中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)課件

1、中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 第一節(jié) 化學(xué)分析法 第二節(jié) 儀器分析法 第三節(jié) 其它分析法中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 一、重量分析法 二、滴定分析法中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)重量分析法是采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ勾郎y組分從樣品中分離出來，并轉(zhuǎn)化為稱量形式，根據(jù)稱量形式的重量感，計(jì)算待測組分含量的方法。重量分析法可分為揮發(fā)法，萃取法和沉淀法。1. 揮發(fā)法揮發(fā)法 又叫氣化或干燥法，可測定具有揮發(fā)性或能定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)的組分含量，如中國藥典規(guī)定藥物純度檢查項(xiàng)目中水分測定(烘干法)，灰分的測定，浸出物的測定，炙灼殘?jiān)臏y定，干燥失重的測定都是揮發(fā)法。2. 萃取法萃取法 又稱提取法或

2、抽取法，是根據(jù)被測組分在互不相溶的兩相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。如2005版中國藥典收載的地奧心血康膠囊中甾體總皂苷的含量測定、昆明山海棠片中總生物堿的含量測定、豬膽汁中的豬膽汁酸的含量、姜流浸膏中醚溶性物質(zhì)的重量測定均采用萃取法。3. 沉淀法沉淀法 是將被測組分定量轉(zhuǎn)化為難溶化合物，以沉淀的形式從溶液中分離出來，經(jīng)過濾過，洗滌。干燥后，轉(zhuǎn)化為稱量形式，稱取重量，測定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分，如2005版中國藥典中西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 滴定分析法是將已知準(zhǔn)確濃度的試劑溶液，滴加到待測組分濃度和消耗的體積，計(jì)算待測組分含量的方

3、法. 滴定分析法對化學(xué)反應(yīng)的要求：反應(yīng)要定量進(jìn)行，一般要達(dá)到99.9；反應(yīng)要迅速，在滴定過程瞬間既可完成；有簡便可靠的方法判定化學(xué)計(jì)量點(diǎn)，即有適宜的指示劑可供選用；不能有干擾雜質(zhì)存在. 滴定分析法分為酸堿滴定法，沉淀滴定法，配位滴定法和氧化還原滴定法等。多數(shù)滴定分析在水溶中進(jìn)行，當(dāng)被測物質(zhì)因在水中溶解度小或其他原因不能以水為溶劑時(shí)，也采用非水溶劑為滴定介質(zhì)。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)1. 酸堿滴定法酸堿滴定法 又叫中和滴定，適用于測定中藥制劑中所含的生物堿、有機(jī)酸類組分的含量。對于KC10-8的酸、堿組分，可在水溶液中直接確定。如200版中國藥典收載的止喘靈注射液、北豆根片、顛茄酊中

4、生物堿的含量測定。而對于KC10-8的弱有機(jī)酸、生物堿或水中溶解度很小的酸，堿，只能采用間接滴定或非水滴定法測定。如環(huán)維黃楊星D中總生物堿的含量測定為非水滴定法。2. 沉淀滴定法沉淀滴定法 分為銀量法、四苯硼鈉法和亞鐵氰化鉀等，是以沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定方法. 實(shí)質(zhì)就是離子和離子形成難溶性的鹽. 在中藥制劑分析中主要用于測定生物堿、生物堿的氫鹵酸鹽及含鹵素的其他有機(jī)成分的含量。最常用的是銀量法，3. 氧化還原滴定法氧化還原滴定法 適用于測定具有氧化還原性的物質(zhì)，如含酚類、糖類及含F(xiàn)e、As等成分的中藥制劑。可分為碘量法，高錳酸鉀法和亞硝酸鈉法等. 如200版中國藥典收載的牛黃解毒片、小兒驚風(fēng)散中

5、雄黃的含量測定，采用的是碘量法。4. 配位滴定法配位滴定法 是以配位反應(yīng)為基礎(chǔ)的一種滴定方法. 包括EDTA法和硫氰酸銨法等，在中藥制劑分析中，用以測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量。如200版中國藥典收載的如萬氏牛黃清心丸、小兒金丹片、冰硼散中朱砂的含量測定。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) （三）應(yīng)用實(shí)例（三）應(yīng)用實(shí)例 1. 西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定 取本品60片，精密稱定，研細(xì)，混勻，取約18g，精密稱定，加水150ml，振搖10分鐘，離心，濾過，沉淀物用水50ml分三次洗滌、離心、濾過，合并濾液，加鹽酸1ml，煮沸

6、，不斷攪拌，并緩緩加入熱氯化鋇試液使沉淀完全，置水浴上加熱30分鐘，靜置1小時(shí)，用無灰濾紙或已稱定重量的古氏坩堝濾過，沉淀用水分次洗滌，至洗液不再顯氯化物的反應(yīng)，干燥，并熾灼至恒重，精密稱定，與0.6086相乘，計(jì)算，即得。 本品每片含西瓜霜以硫酸鈉(Na2SO4)計(jì)，小片應(yīng)為11.513.5mg，大片應(yīng)為23.027.0mg.中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)2. 九一散九一散取本品約2g，精密稱定，加稀硝酸25ml，待紅粉溶解后，濾過，濾渣用水約80ml，分次洗滌，合并洗液與濾液，加硫酸鐵銨指示液2ml，用硫氰銨滴定液(0.1mol/L)，滴定，每1ml硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)

7、相當(dāng)于10.83mg的氧化汞(HgO)。本品每含紅粉以氧化汞計(jì)，應(yīng)為90110mg。3. 昆明山海棠片的含量測定昆明山海棠片的含量測定取本品60片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約相當(dāng)于25片的量，精密稱定，置200ml錐瓶中，加適量硅藻士(每1g中加入硅藻士0.2g)，混勻，加乙醇70ml加熱回流40分鐘，放冷，過濾，濾渣加乙醇50ml。加熱回流30分鐘，放冷濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘?jiān)欲}酸溶液(1100)30ml置水浴上攪拌使溶解，放冷，濾過，殘?jiān)欲}酸溶液(1200)同法提取3次(50ml，15ml，15ml)，合并濾液于分液漏斗中，加氨試液使溶液呈堿性，用乙醚振搖提取4次(40m

8、l，30ml，25ml，20ml)，合并乙醚液用水振搖洗滌2次，每次10ml， 乙醚液濾過，濾液置已100在干燥恒重的蒸發(fā)皿中，在低溫水浴上蒸去乙醚， 殘?jiān)锛由僭S無水乙醇，蒸干在，在100干燥至恒重，稱定重量，計(jì)算，即得。本品每片含總生物堿不得少于1.0mg。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 一、HPLC 二、GC 三、TLCS 四、毛細(xì)管電泳法 五、UV-VIR 六、AAS中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)（一）基本原理（一）基本原理1. 塔板理論塔板理論 用于計(jì)算理論塔板數(shù)及理論塔板高度，衡量色譜柱的柱效。在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，其理論塔板數(shù)不得低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論塔板數(shù)。n

9、5.54( )2 HL/n2. 速率理論速率理論 液相色譜與氣相色譜的速率理論方程式的主要差別表現(xiàn)在縱向擴(kuò)散項(xiàng)(B/u)和傳質(zhì)阻抗項(xiàng)(C)上。在HPLC中流動(dòng)相為液體。粘度大柱溫低，擴(kuò)散系數(shù)Dm、很小，因此縱向擴(kuò)散項(xiàng)B/M可忽略不計(jì)，其速率方程式為：HACMCCmCsmCs式中Cm、Csm、Cs分別是組分在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)阻抗系數(shù)。對于化學(xué)鍵合相色譜，“固定液”是被鍵合在載體表面的單分子層，Cs0，則CCmCsm。在HPLC中，當(dāng)流動(dòng)相的線速度大于lcm/s時(shí)，可近似認(rèn)為流動(dòng)相的流速與板高成直線關(guān)系，為兼顧柱效與分析速度，一般都采用較低流速。內(nèi)徑24.6mm的色譜柱，多采用1

10、ml/min。2/1WtR中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)（二）（二）HPLC實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇1. 色譜柱的選擇色譜柱的選擇 色譜柱由柱管和固定相組成，按其用途分為分析型和制備型。高效液相色譜柱的填充常采用勻漿高壓(600l000kg/cm2)裝柱，適用于粒徑20m以下的硅膠、堆積硅珠、化學(xué)鍵合相等填料(固定相)的裝柱。色譜柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，目前大部分實(shí)驗(yàn)室都使用已填充好的商品柱。色譜柱的選擇雖無明確規(guī)律可循，但大多數(shù)藥物可用C18反相(ODS)柱加以分離測定。在建立HPLC分離方法時(shí)可先試用反相柱，不行再改用正相分配色譜柱(氨基柱、氰基柱)或硅膠吸附色譜校等。對于解離藥物可

11、用離子對色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測定；對于脂溶性的藥物異構(gòu)體的分離測定可采用硅膠吸附色譜柱。具體選擇時(shí)應(yīng)考慮被分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解度等因素。2. 流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇 在液相色譜中，可供選擇的流動(dòng)相的范圍較寬，且還可組成多元溶劑系統(tǒng)與不同配比；在固定相一定時(shí)，流動(dòng)相的種類、配比、pH值及添加劑等能顯著影響分離效果，因此HPLC中流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 反相鍵合相色譜的流動(dòng)相常選用下述三種；部分含水溶劑：以水為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量可與水互溶的有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑(如甲醇、乙脂、四氫呋喃)，有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)及其與水的比例對保留值和分離選

12、擇性有影響。適用于分離中等極性、弱極性藥物，常用甲醇水、乙水系統(tǒng)。非水溶劑：用于分離疏水性物質(zhì)，尤其在柱填料表面鍵合的十八烷基硅量較大時(shí)，固定相對疏水化合物有異常的保留能力，需用有機(jī)溶劑，可在乙脂或中加入二氯甲烷或四氫映哺(稱非水反相色譜)。緩沖溶液：適用于可溶于水并具可解離特性的化合物，如蛋白質(zhì)、肽及弱酸、弱堿類化合物。緩沖液及其pH不同會影響組分的保留值，常用的緩沖液有三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液，選用的pH應(yīng)使溶質(zhì)盡可能成為非解離形式，使固定相有較大保留能力(反相離子抑制色譜)。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)正相鍵合相色譜的流動(dòng)相通常采用飽和烷烴(如正己烷)中加入一種極性較大的

13、溶劑為極性調(diào)節(jié)劑(如異丙醚)，通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度來改變?nèi)軇?qiáng)度，常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)，并可以薄層色譜(TLC)為先導(dǎo)來探索合適的流動(dòng)相。反相離子對色譜的流動(dòng)相為極性較強(qiáng)的水系統(tǒng)混合溶劑，最常用的是甲醇水、乙脂水中加入0.0030.01mol/L的離子對試劑，調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑的比例使組分A值在適宜范圍c離子對試劑的性質(zhì)和濃度、流動(dòng)相的pH值及流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的性質(zhì)和比例都會影響組分的保留值和分離的選擇性。3. 洗脫方式洗脫方式 HPLC按其洗脫方式分為等度洗脫與梯度洗脫。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相的組成保持恒定，使所有組分的k值都處于這個(gè)范圍內(nèi)，適用于組分?jǐn)?shù)較少、性質(zhì)差別不大的樣

14、品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成(如溶劑極性、離子強(qiáng)度和pH值等)，適用于分析組分?jǐn)?shù)多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物樣品，從而使所有組分都在適宜條件下獲得分離。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 4. 檢測器檢測器 (1)紫外檢測器紫外檢測器(UV或或UVD)：紫外檢測器是HPLC應(yīng)用最普遍的檢測器，靈敏度較高，呢噪音低，最低檢出量可達(dá)l0-710-12g，線性范圍寬，對流速和溫度波動(dòng)不靈敏，可用于梯度洗脫，但只能用于檢測有紫外吸收的物質(zhì)，且流動(dòng)相的選擇有一定限制，流動(dòng)相的截止波長必須小于檢測波長。 目前應(yīng)用的紫外檢測器主要有可變波長型檢測器和二極管陣列檢測器。二極管陣列檢測器

15、是一種光學(xué)多通道檢測器，一般一個(gè)二極管對應(yīng)接收光譜上一個(gè)納米增帶寬的單色光。用二極管陣列裝置能對色譜峰用不同波長進(jìn)行紫外掃描，獲得吸收度波長時(shí)間三維光譜色譜圖，同時(shí)得到定性、定量信息，在體內(nèi)藥物分析和中藥成分分析中都有廣泛應(yīng)用。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) (2)熒光檢測器熒光檢測器(FD)：熒光檢測器靈敏度比紫外檢測器高，但只適用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì)，主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合物及酶等，檢測限可達(dá)110-10g/ml由于熒光檢測器的高靈敏度和選擇性，是體內(nèi)藥物分析常用的檢測器之一。 (3)蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)：蒸發(fā)光散射檢測器是

16、一種通用型檢測器，理論上這種檢測器可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分，主要用于檢測糖類、高分子化合物、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十類化合物。但對有紫外線吸收的樣品組分檢測靈敏度比UVD低，且只適用于流動(dòng)相能揮發(fā)的色譜洗脫，不能用含緩沖鹽的流動(dòng)相(因?yàn)辂}不揮發(fā)。形成高本底而影響檢測)。如需用抑制色譜，只能選擇揮發(fā)性的抑制劑如氨水、醋酸等。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) (4)電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器(ECD)：電化學(xué)檢測器包括極譜、庫侖、安培和電導(dǎo)檢測器。電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜，前三種統(tǒng)稱伏安檢測器，用于能氧化、還原的有機(jī)物質(zhì)的檢測。其中，安培檢測器的應(yīng)用最

17、廣泛，對有機(jī)還原性物質(zhì)的檢測限可達(dá)110-12g/ml，靈敏度很高，尤其適用于痕量組分的分析，但不能檢測不能氧化、還原的物質(zhì)。 (5)示差折光檢測器示差折光檢測器(RID)：示差折光檢測器是一種通用型檢測器，利用組分與流動(dòng)相折射率之差進(jìn)行檢測。該檢測器對多數(shù)物質(zhì)的靈敏度低(約l0g/ml)，通常不能用于痕量分析，但其穩(wěn)定性好，操作方便。對少數(shù)物質(zhì)檢測靈敏度較高，尤其適合于糖類的檢測，檢測限可達(dá)10-8g/ml。這類檢測器的缺點(diǎn)是靈敏度低，受環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成等波動(dòng)的影響大，不適合梯度洗脫。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)5. HPLC前處理前處理(1)流動(dòng)相的處理流動(dòng)相的處理溶劑的純化

18、：溶劑的純化：選擇專供色譜分析用的“色譜純”溶劑，分析純或優(yōu)級純?nèi)軇┰诤芏嗲闆r下也可滿足色譜分析的要求。出于不同的色譜柱和檢測方法對溶劑的要求不向，有時(shí)需進(jìn)行除去紫外雜質(zhì)、脫水、重蒸等純化操作。水一般采用石英系統(tǒng)二次蒸餾水。流動(dòng)相脫氣：流動(dòng)相脫氣：由于空氣和溶劑進(jìn)入色譜柱高壓系統(tǒng)形成氣泡會干擾檢測器通路的折射面，空氣中的氧會與色譜柱填料和流動(dòng)相發(fā)生反應(yīng)；HPLC所用的流動(dòng)相必須預(yù)先除去其中的空氣，習(xí)稱脫氣，一般在臨用前對流動(dòng)相進(jìn)行脫氣，常用的脫氣法有超聲波振蕩服氣、惰性氣體(He)鼓泡吹掃脫氣、抽真空和加熱脫氣法。超聲脫氣法是將盛有流動(dòng)相的容器置于超聲水浴中，超聲振蕩約15分鐘。超聲脫氣法比較

19、簡便，基本上能滿足日常分析的要求，是目前用得最多的脫氣方法。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)過濾：過濾：過濾是為了防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是過濾，采用0.45m以下微孔濾膜過濾。濾膜分有機(jī)溶劑專用和水溶液專用兩種。(2)樣品的處理：樣品的處理：HPLC分析前需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，以便將待測物質(zhì)有效地從樣品基質(zhì)中釋放出來，制備成便于HPLC分析測定的穩(wěn)定試樣；除去雜質(zhì)，純化樣品；濃縮樣品或進(jìn)行衍生化；使樣品的形式及所用溶劑符合HPLC的要求。(3)緩沖溶液的處理緩沖溶液的處理：磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液

20、是霉菌生長的很好基質(zhì)它會堵塞色譜柱和系統(tǒng)，通常為避免霉菌生長，盡量使用新配的緩沖溶液，必要時(shí)可放在冰箱內(nèi)煮存，另外貯液器應(yīng)定期用酸、水清洗，特別是盛水和緩沖液的瓶子，很易發(fā)霉。盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象，因甲醇有防腐作用。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) （三）（三）HPLC法分類及方法法分類及方法 液液分配色譜是中藥制劑分析中應(yīng)用最廣泛的方法，根據(jù)固定相與流動(dòng)相的極性差別，分為正相色譜和反相色譜兩類。流動(dòng)相極性小于固定相極性的分配色譜法稱為正相色譜，主要用于極件物質(zhì)的分離測定；流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相色譜，主要用于非極性、中等極性物質(zhì)的分離測定o 1. 鍵合相色譜法鍵合相色

21、譜法 化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為鍵合相色譜法，是由液-液分配色譜發(fā)展而來，其分離機(jī)制以分配作用為主，對不封尾的鍵合相還有一定的吸附作用。鍵合相色譜法是應(yīng)用最廣泛的色譜法，已廣泛用于正相與反相色譜法、離子抑制色譜法、離子對色譜法、離子交換色譜法等。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) (1)反相鍵合相色譜法：反相鍵合相色譜法：2005版中國藥典一部共收載338個(gè)制劑品種的HPLC含量測定。均為以O(shè)DS為固定相的反相鍵合相色譜法。反相鍵合相色譜法適用于分離分析非極性與中等極性的化合物，如中藥制劑中黃芩、白芍、大黃、淫羊藿、丹參、厚樸、葛根等的含量測定。離子型或可離子化的化合物可采用特殊的反相色

22、譜技術(shù)分離，如反相離子抑制色譜和反相離子對色譜等。反相色譜法一般采用非極性鍵合相，十八烷基鍵合相(簡稱ODS或C18)是最常用的非極性固定相，對于各種類型的化合物都有較強(qiáng)的適應(yīng)能力；短鏈烷基鍵合相可用于極性物質(zhì)的分離、而苯基鍵合相則適用于分離芳香化合物。流動(dòng)相通常以水為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量能與水互溶的極性調(diào)整劑，常用的有甲醇水、乙腈水系統(tǒng)。一般情況下，甲醇水系統(tǒng)能滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動(dòng)相粘度小，價(jià)格低，是反相鍵合相色譜最常用的流動(dòng)相。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)(2)正相鍵合相色譜法：正相鍵合相色譜法：正相鍵合相色譜法主要用于分離分析溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)。

23、氰基(-CN)、氨基(-NHz)和二醇基鍵合相是正相色譜常用的極性鍵合相。流動(dòng)相通常用烷烴(常用正己烷)加適量極性調(diào)整劑構(gòu)成。氰基鍵合相的分離選擇性與硅膠相似，對雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好選擇性，許多需用硅膠柱分離的樣品可用氰基鍵合相柱完成。氨基鍵合相則具有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力，對某些多官能團(tuán)化合物如甾體、強(qiáng)心苷等有較好的分離能力，氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子的羥基產(chǎn)生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，氨基柱常被用作分析糖類的專用色譜柱。但氨基柱不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因它們之間會發(fā)生反應(yīng)，生成Schiff堿。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋

24、白質(zhì)。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)(3)離子對色譜法：離子對色譜法：直接將離子對試劑加入到流動(dòng)相中，用以分離離子型或可離子化化合物的方法稱為離子對色譜法(PIC或IPC)。該法可分為正相離子對色譜法和反相離子對色譜法，但近年來廣泛應(yīng)用的幾乎都是反相離子對色譜法，故本書只介紹反相離子對色譜法。反相離子對色譜法是一種特殊的反相色譜技術(shù)，通常以C18或C8鍵合相為固定相，用含離子對試劑的有機(jī)溶媒水溶液為流動(dòng)相，適用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離，以及用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離。在中藥制劑分析中反相離子對色譜法的應(yīng)用非常廣泛，如生物堿、有機(jī)酸的分折。但離子對試劑價(jià)格較貴是其缺點(diǎn)

25、。分離條件的選擇：分離條件的選擇：離子對試劑的選擇：離子對試劑的選擇：通常所選用離子對試劑的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反。分折堿類或帶正電荷的物質(zhì)，常用帶負(fù)電荷的烷基磺酸鹽或硫酸鹽作為離子對試劑；分析酸類或帶負(fù)電荷的物質(zhì)，常用帶正電荷的季銨鹽作為離子對試劑；表4l列出了常用的離子對試劑及主要應(yīng)用對象。離子對試劑的濃度一股在3l0mol/L范圍內(nèi)。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 流動(dòng)相流動(dòng)相pH值的控制：值的控制：由于離子對的生成取決于樣品組分的離解程度，因此調(diào)節(jié)pH值可在較大范圍內(nèi)改變?nèi)跛?、弱堿樣品的保留值和分離選擇性。流動(dòng)相的pH值應(yīng)調(diào)整到使被測樣品

26、完全解離、能最大程度地形成離子對，但pH值對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿樣品分離的影響很小。同時(shí)考慮到采用的是以硅膠為基體的烷基鍵合相，故流動(dòng)相的pH值應(yīng)在28范圍內(nèi)調(diào)整。表42列出了反相離子對色譜法分析不同類型樣品時(shí)pH的選擇。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)有機(jī)溶劑的選擇：有機(jī)溶劑的選擇：反相離子對色譜法中，甲醇水、乙脯水系統(tǒng)是最常用的流動(dòng)相，流動(dòng)相中所含有機(jī)溶劑的比例越高，組分的A值越小。一般而言，樣品組分的疏水性及離子對試劑的疏水性越強(qiáng)，所需有機(jī)溶劑的比例越高o(4)離子抑制色譜法：離子抑制色譜法：由于離子對試劑的價(jià)格較貴，對弱酸、弱堿的分離，往往采用離子抑制色譜

27、法。通過向流動(dòng)相加入少量弱酸(常用醋酸)、弱堿(常用氨水)或緩沖鹽(常用磷酸鹽及醋酸鹽)，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法(ISC)。該方法簡便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，分離效果好，在許多場合可替代離子對色譜法，但重復(fù)性較差是其缺點(diǎn)。離子抑制色譜法通常用于反相色譜中，適用于3.0pKa7.0的弱酸、7.0pKa8.0的弱堿和兩性化合物的分離，以及它們與分子型化合物共存時(shí)的分離。調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值在一定范圍內(nèi)，以抑制弱酸(pHpKa)、弱堿(pHpKa)組分的解離，使它們以分子形式存在，增大k值，對于pKn3

28、.0的酸及pKa8.0的堿，應(yīng)采取離子對色譜法或離子交換色譜法。如甘草提取物的分離即采用離子抑制色譜。在進(jìn)行離子抑制色譜時(shí)，流動(dòng)相的pH位要在28之間，超出此范圍可能使鍵合相的基團(tuán)脫落，或腐蝕儀器的流路系統(tǒng)。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) （四）定量分析方法（四）定量分析方法 1. 外標(biāo)法外標(biāo)法 以待測組分的標(biāo)準(zhǔn)品作對照物質(zhì)，與對照物質(zhì)對比求算試樣含量的方法稱為外標(biāo)法。常用外標(biāo)工作曲線法和外標(biāo)一點(diǎn)法。外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是不需知道校正因子，只要被測組分出峰，無干擾，保留時(shí)間適宜. 即可用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。但要求進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確，否則定量誤差大。 2. 內(nèi)加法內(nèi)加法 內(nèi)加法又稱疊加法，將待測物i的

29、純品加入待測樣品溶液中，通過測定該純品加入前后i組分峰面積或峰高的變化來測定i組分含量的方法。 原樣品m克定量進(jìn)樣，測定i組分的色譜峰面積為Ai，再取m克原樣，加入mi克i組分的純品，混勻，等量第二次進(jìn)樣，測得i組分的峰面積增加A人i。設(shè)m克原樣中含m克i組分，則：中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) mi克i組分純品加入后，試樣相當(dāng)于被稀釋，則第二次等量進(jìn)樣后，原樣品中mi克i組分的色譜圖將比原Ai峰小(如圖415所示)，為了正確計(jì)算Ai及消除進(jìn)樣不準(zhǔn)確帶來的誤差，在色譜圖中選一適宜的相鄰組分的色譜峰為參考峰Ar，用此峰作相對標(biāo)準(zhǔn)(起內(nèi)標(biāo)物作用)，按內(nèi)標(biāo)法

30、處理，用面積比代替面積及面積增量 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)該法的優(yōu)點(diǎn)是不需內(nèi)標(biāo)物，又具有內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)，只要兩次進(jìn)樣時(shí)實(shí)驗(yàn)條件恒定即可尤其適用于低濃度多組分樣品的定量分析。其缺點(diǎn)是需i組分的純品。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)（五）應(yīng)用舉例（五）應(yīng)用舉例1. 小兒熱速清口服液中黃芩苷的含量測定小兒熱速清口服液中黃芩苷的含量測定(反相反相HPLC外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)一點(diǎn)法)(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇水磷酸(47:53:0.2)為流動(dòng)相；檢測波長為276nm。理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。(2)對照品溶液的制

31、備對照品溶液的制備：取黃芩苷對照品約l0mg，精密稱定。置200ml量瓶中，加50甲醇適量，置熱水浴中振搖使溶解，放置至室溫，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml含黃芩苷50g)。(3)供試品溶液的制備供試品溶液的制備 精密量取本品0.5ml，置Dl0l大吸附樹脂柱(內(nèi)徑約l充高locm)上，以每分鐘1.5ml的流速，用水70ml洗滌，繼用40乙醇洗脫9ml，收集續(xù)洗脫液，置50ml量瓶中，至刻度，搖勻，即得。(4)測定法：測定法：分別精密吸取對照品溶液5L與供試品溶液10L，注入液相色譜儀，測定，即得。本品每1ml含黃芩以黃芩苷(C21H18O11)計(jì)，不得少于2.2mg。中藥制劑分析中藥制劑

32、定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) （一）基本原理（一）基本原理 氣相色譜是根據(jù)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間作用不同在色譜柱中移動(dòng)有快慢，經(jīng)一定柱長后得到分離，依次被載氣帶入檢測器，將各組分濃度或質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換成電信號變化記錄成色譜圖. 利用色譜峰保留值進(jìn)行定性分析，利用峰面積或峰高進(jìn)行定量分析的方法。 1.塔板理論塔板理論 將色譜柱的柱效用理論塔板數(shù)n或理論塔板高度H衡量，取決于區(qū)域?qū)挾?、W1/2、W)，其計(jì)算公式為中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) n( ) 2 5.54( ) 2 16( )2 式中tR為組分的保留時(shí)間，、W1/2、W分別為組分的標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬和基線寬度。若以調(diào)整保留

33、時(shí)間tR代替，tR則得到反映色譜柱實(shí)際柱效的有效理論塔板數(shù)neff。 Neff( ) 2 5.54( ) 2 16( ) 2 HeffL/neff 可見，當(dāng)tR一定時(shí)，峰越窄，則H越小，n越大，柱效越高，分離性能越好。 Rt2/1WtRWtRRt2/1WtRWtR中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 2. 速率理論速率理論 速率理論研究了色譜過程中各種動(dòng)力學(xué)因素對柱效(峰展寬)的影響，提出了Van Deemeter方程式： HA十B/u十Cu A、B/u、Cu分別為渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散(縱向擴(kuò)散)項(xiàng)、傳質(zhì)阻抗項(xiàng)，從而解釋了板高隨載氣流速而改變，且有最佳流速(Hmin)的現(xiàn)象。速率方程式對于色譜

34、分離條件的選擇具有指導(dǎo)意義，它可以說明色譜柱的填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、柱溫和固定液膜厚度對柱效、峰擴(kuò)張的影響。 對于開口毛細(xì)管柱色譜，渦流擴(kuò)散項(xiàng)A0，故Van Deemeter方程式可簡化為HB/uCu，其傳質(zhì)阻抗小，柱長又遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于填充柱，所以毛細(xì)管柱的柱效要比填充柱高得多，其理論塔板數(shù)達(dá)10l0。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 3.分離度的計(jì)算分離度的計(jì)算 分離度是衡量分離效果的指標(biāo)，以相鄰兩色譜峰峰尖距對峰寬均值的倍數(shù)表示，其定義式為： Rl，兩峰基本分離，R1.5兩峰完全分離。 分離度的影響因素很多，可用基本分離方程式概括如下： a、b、c分別為柱效項(xiàng)、柱選擇性項(xiàng)和柱容量

35、項(xiàng)。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 4. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按藥典標(biāo)準(zhǔn)，中藥制劑分析時(shí)，需按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，以達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定在分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論塔板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。 (1)色譜往的理論塔板數(shù)色譜往的理論塔板數(shù)n：在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間和半峰寬W1/2，按n5.54( )2計(jì)算色譜柱的理論塔板數(shù)。若測得理論塔板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論塔板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件(如柱長、載體性能、柱填充等)，

36、使理論塔板數(shù)達(dá)到要求。 (2)分離度分離度R：定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度，一般R1.5。 2/1WtR中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) (3)重復(fù)性：重復(fù)性：取各品種項(xiàng)下的對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0，也可按各品種校正因子測定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80、l00和120的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子。其相對平均偏差也應(yīng)不大于2.0。 (4)拖尾因子拖尾因子T：為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子T是否符合各品種項(xiàng)下的

37、規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為： T 式中：W0.05k為0.05峰高處的峰寬，d1為峰極大至峰前沿之間的距離，T應(yīng)在0.951.05之間 105. 02dWh中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) （二）實(shí)驗(yàn)條件的選擇（二）實(shí)驗(yàn)條件的選擇 1. 固定相的選擇固定相的選擇 氣液色譜中固定相由固定液和載體組成，載體僅起支持劑作用，故固定液的選擇十分重要，按極性相似、化學(xué)官能團(tuán)相似的相似性原則和主要差別選擇。對復(fù)雜樣品的分析可使用混合固定液。并根據(jù)樣品性質(zhì)選擇合適的固定液配比，對高沸點(diǎn)化合物宜采用低配比，對于低沸點(diǎn)化合物，宜用高配比。并注意柱溫不能超過固定液的最高

38、使用溫度。載體為適宜粒度、經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土。 中藥制劑分析中氣固色譜的固定相大多采用高分子多孔微球(GDX)，用于分離水及含羥基(醇)化合物 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)2. 柱溫的選擇柱溫的選擇 在實(shí)際工作中一般根據(jù)樣品的沸點(diǎn)來選擇柱溫，具體有如下幾點(diǎn)：(1)高沸點(diǎn)的樣品(沸點(diǎn)300400)，采用15低固定液配比，柱溫200250。(2)沸點(diǎn)為200300的樣品，采用510固定液配比，柱溫150180。(3)沸點(diǎn)為100200的樣品，采用1015固定液配比柱溫選各組分的平均沸點(diǎn)2/3左右。(4)氣體等低沸點(diǎn)樣品，采用1525高固定液配比，柱溫選沸點(diǎn)左右，在室溫或50下進(jìn)行分

39、析。(5)對于寬沸程樣品，需采用程序升溫方法進(jìn)行分析。但需注意的是柱濕要低于固定液的最高使用溫度。3. 載氣的選擇載氣的選擇 選擇載氣主要從對峰展寬(柱效)、校壓降和檢測器靈敏度的影響三方面考慮。當(dāng)載氣流速較低時(shí)，宜用分子量較大的載氣如N2；當(dāng)流速高時(shí)，宜用低分子量的載氣如H2、He。對于較長色譜柱，宜用H2作載氣，以減小柱壓降。熱導(dǎo)檢測器應(yīng)選用H2、He；對氫焰檢測器、電子捕獲檢測器，一般用N2，N2是最常用的載氣。常用的載氣流速為2080ml/min。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 4. 其他條件的選擇其他條件的選擇 (1)汽化室汽化室(進(jìn)樣口進(jìn)樣口)溫度溫度：汽化溫度取決于樣品的

40、揮發(fā)性、沸點(diǎn)范圍、穩(wěn)定性及進(jìn)樣量等因素，一般采用樣品的沸點(diǎn)或稍高于沸點(diǎn)，以保證瞬間汽化，但不超過沸點(diǎn)50以上。以防分解，對一般色譜分析，汽化室溫度應(yīng)高于柱溫3050。 (2)檢測室溫度：檢測室溫度：檢測器溫度一般需高于柱溫，以免色譜柱的流出物在檢測器中冷凝而污染檢測器。通常可高于柱溫30左右或等于汽化室溫度。 (3)進(jìn)樣量：進(jìn)樣量：對于填充柱，氣體樣品為0.11ml，液體樣品為0.l1L，最大不超過4L為宜。毛細(xì)管柱需用分流器分流進(jìn)樣，分流后的進(jìn)樣量為填充柱的1/101/100。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 5. 檢測器檢測器 用于中藥制劑分析的檢測器有熱導(dǎo)檢測器(TCD)、氫焰離子

41、化檢測器(FID)、氮磷檢測器(NPD)和電子捕獲檢測器(ECD)等。其中FID是制劑分析中應(yīng)用最廣泛的質(zhì)量型檢測器，適用于含碳有機(jī)物的測定，載氣多為N2，通常N2:H2(燃?xì)?1:11:1.5，H2:空氣(助燃?xì)?1:51:10。NPD為專屬性檢測器，對含N、P有機(jī)化臺物特別敏感，可用于中藥及其制劑中農(nóng)藥殘留量的檢測。ECD也是一種專屬性檢測器，適用于痕量電負(fù)性有機(jī)物如含鹵素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物的分析。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) （三）定量分析方法（三）定量分析方法 1. 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 由于氣相色譜進(jìn)樣量小，且進(jìn)樣量不易淮確控制，故外標(biāo)法測定的誤差較大，而歸一化法又

42、要求所有組分都有響應(yīng)，因而內(nèi)標(biāo)法是中藥及其制劑有效成分含量測定最常用的方法。適用于樣品的所有組分不能全部流出色譜柱，或檢測器不能對每個(gè)組分都產(chǎn)生信號或只需測定樣品中某幾個(gè)組分含量時(shí)的情況。 選擇化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)與待測組分相近的純品作為內(nèi)標(biāo)物. 將一定量的內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，經(jīng)色譜分離，根據(jù)試樣重量W和內(nèi)標(biāo)物重量Ws及待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積Ai、As， 求出待測組分的含量。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。使用內(nèi)標(biāo)法，可抵消儀器穩(wěn)定性差、進(jìn)樣量不夠淮確等原因所帶來的定量分析誤差。其不足之處是樣品的配制較麻煩，有些內(nèi)標(biāo)物不易尋找。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技

43、術(shù)醫(yī)學(xué) 在中藥制劑分析中，校正因子經(jīng)常是未知的，可采用中國藥典方法測定校正因子，再用內(nèi)標(biāo)法，或采用內(nèi)標(biāo)對比法測定。 (1)內(nèi)標(biāo)法加校正因子：內(nèi)標(biāo)法加校正因子：精密稱取待測物質(zhì)的對照品R，加入適量內(nèi)標(biāo)物S進(jìn)樣記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，則其相對校正因子為： f再取加入內(nèi)標(biāo)物的供試液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量供試液中待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積按下式計(jì)算其含量： CfC5 當(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物的供試液使用同內(nèi)標(biāo)物溶液不必精密稱取。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) (2)內(nèi)標(biāo)對比法：內(nèi)標(biāo)對比法：本法是在不知校正因子時(shí)內(nèi)標(biāo)法的一種應(yīng)用。在中成藥分析時(shí)，校正因子常常是未知

44、的，內(nèi)標(biāo)對比法不需知道校正因子，又具有內(nèi)標(biāo)法定量旺確度與進(jìn)樣量無關(guān)的特點(diǎn)，方法簡便實(shí)用，在中藥制劑定量分析時(shí)常常采用此法定量c先稱取一定量的內(nèi)標(biāo)物，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，組成標(biāo)準(zhǔn)品镕液；然后再將相同量的內(nèi)標(biāo)物加入問體積的試樣溶液，組成供試液。分別進(jìn)樣，由下式可計(jì)算出試液中待測組分的含量。(3)內(nèi)標(biāo)工作曲線法：內(nèi)標(biāo)工作曲線法與外標(biāo)法相同，只是在各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入相同量的內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比Ai/As對C作工作曲線(或求回歸方程)。樣品測定時(shí)也加入等量的內(nèi)標(biāo)物。根據(jù)樣品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比Ai/As由工作曲線求得待測組分含量。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 2. 外標(biāo)法外標(biāo)

45、法 外標(biāo)法分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是用一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，在完全相同條件下，推確進(jìn)樣等體積的樣品溶液，計(jì)算其含量。通常截距為零，若不等于零則說明存在系統(tǒng)誤差。當(dāng)工作曲線截距為零時(shí)，可采用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。 用一種濃度的對照品溶液和供試液在相同條件下，等體積平行進(jìn)樣多次，記錄色譜圖測量對照品和供試品待測成分的峰面積，計(jì)算其含量： 外標(biāo)法操作簡便，計(jì)算方便，不需用校正因子、不論樣品中其他組分是否出峰，均可對被測組分定量，但要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確及實(shí)驗(yàn)條件恒定。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 3. 歸一化法歸一化法 當(dāng)樣品中所有組分在操作時(shí)間內(nèi)都能流出色譜柱. 且檢測器對

46、它們都產(chǎn)生信號，同時(shí)己知各組分的校正因子時(shí)，可用校正面積歸一化法測定各組分的含量： 若樣品中各組分為同系物或性質(zhì)接近，各組分的定量校正因子相近，可直接采用面積歸一化法計(jì)算： 歸一化法的優(yōu)點(diǎn)是簡便，定量結(jié)果與進(jìn)樣量重復(fù)性無關(guān)(在最大進(jìn)樣量以下)，操作條件略有變化對結(jié)果影響較小。但其缺點(diǎn)是要求所有組分均要產(chǎn)生色譜峰，不適于微量雜質(zhì)的含量測定。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)（四）應(yīng)用舉例（四）應(yīng)用舉例1. 馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏中冰片的校正因子內(nèi)標(biāo)法測定馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏中冰片的校正因子內(nèi)標(biāo)法測定(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用丁二酸二乙二醇聚酯(DEGS)為固定相，涂布濃

47、度為l5；柱溫l05，取冰片對照品40mg置10ml量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液，取1l注入氣相色譜儀，記錄色譜圖；理論塔板數(shù)按水楊酸甲酯峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000；龍腦、異龍腦峰與水楊酸甲酯峰的分離應(yīng)符合要求。(2)校正因子測定：校正因子測定：精密稱取水楊酸甲酯適量，加環(huán)己烷-乙酸乙酯(1:1)制成每lml含3mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取龍腦對照品20mg，精密稱定，置10ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。取ll注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣35次，按平均峰面積計(jì)算校正因子。(3)測定法測定法 取本品約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加

48、入內(nèi)標(biāo)溶液10ml，混勻，稱定重量，超聲處理15分鐘，放冷，在稱重量，用環(huán)己烷乙酸乙酯(1:1)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，吸取續(xù)濾液1l，注入氣相色譜儀，測定，即得。本品每1g含冰片以龍腦(C10H18O)計(jì)，不得少于19mg。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 2. 麝香祛痛搽劑中槐腦的外標(biāo)一點(diǎn)法測定麝香祛痛搽劑中槐腦的外標(biāo)一點(diǎn)法測定 (1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以聚乙二醇(PEG)20M毛細(xì)管柱(柱長30m，內(nèi)徑0.53mm，膜厚度1.0m)，柱溫為160；為固定相，涂布濃度lo；柱溫：為程序升溫85一165，初溫保持4分鐘后，每分鐘升高4，終溫保持16

49、分鐘。理論塔板數(shù)按樟腦峰計(jì)算應(yīng)不低于120000。 (2)對照品溶液的制備：對照品溶液的制備：精密稱取樟腦對照品適量，加稀乙醇制成每1ml含1m8的溶液!即得。 (3)供試品溶液的制備：供試品溶液的制備：精密量取本品2ml，置50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻即得。 (4)測定法：測定法：分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各5L，注入氣相色譜儀，測定本品含樟腦(C10H16O)應(yīng)為2.73.3。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)薄層掃描法是以薄層色譜法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的薄層色譜組分分析方法，又稱薄層色譜掃描法(TLCS)，相應(yīng)儀器稱為薄層掃描儀(thin layer chromatogram

50、 scanner).薄層掃描法是用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中吸收紫外光或可見光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定。隨著制板、點(diǎn)樣、展開等操作的儀器化及儀器性能的改進(jìn)，薄層掃描法檢測的靈敏度、結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度均大大提高，與高效液相色譜法相比，具有實(shí)驗(yàn)成本低，流動(dòng)相的選擇與更換方便等優(yōu)點(diǎn)，在中藥制劑分析中，已成為重要的常用分析方法之一。在2005年版中國藥典(一部)中共收載45個(gè)用薄層掃描法測定含量的品種。如：六味地黃顆粒、山楂化滯丸、血脂寧片、等制劑中山茱萸、山楂的含量測定，制劑中黃連的含量測定，龜齡集、腦

51、得生丸、舒胸片中人參、三七的含量測定等均采用雙波長薄層吸收掃描法，而二妙丸、三妙丸、芎菊上清丸、導(dǎo)赤丸中黃連、黃柏的含量測定，枳實(shí)導(dǎo)滯丸中枳實(shí)的含量測定則采用薄層熒光掃描法。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué)（一）基本原理（一）基本原理簿層掃描法一般是指薄層色譜斑點(diǎn)的色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長，斑點(diǎn)移動(dòng)，測定A1或Fl曲線。根據(jù)薄層掃描的測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。1. 薄層吸收掃描法薄層吸收掃描法 薄層吸收掃描法適用于在可見、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分，可分別以鎢燈和氘燈為光源，在200800nm波長范圍內(nèi)選擇合適波長

52、進(jìn)行測定。由于薄層板存在明顯的散射現(xiàn)象，斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸收度的關(guān)系需用KubelkaMunk理論及曲線來描述。KubelkaMunk理論以斑點(diǎn)的相對反射率和相對透光率計(jì)算薄層色譜斑點(diǎn)的吸收度，說明了固定相的散射參數(shù)SX對斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸收度間關(guān)系的影響，獲得不同散射參數(shù)SX時(shí)斑點(diǎn)的AKX理論曲線，即KubelkaMunk曲線。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) KubelkaMunk曲線說明了薄層色譜斑點(diǎn)的吸收度與其濃度間呈非線性關(guān)系，解釋了薄層掃描法中標(biāo)準(zhǔn)曲線的彎曲問題，該曲線是薄層掃描法進(jìn)行定量分析的理論依據(jù)。用于定量分析時(shí)需對曲線進(jìn)行處理，曲線的處理有兩類方法：曲線校直法和計(jì)

53、算機(jī)回歸法(線性及非線性回歸)。島律公司CS系列儀器采用前者，線性化器根據(jù)薄板的散射參數(shù)SX將KubelkaMunk曲線校正為直線，簡化A與KX間的關(guān)系，便于定量分析。CAMAG儀器則采用后者，根據(jù)最小二乘法原理. 對標(biāo)準(zhǔn)樣品測定值進(jìn)行分析，得到回歸方程，定義出最佳回歸曲線。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 2. 薄層熒光掃描法薄層熒光掃描法 簿層熒光掃描法適合于本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定，光源用氖燈或汞燈，采用直線式掃描。熒光測定法專屬性強(qiáng)，靈敏度比吸收法高l3個(gè)數(shù)量級，最低可測到1050pg樣品，但適用范圍較窄。對于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可直接采用熒光掃描法測定。

54、對于有紫外吸收，而不能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，需采用熒光淬滅法測定。 當(dāng)溶液濃度很稀時(shí)(ECL0. 05)，熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度F與激發(fā)光光強(qiáng)Io及物質(zhì)濃度C之間存在如下關(guān)系： F2. 3KIoECL或FKC中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 式中，K為常數(shù)(與熒光效率有關(guān))，E為吸收系數(shù)，L為薄層厚度。上式即為簿層熒光掃描法定量分析的基本公式。在點(diǎn)樣量很小時(shí)，斑點(diǎn)中組分的濃度與其熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系。 KubeLkaMunk理論不適用于薄層熒光掃描，無需進(jìn)行曲線校直。用薄層熒光掃描進(jìn)行定量分析時(shí)，用斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度的積分值(色譜峰峰面積)與斑點(diǎn)中組分的含量代替上式中F與C進(jìn)行運(yùn)算c 簿層色譜的操作方法可分

55、薄層板的制備、點(diǎn)樣、展開及檢測等步驟 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) （二）定量分析方法（二）定量分析方法 1. 方法學(xué)考察方法學(xué)考察 新建薄層掃描定量方法必須進(jìn)行方法學(xué)考察，以說明新建方法的可靠性，考察的內(nèi)容有工作曲線、定量結(jié)果的精密度及準(zhǔn)確度、分離度等內(nèi)容。 (1)工作曲線：工作曲線：對于用KubelkaMunk曲線校直法進(jìn)行定量校準(zhǔn)的儀器，如CS系列薄層掃描儀，繪制色譜峰峰面積A與純品點(diǎn)樣量(g/斑點(diǎn))間的工作曲線，并非直接用于定量，其目的是：檢查所選擇的散射參數(shù)SX值是否適宜。SX值適宜則工作曲線被校直為直線，否則，調(diào)整SX值再校正，直至在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線成直線為止。中藥

56、制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 考察工作曲線是否過原點(diǎn)，以便確定采用一點(diǎn)法或二點(diǎn)法定量。直線過原點(diǎn)，截距為零時(shí)，可用外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法或二點(diǎn)法定量；直線不過原點(diǎn)，截距不為零時(shí)，不能用一點(diǎn)法定量，只能用二點(diǎn)法定量。確定點(diǎn)樣量的線性范圍。即使采用曲線校直，也只是在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，因此需確定點(diǎn)樣量的上、下限。為降低定量誤差，最好調(diào)整點(diǎn)樣量，使供試品與對照品的峰面積相接近。為了克服薄層板間差異，外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)法均應(yīng)采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法. 即標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液交叉點(diǎn)在同一塊薄層板上。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 采用回歸法進(jìn)行定量計(jì)算的薄層掃描儀，如CAMAG系列，其工作曲線直接用于

57、定量。平行點(diǎn)多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液(或?qū)φ掌?，由計(jì)算機(jī)對所測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性或非線性回歸，定義出回歸方程或給出回歸曲線，由回歸方程式或回歸曲線計(jì)算供試品的含量。其特點(diǎn)是無需進(jìn)行曲線校直，但為了克服薄層板間差異，也宜采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法。 (2)精密度考察：精密度考察：取同一供試品溶液，在同一塊薄層板上以相同點(diǎn)樣量平行點(diǎn)6點(diǎn)，展開后測定其峰面積，求算相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)，作為衡量定量分析結(jié)果精密度的指標(biāo)。RSD應(yīng)小于3.0；需顯色后測定的RSD應(yīng)小于5.0。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 3)準(zhǔn)確度考察：準(zhǔn)確度考察：回收率是衡量定量方法淮確度的指標(biāo)，常用加樣回收率來衡量，其值應(yīng)在95105之間，測量數(shù)

58、據(jù)一般為56個(gè)。 將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)于同一塊薄層板上，展開后進(jìn)行薄層掃描，測定各斑點(diǎn)的峰面積，計(jì)算各溶液小組分的量，計(jì)算回收率。 (4)分離度考察：分離度考察：要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度(R)的計(jì)算公式為： R2(d2-d1)/W1+W2 式中，d2-為相鄰峰中后一峰與原點(diǎn)的距離； d1 為相鄰峰中前一峰與原點(diǎn)的距離； W1及W2 為相鄰峰各自的峰寬。 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大1.0。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 2. 定量方法定量方法 常用的定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、追加法(疊加法)及回歸曲線定量法。 (1)外標(biāo)法：外標(biāo)法：外標(biāo)法是薄層色

59、譜掃描最常用的定量方法，方法簡便，但點(diǎn)樣必須準(zhǔn)確。由于薄層板間差異較大，為克服這種差異，應(yīng)采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法，即供試品與標(biāo)準(zhǔn)溶液(或?qū)φ杖芤?交叉點(diǎn)在同一塊板上，包括外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)二點(diǎn)法。 外標(biāo)一點(diǎn)法：外標(biāo)一點(diǎn)法：工作曲線通過原點(diǎn)(截距為零)時(shí)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量如圖413只需點(diǎn)一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與供試液同板展開，對比，測定組分含量，其計(jì)算公式為： CFA 式中：C為組分的重量或濃度，A為測得組分的峰面積F1為直線的斜率或比例常數(shù)。 中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) 外標(biāo)二點(diǎn)法：外標(biāo)二點(diǎn)法：工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)，只能用外標(biāo)二點(diǎn)法定量，至少需點(diǎn)二種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(或一種濃度兩種點(diǎn)樣量).

60、 才能決定一直線，如圖414所示，其計(jì)算公式為： CF1A十F2 式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標(biāo)的截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動(dòng)算出。 外標(biāo)一點(diǎn)法、二點(diǎn)法只是指用一種或二種濃度的標(biāo)淮溶液對比定量，為減小誤差，同一薄板上供試品點(diǎn)樣不得少于4個(gè)，對照品每一濃度不得少于2個(gè)；并調(diào)整標(biāo)推溶液的濃度或供試品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的點(diǎn)樣量，使其峰面積相接近；且點(diǎn)樣量必須準(zhǔn)確，宜用定量毛細(xì)管點(diǎn)樣。中藥制劑分析中藥制劑定量分析技術(shù)醫(yī)學(xué) (2)內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)法是選一個(gè)純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，并準(zhǔn)確稱取一定量內(nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，計(jì)算供試品溶液中某組分含量的定量方法。 與外標(biāo)法相似，當(dāng)工作曲線