灰色鏈霉菌產(chǎn)鏈霉素匯報(bào)、

1、灰色鏈霉菌產(chǎn)鏈霉素灰色鏈霉菌產(chǎn)鏈霉素2021-12-72實(shí)驗(yàn)背景實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)論討論ABCDEContents目目錄錄2021-12-73一、實(shí)驗(yàn)背景一、實(shí)驗(yàn)背景 灰色鏈霉菌是一種放線菌，而高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基是一種合成培養(yǎng)基，可用于培養(yǎng)放線菌。種子擴(kuò)大培養(yǎng)是發(fā)酵工程的一個(gè)組成部分，指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。 種子擴(kuò)培的一般過程是： 斜面菌種 一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶） 二級(jí)種子培養(yǎng)(種子罐) 發(fā)酵。根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和檢品兩者對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌圈大小

2、來(lái)測(cè)定供試品的效價(jià)。 2021-12-74二、實(shí)驗(yàn)方法二、實(shí)驗(yàn)方法1、灰色鏈霉菌的活化1.1 培養(yǎng)基的制備本實(shí)驗(yàn)原計(jì)劃采用高氏培養(yǎng)基活化菌種，后因效果不佳，改用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。因此制備PDA培養(yǎng)基。1.2 斜面接種1) 左手拿試管菌種，右手拿接種環(huán)，先將金屬環(huán)燒灼滅菌，再將接種環(huán)在空白培養(yǎng)基處冷卻，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻2021-12-752) 左手將試管菌種放下，拿起斜面培養(yǎng)基。在火焰旁用右手小指和手掌邊緣拔下棉塞并夾緊，迅速將接種環(huán)伸入空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時(shí)由底部向上劃一直線，一直劃到斜面的頂部。注意勿將培養(yǎng)基劃破，不要使菌體沾污管壁。3）灼燒試管

3、口，在火焰旁將棉塞塞上。接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須灼燒滅菌后才能放下。4）斜面置于28恒溫箱中，培養(yǎng)23d觀察結(jié)果。2021-12-762、種子液的制備將活化的菌種斜面，在無(wú)菌的條件下，注入10mL無(wú)菌水，震蕩成孢子懸浮液（孢子濃度約為8104個(gè)/mL）。待發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后冷卻到28時(shí)，分別將孢子懸浮液接入三角瓶中，接種量為2mL，標(biāo)記。28、200r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24h，觀察菌絲體形態(tài)及濃度。3、搖瓶大量發(fā)酵待發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml）滅菌后冷卻到30時(shí)，按接種量8%-10%進(jìn)行接種，即每個(gè)發(fā)酵瓶加入5ml種子液。32、100r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中，補(bǔ)加滅菌尿素以增

4、加氮源，維持pH值。2021-12-774、枯草芽孢桿菌的活化將配制好的蛋白胨牛肉膏培養(yǎng)基斜面接種枯草芽孢桿菌，方法同灰色鏈霉菌活化方法相同。28培養(yǎng)24h。5、鏈霉素活性的鑒定5.1 枯草芽孢桿菌懸液制備加入1ml生理鹽水于枯草芽孢桿菌斜面中，輕輕沖下菌落，取至新的滅菌的1.5mlEP管內(nèi)，備用。5.2 枯草芽孢桿菌懸液的稀釋用生理鹽水將懸液分別稀釋5倍和10倍，備用。2021-12-785.3 涂平板將制備好的不同濃度的枯草芽孢桿菌懸液涂布于4個(gè)制備好的LB平板，濃度分別為原液、5倍、10倍，第4個(gè)平板作為陽(yáng)性對(duì)照，懸液濃度為原液。5.4 打孔將涂布好的平板用1ml槍頭打3個(gè)孔，孔徑光滑均

5、一。5.5 加樣將發(fā)酵液取10ml于10mlEP管內(nèi)，2000r/mim離心5min，取上清加于每個(gè)孔內(nèi)，加滿為止，但不能溢出。陽(yáng)性對(duì)照的孔內(nèi)加入一定濃度的鏈霉素液。37培養(yǎng)12h，觀察抑菌效果。2021-12-79實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備1、實(shí)驗(yàn)器材天 平 、 5 0 0 m L 刻 度 量 杯 、 小 刀 、 牛 角 匙 、 玻 棒 、 紗 布 、18mL180mL試管、棉花、電爐、燒杯、報(bào)紙、記號(hào)筆、酒精燈、接種環(huán)、250/500ml三角瓶、棉花、電爐、燒杯、記號(hào)筆、酒精燈、接種環(huán)、涂布棒、旋轉(zhuǎn)式搖床、4冰箱、37孵箱、各型號(hào)移液槍及槍頭、超凈工作臺(tái)等。2021-12-7102、斜面

6、培養(yǎng)基的制備2.1 高氏培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，硝酸鉀1 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20 g，水1000毫升，PH7.27.4（配制時(shí)注意，可溶性淀粉要先用冷水調(diào)勻后再加入到以上培養(yǎng)基中）。2.2 PDA培養(yǎng)基：淀粉含量高的土豆、葡萄糖、瓊脂。將土豆切成小塊，煮爛用紗布濾出土豆汁。將1000ml的土豆汁中加入葡萄糖20g，瓊脂15-20g。2021-12-7112.3 種子液的制備豆餅粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸銨3g，硫酸鎂0.25g，磷酸二氫鉀0.2g，碳酸鈣4g，自來(lái)水1000mL、pH7.2-7.4。

7、2.4 發(fā)酵液的制備水解糖160g、尿素5g（單獨(dú)滅菌）、MgSO40.5g、Na2HPO41.6g、玉米漿2535g、FeSO4和MnSO4各20mg/L，消泡劑0.3g，水1000mL， pH7.2。2021-12-712三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、灰色鏈霉菌的活化管中可見成片白色菌落，并且管底含有水。2021-12-7132、種子液的制備2021-12-7143、鏈霉菌的發(fā)酵2021-12-7154、枯草芽孢桿菌活化由于斜面培養(yǎng)基太軟，劃線的時(shí)候破壞了培養(yǎng)基，菌落也成片。2021-12-7165、鏈霉素的活性鑒定測(cè)得抑菌圈直徑為1.2cm1.2cm,1.4cm平均值為1.27cm枯草芽孢

8、桿菌原液涂板所得抑菌圈圖片枯草芽孢桿菌原液涂板所得抑菌圈圖片2021-12-717枯草芽孢桿菌稀釋五倍涂板所得抑菌圈枯草芽孢桿菌稀釋五倍涂板所得抑菌圈圖片圖片測(cè)得抑菌圈直徑為1.7cm，1.4cm,1.5cm平均值為1.53cm5、鏈霉素的活性鑒定2021-12-718測(cè)得抑菌圈直徑為1.8cm，1.4cm,1.5cm平均值為1.57cm枯草芽孢桿菌稀釋十倍涂板所得抑菌枯草芽孢桿菌稀釋十倍涂板所得抑菌圈圖片圈圖片5、鏈霉素的活性鑒定2021-12-719陽(yáng)性對(duì)照，枯草芽孢桿菌原液涂板所得圖片陽(yáng)性對(duì)照，枯草芽孢桿菌原液涂板所得圖片平板上未見預(yù)期結(jié)果，即透明的抑菌圈，培養(yǎng)基上也未長(zhǎng)菌。5、鏈霉素的活性鑒定2021-12-720四、結(jié)論四、結(jié)論通過活化灰色鏈霉菌并將其大量發(fā)酵，離心獲取產(chǎn)物即鏈霉素；通過打孔加入鏈霉素，觀察其抑菌圈大小判斷鏈霉素的效價(jià)，可評(píng)價(jià)制得鏈霉素的活性。2021-12-721五、討論五、討論1、由于考慮到鏈霉素的抑菌效果，我組采用不同倍數(shù)稀釋的枯草芽孢