硅膠柱層析分離的實(shí)驗(yàn)原理、方法與技巧

1、硅膠柱層析分離的實(shí)驗(yàn)原理、方法與技巧一、硅膠柱層析原理硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得 到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物 質(zhì)不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸 過程。硅膠柱層析流動相極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：氯仿系 統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；拖尾可以加入少量氨 水或冰醋酸硅膠柱層析慣用方法1. 稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分， 也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱 40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。2. 攪成勻漿。加入干

2、硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑 是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水 量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話， 必須預(yù)先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。3. 裝柱。將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約 1/3體積石油 醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi) 隨著沉降，會有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚（氯仿）將其沖入 柱中。4. 壓實(shí)。沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓， 直至流速

3、恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱， 都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床 萎縮產(chǎn)生開裂。5上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些 洗脫劑，再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅膠表面。 然后就可以放心地加入 大量洗脫劑，而不會沖壞硅膠表面。6. 過柱和收集。柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低 的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子： 10mg上樣量， 1g硅膠H, 0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目）, 20-50ml收一餾分。7. 檢測。要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會損失較 多產(chǎn)品，紫外的

4、靈敏度一般比噴顯劑底 1-2個數(shù)量級。8. 送譜。收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少 或?yàn)橐后w，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段。可除去氫 譜1.5ppm左右所謂的 硅膠”峰。、柱層析分離的實(shí)驗(yàn)方法和技巧常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離， 也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由于柱分的經(jīng)驗(yàn)成分太多，所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得，希望能有所幫助。一：柱子可以分為：加壓，常壓，減壓壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會 減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的， 但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾

5、個月也是有 的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但 是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā) （有時在柱子外面有水汽凝 結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用 水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。以前曾經(jīng)大量的過減壓柱， 對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓后，就幾乎再也沒動過 減壓的念頭了。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使 淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給 魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不 可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。 個人覺得加壓柱在普 通的有機(jī)化合物

6、的分離中是比較適用的。二：關(guān)于柱子的尺寸應(yīng)該是粗長的最好。柱子長了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了， 上樣后樣品的原點(diǎn)就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^薄） ，這樣相 對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米， 那么分離的難度可想而知， 恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。 而如 果樣品層只有 0.5 厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。 當(dāng) 然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了， 不過這些成本相對 于產(chǎn)品來說也許就不算什么了 （有些不環(huán)保的說， 不過溶劑回收重蒸 后也就減小了部分浪費(fèi)） ?，F(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在 1 : 510，書中寫硅膠量是樣品 量的3040倍，具體

7、的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的 比較開（是指在所需組分 rf 在 0.20.4，雜質(zhì)相差 0.1 以上），就可 以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cmK 20cm的柱 子）；如果相差不到 0.1 ，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直 徑，比如用 3cm 的，也可以減小淋洗劑的極性等等。三：關(guān)于無水無氧柱 適用于對氧，水敏感，易分解的產(chǎn)品，可以濕柱，也可以干柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次， 因?yàn)槿軇┖凸枘z飽和 時放出的熱量有可能是產(chǎn)品分解， 畢竟要分離的是敏感的東東， 小心 不為過。也是因?yàn)榉蛛x的東西比較敏感， 所以接收瓶一定要用可密封 的，遵循 schl

8、enk 操作。至于是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因 為是 schlenk 操作，所以點(diǎn)板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜 了，不用點(diǎn)板，直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好準(zhǔn) 備幾十個 schlenk 瓶，一瓶一瓶的點(diǎn)，不過幾次之后就知道樣品在 哪，也就可以省些了。像我以前過一根無水無氧柱，需要六個 schlenk ，現(xiàn)在只一個就能把所要的全收集到。無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。 因?yàn)楣枘z中有 大量的羥基裸露在外， 很容易是樣品分解， 特別是金屬有機(jī)化合物和 含磷化合物。 而氧化鋁可以做成堿性、 中性和酸性的， 選擇余地比較 大，但是比硅膠要貴些。聽說有個方法，就是用石英

9、做柱子，然后用 HF254 做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產(chǎn)品在哪里 了，沒有驗(yàn)證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。四：關(guān)于濕法、干法上樣濕法省事， 一般用淋洗劑溶解樣品， 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙 酯等， 但溶劑越少越好， 不然溶劑就成了淋洗劑了。 很多樣品在上柱 前是粘乎乎的， 一般沒關(guān)系。 可是有的上樣后在硅膠上又會析出， 這 一般都是比較大量的樣品才會出現(xiàn)，是因?yàn)楣枘z對樣品的吸附飽和， 而樣品本身又是比較好的固體才會發(fā)生， 這就應(yīng)該先重結(jié)晶， 得到大 部分的產(chǎn)品后再柱分， 如果不能重結(jié)晶， 那就不管它了， 直接過就是 了，樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。有些樣品溶解性差，

10、能溶解的溶劑又不能上柱 （比如 DMF,DMSO 等， 會隨著溶劑一起走，顯色是一個很長的脫尾） ，這時就必須用干法上 柱了。樣品和硅膠的量有一種說法是 1： 1，我覺得是越少越好，但 是要保證在旋干后， 不能看到明顯的固體顆粒 （那說明有的樣品沒有吸附在硅膠上）。五：溶劑的選擇當(dāng)然是最便宜，最安全，最環(huán)保的了。所以大多選用石油醚，乙 酸乙酯。 文獻(xiàn)中有寫用正己烷的， 太貴了， 除非特別需要不要用不然 銀子嘩嘩的， 流的比淋洗劑還快， 不過因?yàn)闃O性很小， 有時還是非它 不可。乙醚也可以用， 但是就是容易睡覺， 注意保持清醒別讓溶劑流 干了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和

11、 硅膠的吸附是一個放熱過程， 所以夏天的時候經(jīng)常會在柱子里產(chǎn)生氣 泡，天氣冷的時候會好一些。 甲醇據(jù)說能溶解部分的硅膠， 所以產(chǎn)品 如果想過元素分析的話要留神， 應(yīng)該經(jīng)過后繼處理， 比如說重結(jié)晶等。 其他的溶劑用的相對較少，要依個人的不同需要選擇了。 由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛） ，我們這里是 用 10 升或 25 升的塑料桶裝的，就要注意這些工業(yè)品的純度是較低 的。經(jīng)常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質(zhì)， 其他的雜質(zhì)就可想 而知了，所以在比較嚴(yán)格的柱分時就要對溶劑重蒸。 當(dāng)然過原料時就 可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。另外溶劑在過柱子后最好也回收使用， 一方面環(huán)

12、保， 另一方面也 能節(jié)省部分經(jīng)費(fèi)， 缺點(diǎn)是要消耗一定的人工。 這里要注意的是， 一般 在過柱同時進(jìn)行的是減壓旋蒸， 石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度 的不同會導(dǎo)致極性的變化， 一般會使得極性變大， 在梯度淋洗時比較 合適，正好極性越來越大了。 在過完柱子后， 溶劑最后回收要采用常 壓，因?yàn)樵跍p壓旋蒸時會有部分低沸點(diǎn)的雜質(zhì)一起出來， 常壓時就會 減少這種現(xiàn)象，如果雜質(zhì)和你下面要過的樣品有反應(yīng)那就慘了。六：關(guān)于操作問題1、裝柱柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑，會被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的， 可以采用四氟節(jié)門的。 干法和濕法裝柱覺得沒什么區(qū)別， 只要能把柱 子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密（太密了淋洗

13、劑走的太 慢），一定要均勻 （不然樣品就會從一側(cè)斜著下來） 。書中寫的都是不 能見到氣泡， 我覺得在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒太大的影響， 一加 壓氣泡就全下來了。當(dāng)然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練 習(xí)了。但是柱子更忌諱的是開裂， 甭管豎的還是橫的， 都會影響分離 效果，甚至作廢！2、加樣用少量的溶劑溶樣品加樣， 加完后將下面的活塞打開， 待溶劑層 下降至石英砂面時， 再加少量的低極性溶劑， 然后再打開活塞， 如此 兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。 加入淋洗劑， 一開始不要加 壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（24cm就夠了），再加 壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速

14、下行。3、淋洗劑的選擇 感覺上要使所需點(diǎn)在rf0.20.3左右的比較好。不要認(rèn)為在板上爬高 了分的比較開，過柱子就用那種極性，如果 rf 在 0.6，即使相差 0.2 也不容易在柱子上分開， 因?yàn)橹邮且粋€多次爬板的狀態(tài)， 可以通過 公式的比較： 0.6/0.8 一次的分離度，肯定不如（ 0.2/0.3）的三次方 或四次方大。4、樣品的收集用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。 所以如 果樣品與硅膠的吸附比較強(qiáng)的話， 就不容易流出。 這樣就會發(fā)生， 后 面的點(diǎn)先出，而前面的點(diǎn)后出。 這時可以采用氧化鋁作固定相。 另外， 收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管， 可能一根就收到了三個樣品， wuwu 。如果都用小試管那工作量又太 大。5、最后的處理柱分后的產(chǎn)品， 由于使用了大量的溶劑， 其中的雜質(zhì)也會累積到 產(chǎn)品中，所以如果想送分析， 最好用少量的溶劑洗滌一下， 因?yàn)榇蟛?分的雜質(zhì)是溶在溶劑里的，一洗基本就沒了，必要時進(jìn)行重結(jié)晶