操縱子常常是關閉的。一旦縱子常常是關閉的。一旦生存條件發(fā)生變化,如葡生存條件發(fā)生變化,如葡萄糖缺乏而必須利用乳糖萄糖缺乏而必須利用乳糖作為能源時,就要打開這作為能源時,就要打開這些基因。些基因。 可阻遏基因是一些合可阻遏基因是一些合成各種細胞代謝過程

12、中所成各種細胞代謝過程中所必須的小分子物質(如氨必須的小分子物質(如氨基酸、嘌呤和嘧啶等的基基酸、嘌呤和嘧啶等的基因),這些基因總是打開因),這些基因總是打開著的。只有當細菌生活環(huán)著的。只有當細菌生活環(huán)境中有充分供應時,才關境中有充分供應時,才關閉這些基因,停止其合成。閉這些基因,停止其合成。弱化子對基因活性的影響弱化子對基因活性的影響在這種調節(jié)方式中,起信號作用的是在這種調節(jié)方式中,起信號作用的是有特殊負載的有特殊負載的氨酰氨酰-tRNA-tRNA的濃度。的濃度。 當操縱子被阻遏,當操縱子被阻遏,RNARNA合成被終止時,起終止轉合成被終止時,起終止轉錄信號作用的那一段錄信號作用的那一段DN

13、ADNA序列被稱為弱化子。序列被稱為弱化子。當基因轉錄使轉錄產物(當基因轉錄使轉錄產物(RNARNA)到不)到不同長度時,核糖體會在對應的同長度時,核糖體會在對應的DNADNA位位置上;此時置上;此時RNARNA可以形成某種形式的可以形成某種形式的二級結構;由此決定延伸復合物的二級結構;由此決定延伸復合物的結合能力,從而決定基因能否繼續(xù)結合能力,從而決定基因能否繼續(xù)轉錄。轉錄。細菌的應急反應細菌的應急反應細菌有時會碰到緊急狀況,比如氨基酸饑餓細菌有時會碰到緊急狀況,比如氨基酸饑餓氨基酸的全面匱乏。為了緊縮開支,渡過難氨基酸的全面匱乏。為了緊縮開支,渡過難關,細菌會產生一個應急反應關,細菌會產生

14、一個應急反應停止包括生停止包括生產各種產各種RNARNA、糖、脂肪和蛋白質的幾乎全部生、糖、脂肪和蛋白質的幾乎全部生物化學反應過程。物化學反應過程。實施這一應急反應的實施這一應急反應的信號是信號是鳥苷四磷酸鳥苷四磷酸(ppGpp(ppGpp) )和鳥苷五磷酸和鳥苷五磷酸(pppGpp(pppGpp) )。產生這兩種物質的產生這兩種物質的誘誘導物導物是是空載空載tRNAtRNA。當氨基酸饑餓時,細胞中便存在大量的不帶氨當氨基酸饑餓時,細胞中便存在大量的不帶氨基酸的基酸的tRNAtRNA,這種空載的,這種空載的tRNAtRNA會激活焦磷酸轉會激活焦磷酸轉移酶,使移酶,使ppGppppGpp大量合成

15、。大量合成。ppGppppGpp的出現會關閉許多基因,以應付這種緊急的出現會關閉許多基因,以應付這種緊急狀況。狀況。 ppGppppGpp 影響影響RNARNA聚合酶與這些基因轉錄聚合酶與這些基因轉錄起始位點的結合,使基因被關閉。起始位點的結合,使基因被關閉。ppGppppGpp與與pppGpppppGpp的作用范圍十分廣泛,它們影響的作用范圍十分廣泛,它們影響一大批操縱子而被稱為超級調控因子。一大批操縱子而被稱為超級調控因子。5 52 2 乳糖操縱子負控誘導系統(tǒng)乳糖操縱子負控誘導系統(tǒng)1 1、操縱子模型的提出、操縱子模型的提出 19611961年,年,MonodMonod和和JacobJaco

16、b提出提出 獲獲19651965年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎Jacob and Monod2、操縱子的定義、操縱子的定義操縱子操縱子:是基因表達的協調單位,由啟動子、操縱是基因表達的協調單位,由啟動子、操縱基因及其所控制的一組功能上相關的結構基因所組基因及其所控制的一組功能上相關的結構基因所組成。操縱基因受調節(jié)基因產物的控制。成。操縱基因受調節(jié)基因產物的控制。操縱序列操縱序列 O啟動序列啟動序列 P 上游含上游含CAP(分解代謝物(分解代謝物 基因激活蛋白)基因激活蛋白)調控區(qū)調控區(qū)調節(jié)基因調節(jié)基因 I 編碼一種阻遏蛋白編碼一種阻遏蛋白結構基因結構基因Z -半乳糖苷酶半乳糖苷酶

17、Y 透酶透酶A 乙?;D移酶乙?;D移酶乙?;D移酶乙?;D移酶半乳糖苷半乳糖苷透性酶透性酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶操作位點操作位點3 乳糖操縱子乳糖操縱子結構結構調節(jié)基因調節(jié)基因一、乳糖操縱子的結構一、乳糖操縱子的結構 Z編碼-半乳糖苷酶:將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖 Y編碼-半乳糖苷透過酶:使外界的-半乳糖苷(如乳糖)能透過大腸桿菌細胞壁和原生質膜進入細胞內。 A編碼-半乳糖苷乙酰基轉移酶:乙酰輔酶A上的乙?;D到-半乳糖苷上,形成乙酰半乳糖。 操縱子操縱子是一種完整的具有特定功能的細菌基因表達和調節(jié)是一種完整的具有特定功能的細菌基因表達和調節(jié)的單位,包括的單位,包括調節(jié)基因調節(jié)基因,操縱位點

18、操縱位點,結構基因結構基因,組成一個,組成一個控制單元控制單元結構基因:結構基因:產生產生mRNA,合成蛋白質合成蛋白質操縱位點操縱位點 promotor,operator:啟動子結合位點:啟動子結合位點調節(jié)基因:產生調節(jié)蛋白調節(jié)基因:產生調節(jié)蛋白(與操縱位點結合)(與操縱位點結合) 結構基因不轉錄結構基因不轉錄 誘導物存在時,可與阻遏蛋白結合誘導物存在時,可與阻遏蛋白結合 結構基因轉錄結構基因轉錄Control elementStructural genes5.2.2 酶的誘導現象酶的誘導現象B-半乳糖苷酶半乳糖苷酶二、酶的誘導二、酶的誘導laclac體系受調控的證據體系受調控的證據分解底物

19、的酶只有在底物存在時才出現!分解底物的酶只有在底物存在時才出現!無乳糖時,幾個無乳糖時,幾個-gal/cell 加入乳糖時,加入乳糖時,5000個個 再去掉乳糖,再去掉乳糖,lac mRNA下降下降 乳糖能激發(fā)乳糖能激發(fā)lac mRNA的合成的合成 乳糖的誘導作用是由酶前體轉化而來,還是誘導新酶乳糖的誘導作用是由酶前體轉化而來,還是誘導新酶合成?合成? 培養(yǎng)基(培養(yǎng)基(35S-aa, 無乳糖)無乳糖) E.coli繁殖繁殖 培養(yǎng)基(無培養(yǎng)基(無35S -aa, 加入乳糖)加入乳糖) -gal(無無35S)安慰誘導物: 如果某種物質能夠促使細菌產生酶而本身又不被分解,這種物質被稱為安慰誘導物,如

20、IPTG(異丙基- D-硫代半乳糖苷)。gratuitous inducer 安慰誘導物安慰誘導物 義務誘導物義務誘導物可誘導半乳糖苷酶產生,但可誘導半乳糖苷酶產生,但不是其底物不是其底物IPTG,異丙基巰基半乳糖苷,異丙基巰基半乳糖苷TMG ,巰甲基半乳糖苷,巰甲基半乳糖苷ONPG, O-硝基半乳糖苷硝基半乳糖苷在研究誘導作用時,很少使用乳糖在研究誘導作用時,很少使用乳糖5.2.3 調控機理調控機理1 調控區(qū)結構調控區(qū)結構 lacI, 1045bp,獨立,獨立PiP, 82bp,821O, 35bp,728lacZYA體外結合競爭實驗體外結合競爭實驗: 阻遏物阻遏物RNA pol, off

21、RNA pol阻遏物,阻遏物, on2. 阻遏狀態(tài)阻遏狀態(tài) 未誘導:結構基因被阻遏 阻遏物 四聚體 LacI P O lacZ lacY lacA 圖 16- 當無誘導物時阻遏物結合在操縱基因上 3 誘導狀態(tài)誘導狀態(tài)誘導作用:在可誘導的操縱元中,誘導作用:在可誘導的操縱元中,加入對基因表達有調節(jié)作用的小分加入對基因表達有調節(jié)作用的小分子后,開啟基因的轉錄活性子后,開啟基因的轉錄活性 誘導:基因被打開 -半乳糖苷酶 透性酶 乙酰轉移酶 圖 16-7 誘導物和阻遏物成為調節(jié)操縱子的開關 4 4 誘導物不是誘導物不是乳糖乳糖生成生成lac誘導物誘導物乳糖代謝乳糖代謝Allolctose 異構乳糖異構

22、乳糖 別乳糖別乳糖細胞內細胞內-半乳糖苷酶來源半乳糖苷酶來源?5.2.4 阻遏蛋白的作用機制阻遏蛋白的作用機制1 阻遏蛋白結構阻遏蛋白結構38KD,4 聚體聚體,一個亞基結合一個一個亞基結合一個IPTG分子分子lacI 組成型轉錄組成型轉錄 Pi 弱啟動子,弱啟動子, 510個個cell具有二重性具有二重性 阻止轉錄(與阻止轉錄(與lacO結合)結合) 開始轉錄(與開始轉錄(與誘導物誘導物結合)結合) 阻遏蛋白單體的結構阻遏蛋白單體的結構 Helix-turn-helix Core domain1 Core domain2 1 51 80 360 DNA binding Hinge Induc

23、er binding Oligomerization 圖 16- 阻遏蛋白單體的結構和功能 阻遏蛋白的阻遏蛋白的結構域結構域 頭段頭段,-NH2端,端,lacO結合結合區(qū)區(qū) 絞鏈區(qū)絞鏈區(qū) 核心段核心段,-COOH, 誘導物結合區(qū)誘導物結合區(qū)4個亞基的核心片段接觸形成四聚體個亞基的核心片段接觸形成四聚體 對稱軸,對稱軸,+11 對稱序列,對稱序列,6bp2. 阻遏蛋白的結合位點阻遏蛋白的結合位點lacO的結構的結構誘導物誘導物和阻遏和阻遏蛋白結蛋白結合的模合的模型型 維持阻遏 過量的阻遏物可結 合在 DNA 阻遏物結合在 的其它位點 操縱基因上 aaaa aaa a a 誘導物 a 誘導 所有的

24、阻遏物都結合 a a 在 DNA 的隨機位點上 a a a aa 誘導物解離 a 建立阻遏 阻遏物恢復 活性狀態(tài) a a a 阻遏蛋白通過直接取代 a 從隨機位點移向 a 操縱基因 a a a a a a 圖 16-14 在細胞中所有的阻遏蛋白都結合在 DNA 上 (仿 B.Lewin:GENES,1997, Fig .12.18) 阻遏能發(fā)生在多個位點上阻遏能發(fā)生在多個位點上aroH GCCG AATGTACTAGAGAACTAGTGC ATTAGCTTATTTTTTTGTTATCATGCTAAmRNAtrp AATC ATCGAACTAGTTAACTAGTAC GCAmRNAtrpR TG

25、CT ATCGTACTCTTTAGCGAGTAC AACCmRNA 操 縱 區(qū) 域13 圖 16-16 trp 阻遏物識別三個位點上的操縱區(qū)(仿 B.Lewin:GENES,1997, Fig .12.19)199 F3 3 阻遏蛋白對阻遏蛋白對RNApolRNApol功能的影響功能的影響 阻遏蛋白和阻遏蛋白和RNA pol可同時與可同時與DNA結合結合 RNA pol 與啟動子結合的平衡常數與啟動子結合的平衡常數 1.9107 有阻有阻遏蛋白時遏蛋白時, 2.5109 結合著的結合著的RNA pol不能轉錄不能轉錄. 但加入誘導物后但加入誘導物后, 釋放出阻遏釋放出阻遏蛋白蛋白, 變?yōu)殚_放型

26、啟動子復合物變?yōu)殚_放型啟動子復合物. 阻遏蛋白實際上使阻遏蛋白實際上使RNA pol貯存在啟動子上。貯存在啟動子上。這一模式是否存在于其它操縱元系統(tǒng)中?這一模式是否存在于其它操縱元系統(tǒng)中?5.2.5 乳糖操縱子調控模型乳糖操縱子調控模型主要內容:主要內容: Z、Y、A基因的產物由同一條多順反子的基因的產物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼分子所編碼 這個這個mRNA分子的啟動子緊接著分子的啟動子緊接著O區(qū),而位于區(qū),而位于I與與O之間的啟動子區(qū)(之間的啟動子區(qū)(P),不能單獨起動合),不能單獨起動合成成-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。 操縱基因是操縱基因是DNA

27、上的一小段序列(僅為上的一小段序列(僅為26bp),),是阻遏物的結合位點。是阻遏物的結合位點。RNA聚合酶結合部位聚合酶結合部位阻遏物結合部位阻遏物結合部位 操縱位點的回文序列 當阻遏物與操縱基因結合時,當阻遏物與操縱基因結合時,laclac mRNA mRNA的轉的轉錄起始受到抑制。錄起始受到抑制。 阻遏蛋白的負性調節(jié)阻遏蛋白的負性調節(jié)沒有乳糖存在時沒有乳糖存在時AYZOPImRNA阻遏蛋白RNA pol誘導物通過與阻遏物結合,改變它的三維構象,誘導物通過與阻遏物結合,改變它的三維構象,使之不能與操縱基因結合,從而激發(fā)使之不能與操縱基因結合,從而激發(fā)lac mRNA的合成。當有誘導物存在時

28、,操縱基因區(qū)沒有被的合成。當有誘導物存在時,操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據,所以啟動子能夠順利起始阻遏物占據,所以啟動子能夠順利起始mRNA的的合成。合成。 有乳糖存在時有乳糖存在時AYZOPI阻遏蛋白mRNA 半乳糖苷酶乳糖半乳糖RNA pol2.2 操縱子突變操縱子的發(fā)現操縱子突變操縱子的發(fā)現(1) Oc 操縱基因的組成型突變操縱基因的組成型突變(順式顯性順式顯性)n 順式顯性突變順式顯性突變(cis-dominance):操縱基因只控制臨近基因,對其他等位基因無作用,或者顯性效應只對處于同一染色體上它所調控的結構基因才起作用的現象。 (2)lacIS 阻遏蛋白不可誘導性突變,阻遏蛋白不可誘導

29、性突變,阻遏蛋白失去誘導物結合位點;(3)lacI- 阻遏蛋白不能形成寡聚物阻遏蛋白不能形成寡聚物(4)lacI-d 阻遏蛋白不能和阻遏蛋白不能和DNA結合結合,且呈負互補(反式顯性)n 等位基因間的互補等位基因間的互補(interallelic complementation)。n 負的互補負的互補(negative complementation):lacI-d的產物和lacI+的產物組成多聚體時,阻遏蛋白無活性。也稱為反式顯性反式顯性(trans-dominant)。 Active repressor cannot bind to O c mutant operantor Operon

30、is transcribed and translated lacI O c operantor -半乳糖苷酶 透性酶 乙酰轉移酶 圖 16-7 操縱基因發(fā)生組成型突變,操縱子組成型表達 阻遏蛋白不能與突變的操縱基因結合,結構基因組成型表達(1)操縱基因突變(O+Oc),結構基因組成型表達組成型突變: lacOc (2)操縱子不可誘導型突變 Repressor has lost lacI S genesythesizes Iducer-binding site defective repressor that cannot bind inducer; it binds permanently

31、to operator lacI S Operantor lacI + wild-type repressor does not influence DNA-binding of LacS repressor 圖圖 16- Uninducible lac S mutations are dominant 阻遏蛋白失去結合誘導物位點的突變lacIs, 結構基因組成型表達(3)阻抑蛋白基因的I-突變 Inactive repressor lacIgene sythesizes defective repressor that does not bind to DNA Operon is trans

32、cribed and translated lacI Operantor -半乳糖苷酶 透性酶 乙酰轉移酶 圖 16- lac I 發(fā)生突變,操縱子組成型表達 阻遏蛋白失活或者缺乏,不能和操縱基因結合,結構基因組成型表達組成型突變: lacI- Inactive repressor lacIgenesythesizes defective repressor that does not bind to DNA LacI + gene sythesizes lacI Operator wild-type repressor which bind to operator lacI + Induce

33、r displaces wild-type repressor from operator as usual 圖圖 16- Constitutive mutations in the lacI gene are recessive. 二倍體中,二倍體中,lac Repressor has lost lacI S genesythesizes Iducer-binding site defective repressor that cannot bind inducer; it binds permanently to operator lacI S Operantor lacI + wild-

34、type repressor does not influence DNA-binding of LacS repressor 圖圖 16- Uninducible lac S mutations are dominant 不可誘導突變(超阻遏):四、影響因子四、影響因子1、lac操縱子的本底水平表達有兩個矛盾是操縱子理論所不能解釋的:誘導物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結合,而轉運誘導物需要透過酶,后者的合成有需要誘導。解釋:一些誘導物可以在透過酶不存在時進入細胞? 一些透過酶可以在沒有誘導物的情況下合成?真正的誘導物是異構乳糖而非乳糖,前者是在真正的誘導物是異構乳糖而非乳糖,前者是在- -半乳

35、糖甘酶的催化下由乳糖形成的,因此,半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的,因此,需要有需要有- -半乳糖甘酶的預先存在。半乳糖甘酶的預先存在。解釋:解釋:本底水平的組成型合成:非誘導狀態(tài)下有少量的本底水平的組成型合成:非誘導狀態(tài)下有少量的lac mRNA合成。合成。2、大腸桿菌對乳糖的反應 培養(yǎng)基:甘油培養(yǎng)基:甘油 按照按照lac操縱子本底水平的表達,每個細胞內有幾個操縱子本底水平的表達,每個細胞內有幾個分子的分子的-半乳糖苷酶和半乳糖苷酶和-半乳糖苷透過酶;半乳糖苷透過酶;培養(yǎng)基:加入乳糖培養(yǎng)基:加入乳糖少量乳糖少量乳糖透過酶透過酶進入細胞進入細胞-半乳糖苷酶半乳糖苷酶異構乳糖異構乳糖誘導物誘導物誘

36、導誘導lac mRNA的生物合成的生物合成大量乳糖進入細胞大量乳糖進入細胞多數被降解為葡萄糖和半乳糖(碳源和能源)多數被降解為葡萄糖和半乳糖(碳源和能源)異構乳糖異構乳糖 H OH HO H OH H H CH2OH H O OH HO O H O CH2 CH2OH H OH OH H HO O H 別乳糖 H O OH H H H OH OH H H H2O H H H O OH CH2OH CH2OH H OH CH2OH H O OH HO O OH H H OH H OH H HO H H H H OH H OH 葡萄糖 半乳糖 圖 16- 乳糖分解的不同產物乳糖3、阻遏物lacI基

37、因產物及功能 Lac Lac 操縱子阻遏物操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動子控制下組是由弱啟動子控制下組成型合成的,每個細胞中有成型合成的,每個細胞中有5-10個阻遏物分子。個阻遏物分子。 當當I基因由弱啟動子突變成強啟動子,細胞內就不基因由弱啟動子突變成強啟動子,細胞內就不可能產生足夠的誘導物來克服阻遏狀態(tài),整個可能產生足夠的誘導物來克服阻遏狀態(tài),整個lac操縱子在這些突變體中就不可誘導。操縱子在這些突變體中就不可誘導。4、葡萄糖對lac操縱子的影響 如果將葡萄糖和乳糖同時加入培養(yǎng)基中如果將葡萄糖和乳糖同時加入培養(yǎng)基中, laclac操縱子處于阻遏狀態(tài),不能被誘導;一旦耗盡操縱子處于阻遏狀態(tài),

38、不能被誘導;一旦耗盡外源葡萄糖,乳糖就會誘導外源葡萄糖,乳糖就會誘導laclac操縱子表達分操縱子表達分解乳糖所需的三種酶。解乳糖所需的三種酶。 代謝物阻遏效應代謝物阻遏效應mRNA無乳糖時無乳糖時有乳糖時有乳糖時 無葡萄糖無葡萄糖 cAMP濃度高濃度高 有葡萄糖有葡萄糖cAMP濃度低濃度低RNA-polOOOOlaclac操縱子基因表達既需要乳糖又需缺乏葡萄糖操縱子基因表達既需要乳糖又需缺乏葡萄糖5 5、cAMPcAMP與代謝物激活蛋白與代謝物激活蛋白代謝物激活蛋白(代謝物激活蛋白(CAP)/環(huán)腺甘酸受體蛋白(環(huán)腺甘酸受體蛋白(CRP) 葡萄糖對葡萄糖對lac操縱元表達的抑制是間接操縱元表達

39、的抑制是間接的的 葡萄糖的降解是通過葡萄糖的降解是通過cAMP與與 CAP結結合起作用的合起作用的 cAMP:環(huán)化腺苷酸環(huán)化腺苷酸CAP, catabolite activator protein 由由crp編碼編碼CRP, catabolite receptor proteinZYAOPDNA 調控區(qū)調控區(qū)CAP結合位點結合位點啟動序列啟動序列操縱序列操縱序列 結構基因結構基因Z: -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y: 透酶透酶A:乙?;D移酶:乙?;D移酶cAMPCAP復合物CAP的結合對的結合對DNA構型的影響構型的影響 DNA彎曲彎曲 彎曲點位于彎曲點位于CAP結合位點二重對稱的中心結合位點二重

40、對稱的中心 彎曲使彎曲使CAP能與啟動子上的能與啟動子上的RNA pol 接觸接觸ATPATP腺甘酸環(huán)化酶腺甘酸環(huán)化酶cAMP(環(huán)腺甘酸)(環(huán)腺甘酸) 大腸桿菌中:無葡萄糖,大腸桿菌中:無葡萄糖,cAMP濃度高;濃度高; 有葡萄糖,有葡萄糖,cAMP濃度低濃度低+ + + + + + + + 轉錄轉錄無葡萄糖,無葡萄糖,cAMP濃度高時濃度高時促進轉錄促進轉錄有葡萄糖,有葡萄糖,cAMP濃度低時濃度低時不促進轉錄不促進轉錄ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正調控的正調控 CAPCAP的正性調節(jié)的正性調節(jié)AYZOPI無葡萄糖,cAMP濃度高時CAPcAMPRNA

41、pol 有葡萄糖,cAMP濃度低時AYZOPIRNA polCAP當阻遏蛋白封閉轉錄時,CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用如無如無CAP存在,即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結合,存在,即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結合,操縱子仍無轉錄活性。操縱子仍無轉錄活性。 cAMPCAP復合物與啟動復合物與啟動子區(qū)的結合是轉錄起始所必需的。子區(qū)的結合是轉錄起始所必需的。協調調節(jié)協調調節(jié)葡萄糖對葡萄糖對 lac 操縱子的阻遏作用稱操縱子的阻遏作用稱分解代分解代謝阻遏謝阻遏(catabolic repression)。 單純乳糖存在時,細菌利用乳糖作碳源;若單純乳糖存在時,細菌利用乳糖作碳源;若有葡萄糖或葡萄糖有葡萄糖或葡萄

42、糖/乳糖共同存在時,細菌首先利乳糖共同存在時,細菌首先利用葡萄糖。用葡萄糖。 協調調節(jié)協調調節(jié)OOOORNA pol無葡萄糖cAMP濃度高有葡萄糖cAMP濃度低有乳糖無乳糖RNA polRNA polRNA polThe Lac Operon:When Glucose Is Present But Not LactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCome on, let me throughNo way

43、Jose!CAPCAPThe Lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RNAPol.Yipee!The Lac Operon:When N

44、either Lactose Nor Glucose Is PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorSTOPRight therePolymeraseAlright, Im off to the races . . .Come on, let me through!五、五、LacLac操縱子中的其他問題操縱子中的其他問題1

45、、A基因及其生理功能半乳糖甘分子(IPTG)-半乳糖甘酶分解產物(體內積累)-半乳糖甘乙?;D移酶半乳糖甘分子(IPTG)乙酰基2、lac基因產物數量上的比較-半乳糖苷酶:透過酶:乙?;D移酶=1:0.5:0.2翻譯水平上受到調節(jié):(1)lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離,從而終止蛋白質鏈的翻譯;(2)在 lac mRNA分子內部,A基因比Z基因更容易受內切酶作用發(fā)生降解。3、操縱子的融合與基因工程P OZYAtsxPOpur結構基因缺失lac operonpur operonSummarySummary of lac operon regulationGlucose(葡萄糖)(葡

46、萄糖)cAMPLactose (乳糖)(乳糖)Transcription of lac mRNAHighLowPresentlow rate of expressionHighLowAbsentessentially noneLowHighAbsent(停止)(停止)essentially noneLowHighPresenthigh rate of expression (一)乳糖操縱子的結構(一)乳糖操縱子的結構AYZOPI結構基因透酶 半乳糖苷酶調控區(qū)操縱序列啟動序列CAP結合位點調節(jié)基因乙酰轉移酶R (二)阻遏蛋白的負性調節(jié)(二)阻遏蛋白的負性調節(jié)沒有乳糖存在時沒有乳糖存在時AYZOP

47、ImRNA阻遏蛋白RNA pol 有乳糖存在時有乳糖存在時AYZOPI阻遏蛋白mRNA 半乳糖苷酶乳糖半乳糖RNA pol (三)(三)CAPCAP的正性調節(jié)的正性調節(jié)AYZOPI無葡萄糖,cAMP濃度高時CAPcAMPRNA pol 有葡萄糖,cAMP濃度低時AYZOPIRNA polCAP (四)協調調節(jié)(四)協調調節(jié)OOOORNA pol無葡萄糖cAMP濃度高有葡萄糖cAMP濃度低有乳糖無乳糖RNA polRNA polRNA pollac 操縱子小結操縱子小結通常情況(葡萄糖供應正常)阻遏蛋白與操縱序列結合,通常情況(葡萄糖供應正常)阻遏蛋白與操縱序列結合,基因不轉錄?;虿晦D錄。細胞

48、外的乳糖通過透性酶吸收到細胞內;細胞內的細胞外的乳糖通過透性酶吸收到細胞內;細胞內的-半乳半乳糖苷酶將乳糖轉變?yōu)楫惾樘恰.惾樘墙Y合到乳糖阻抑物上糖苷酶將乳糖轉變?yōu)楫惾樘?。異乳糖結合到乳糖阻抑物上使之從操縱序列上脫離,聚合酶迅速開始使之從操縱序列上脫離,聚合酶迅速開始lacZYAlacZYA基因的轉基因的轉錄。這就是負控誘導。錄。這就是負控誘導。然而,還需要細菌生長系統(tǒng)中缺少葡萄糖,使然而,還需要細菌生長系統(tǒng)中缺少葡萄糖,使cAMPcAMP含量增含量增加,才有足夠量的加,才有足夠量的cAMPcAMP與與CRPCRP結合形成結合形成CRP-cAMPCRP-cAMP復合物結合復合物結合于于P Pla

49、c上游。使上游。使DNADNA雙螺旋發(fā)生彎曲,轉錄才可以有效地進雙螺旋發(fā)生彎曲,轉錄才可以有效地進行。行。5.3 色氨酸操縱子(trp operon)內容提要:內容提要: 色氨酸操縱子的結構色氨酸操縱子的結構 色氨酸操縱子的色氨酸操縱子的阻遏系統(tǒng) 色氨酸操縱子的弱化機制Trp operon 生物細胞中的氨基酸合成,生物細胞中的氨基酸合成, 也受操縱元的調節(jié)。細胞需要某種氨基也受操縱元的調節(jié)。細胞需要某種氨基酸時,其基因即表達,不需要時基因關閉,達到經濟的原則。酸時,其基因即表達,不需要時基因關閉,達到經濟的原則。一、色氨酸操縱子的結構一、色氨酸操縱子的結構 調控基因調控基因 結構基因結構基因

50、催化分枝酸轉變?yōu)樯彼岽呋种λ徂D變?yōu)樯彼?的酶的酶trpRtrp trpRtrpR, , 阻遏蛋白阻遏蛋白 P P : -40-40+ +18 18 O O : -21 -21 + +1 1 L L : +1 +1 + +162162 結構基因結構基因t t : A A下游下游36bp, 36bp, 不依賴不依賴p p t t:t t下游下游250bp250bp,依賴,依賴p p 基因組成基因組成 特點: (1) trpR和trpABCDE不連鎖; (2) 操縱基因在啟動子內 (3) 有衰減子(attenuator)/弱化子 (4) 啟動子和結構基因不直接相連,二者被 前導序列(Leade

51、r)所隔開 trpR trpP trpO trpE trpD trpC trpB trpA 蛋白 TrpR(無活性) 活化的 阻遏蛋白 阻遏物 (Trp) 圖 16-27 TrpR 被 Trp 激活后可阻遏trp 操縱子的轉錄 (仿 B.Lewin:GENES,1990, Fig .13.16) 二、trp 操縱子的阻遏系統(tǒng)1 Trp R 四聚體四聚體阻遏蛋白trp 有活性的阻遏物 SNE299trp O 不轉錄不轉錄2 阻遏蛋白的結合位點阻遏蛋白的結合位點 trpO -21 +1,反向重復序列,反向重復序列trpP -40 +18活性阻遏物與活性阻遏物與trpO 的結合與的結合與RNA po

52、l與啟動子的結合發(fā)生競爭與啟動子的結合發(fā)生競爭SNE2993 阻遏系統(tǒng)主管轉錄是否啟動,主管轉錄是否啟動,在缺乏在缺乏Trp時,時, mRNA起始合成,但不起始合成,但不能自動延伸,一般在能自動延伸,一般在trpE之前終止轉錄之前終止轉錄 粗調開關粗調開關Trp 有有Trp 無無TrpmRNA OPtrpR調節(jié)區(qū)調節(jié)區(qū) 結構基因結構基因 RNARNA聚合酶聚合酶 RNARNA聚合酶聚合酶 色氨酸操縱子色氨酸操縱子三、trp 操縱子的弱化機制衰減子(attenuator)/弱化子前導序列(leader sequence)1、弱化子: DNA中可導致轉錄過早終止的一段核甘酸序列(123-150區(qū))

53、。123150 研究引起終止的研究引起終止的mRNAmRNA堿基序列堿基序列,發(fā)現該區(qū)發(fā)現該區(qū)mRNAmRNA通過通過自我配對可以形成自我配對可以形成莖莖- -環(huán)環(huán)結構,有典型的結構,有典型的終止子終止子特點。特點。2、前導序列:在trp mRNA5端trpE基因的起始密碼前一個長162bp的mRNA片段。S312POE4321LDNARNAATGTGA2 trp codons1432前導肽14aa 鄰氨基苯 吲哚甘油 色氨酸合成酶 甲酸合成酶 硼酸合成酶 TrpE terpD trpC trpB trpA t t 啟動子 操縱基因 前導順序 衰減子 pppN26AUGAAAGCAAUUUUC

54、GUACUGAAGGUUGGUGGCGCACUUCCUGAN43A UUUUUUUU 富含 G-C 的發(fā) G C Leader peptide 夾結構 / 富含 C G U 的單鏈末端 C G Aaaaaa C G Met Lys Aly Ile Phe Val Leu Lys Gly Trp Trp Arg Thr Ser A G C C G A C G U U A A 圖 16-28 trp 操縱子含有 5 個結構基因和 1 個控制區(qū)。控制區(qū)由啟動子、操縱基因、前導順序和衰減子構成。前導區(qū)編碼 14 個氨基酸,其中有 2 個是色氨酸。(仿 B.Lewin:GENES,1997, Fig .

55、12.38) 3、弱化機制、弱化機制前導肽前導肽轉錄終止結構轉錄終止結構 轉錄衰減轉錄衰減(attenuation):): 是指轉錄可正常起動,但在轉錄進入是指轉錄可正常起動,但在轉錄進入第一個結構基因前第一個結構基因前即突然停止的過程。即突然停止的過程。由于這一終止作用并由于這一終止作用并不不能使正在進行的能使正在進行的結構基因轉錄中途停止,而僅是結構基因轉錄中途停止,而僅是部分部分中中途停止轉錄,所以稱為途停止轉錄,所以稱為轉錄衰減轉錄衰減。 衰減子衰減子(attenuator):): 操縱子操縱子前導區(qū)前導區(qū)內類似于終止子結構內類似于終止子結構 的一段的一段DNA序列序列,稱為衰減子。其

56、作用,稱為衰減子。其作用 是是減弱減弱操縱子的轉錄。操縱子的轉錄。 ABCDEOPR調節(jié)區(qū)結構基因TrpTrp的RNA衰減的RNA色氨酸操縱子trp L衰減子.轉錄衰減轉錄衰減UUUU34UUUU 334核糖體核糖體 前導肽前導肽 前導前導mRNA1. 1.當色氨酸濃度高時當色氨酸濃度高時 轉錄衰減機制轉錄衰減機制 125 trp 密碼子密碼子 衰減子結構衰減子結構就是終止子就是終止子可使轉錄可使轉錄前導前導DNA UUUU 3 RNARNA聚合酶聚合酶 終止終止UUUU342423UUUU核糖體核糖體 前導肽前導肽 前導前導mRNA 15 trp 密碼子密碼子 結構基因結構基因前導前導DNA

57、 RNARNA聚合酶聚合酶 2. 2.當色氨酸濃度低時當色氨酸濃度低時 Trp合成酶系相關合成酶系相關結構基因被轉錄結構基因被轉錄 序列序列3 3、4 4不能形成衰減子結構不能形成衰減子結構 Low TrpHigh Trp弱化子對轉錄調控的關鍵 空間結構,空間結構,10th and 11th codons encode trp residues (rare AA) 時間,核糖體停頓在時間,核糖體停頓在2個個Trp 密碼子上時,產生延宕,密碼子上時,產生延宕, 此此時時4區(qū)未轉錄出來區(qū)未轉錄出來The leader peptide is to determiner trp availabilit

58、y and to regulate transcription terminationsummary5.3.4 阻遏作用與弱化作用的協調 阻遏效率阻遏效率 啟動子的轉錄起始頻率在啟動子的轉錄起始頻率在R+和和R-相差相差70倍倍 弱化作用弱化作用 trp存在時,約有存在時,約有10的的RNA pol僥幸轉錄僥幸轉錄 - trp 活性阻遏物活性阻遏物 無活性阻遏物無活性阻遏物 +trpNegativerepressible operonNegativerepressible operon可以被最終合成產物所阻遏可以被最終合成產物所阻遏R P O leading seq. E D C B Atrp

59、+為什么需要阻遏體系?為什么需要阻遏體系? 當大量當大量Trp 存在時,阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結存在時,阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結合,阻止先導合,阻止先導mRNA合成。合成。 經濟經濟僅有少量僅有少量 trp時,時,RNApol啟動,啟動,但在但在L.S.處脫落,轉錄中斷處脫落,轉錄中斷R P O leading seq. E D C B A少量少量trp+不足以結合不足以結合 O 位點位點為什么需要弱化系統(tǒng)?為什么需要弱化系統(tǒng)? 當當trp濃度低時,阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性,速度極濃度低時,阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性,速度極慢,不能很快引發(fā)慢,不能很快引發(fā)trp 合成。因此需要一個能快速

60、作出反應合成。因此需要一個能快速作出反應的系統(tǒng),以保持培養(yǎng)基中適當的的系統(tǒng),以保持培養(yǎng)基中適當的Trp水平。水平。5.3.5 細菌演化出弱化系統(tǒng)的生物學意義 通過通過tRNA荷載與否進行調控,更為靈敏荷載與否進行調控,更為靈敏 氨基酸的主要用途是合成蛋白質,因而氨基酸的主要用途是合成蛋白質,因而tRNA 荷載為標準進行調荷載為標準進行調控更為恰當控更為恰當 兩個調控系統(tǒng),避免浪費提高效率兩個調控系統(tǒng),避免浪費提高效率 阻遏系統(tǒng)阻遏系統(tǒng) 高水平高水平trp時,不轉錄時,不轉錄 低水平低水平trp時,轉錄至時,轉錄至LS 弱化系統(tǒng)弱化系統(tǒng) 細調細調 原核生物細致的精細調控機制原核生物細致的精細調控

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