微生物學(xué)實驗細(xì)菌染色

1、基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程細(xì)菌染色技術(shù)細(xì)菌染色技術(shù)基礎(chǔ)生物學(xué)實驗（三）基礎(chǔ)生物學(xué)實驗（三）基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程目的要求目的要求1. 學(xué)習(xí)微生物涂片，染色的基本技術(shù)，掌握學(xué)習(xí)微生物涂片，染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的染色法。細(xì)菌的染色法。2. 初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征。初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征。3. 鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術(shù)。作技術(shù)?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程微生物染色的染料微生物染色的染料 是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)的是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)的有機(jī)化合物。有機(jī)化合物。 染

2、料通常都是鹽，分酸性染料和堿性染料染料通常都是鹽，分酸性染料和堿性染料兩大類。兩大類。 在微生物染色中，堿性染料較常用，如常在微生物染色中，堿性染料較常用，如常用的美藍(lán)（即亞甲藍(lán)）、結(jié)晶紫、堿性紫用的美藍(lán)（即亞甲藍(lán)）、結(jié)晶紫、堿性紫復(fù)紅、番紅（即沙黃）、孔雀綠等都屬于復(fù)紅、番紅（即沙黃）、孔雀綠等都屬于堿性染料。堿性染料?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程v在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷；通常帶負(fù)電荷；v而堿性染料在電離時，其分子的染色部分而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷；帶正電荷；v帶正電荷的堿性染料染色部分很容易與

3、帶帶正電荷的堿性染料染色部分很容易與帶負(fù)電荷細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合使細(xì)菌染色。負(fù)電荷細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合使細(xì)菌染色。微生物染色原理微生物染色原理基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程材材 料料1. 菌種菌種 2. 染色劑染色劑3. 儀器或其他用具：儀器或其他用具： 顯微鏡顯微鏡 酒精燈酒精燈 載玻片載玻片 接種環(huán)接種環(huán) 香柏油香柏油 酒精酒精+乙醚乙醚 擦鏡紙擦鏡紙 生理鹽水等。生理鹽水等。基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗鏡檢鏡檢簡單染色方法簡單染色方法干燥干燥基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程革蘭氏染色革蘭氏染色 菌種菌種: : 參考菌：參考

4、菌：g+：staphylococcus aureus, g-: escherichia coli 儀器儀器 顯微鏡；顯微鏡； 材料材料 載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，染色缸等。吸水紙，染色缸等。 染料染料 草酸銨結(jié)晶紫染色液，路哥氏草酸銨結(jié)晶紫染色液，路哥氏(lugol)(lugol)碘液，碘液，95%95%乙醇，乙醇，0.5%0.5%番紅染色液；番紅染色液；基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程革藍(lán)氏陽性和陰性菌細(xì)胞壁成分比較革藍(lán)氏陽性和陰性菌細(xì)胞壁成分比較成分成分 占細(xì)胞壁干重的占細(xì)胞壁干重的% 革藍(lán)氏陽性菌革藍(lán)氏陽性菌 革藍(lán)氏陰性菌革藍(lán)氏陰

5、性菌肽聚糖肽聚糖 含量很高（含量很高（50-9050-90） 含量很低（含量很低（1010）磷壁酸磷壁酸 含量較高（含量較高（5050） 無無類脂質(zhì)類脂質(zhì) 一般無（一般無（ 2 2） 含量較高（含量較高（2020）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 無無 含量較高含量較高基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程革藍(lán)氏染色的意義革藍(lán)氏染色的意義 細(xì)菌分類鑒定細(xì)菌分類鑒定 指導(dǎo)臨床用藥指導(dǎo)臨床用藥基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程微生物分類鑒定的特征微生物分類鑒定的特征v形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)和生理生化特征和生理生化特征v血清學(xué)實驗和噬菌體分型血清學(xué)實驗和噬菌體分型v氨基酸序列和蛋白質(zhì)分析氨基酸序列和蛋白質(zhì)分析v核

6、酸堿基組成和序列分析核酸堿基組成和序列分析基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程形態(tài)學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征v培養(yǎng)特征、菌落的形狀、大小、顏色、表培養(yǎng)特征、菌落的形狀、大小、顏色、表面特征、光澤等面特征、光澤等v細(xì)胞形態(tài)：形狀、大小、排列方式細(xì)胞形態(tài)：形狀、大小、排列方式v特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、芽孢、孢子、莢膜等特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、芽孢、孢子、莢膜等v細(xì)胞內(nèi)涵物細(xì)胞內(nèi)涵物v染色反應(yīng)：革藍(lán)氏染色、抗酸性染色染色反應(yīng)：革藍(lán)氏染色、抗酸性染色v運(yùn)動性運(yùn)動性基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程方法方法v涂片涂片v初染初染v媒染媒染v脫色脫色v復(fù)染復(fù)染v鏡檢鏡檢基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程涂

7、片涂片v要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色; ;v注意練習(xí)無菌操作；注意練習(xí)無菌操作；v在載玻片上滴半滴生理鹽水；在載玻片上滴半滴生理鹽水；v取菌不要貪多，接種環(huán)上肉眼可見菌苔痕取菌不要貪多，接種環(huán)上肉眼可見菌苔痕跡即可；跡即可；v菌苔在生理鹽水中涂片要均勻，局部不宜菌苔在生理鹽水中涂片要均勻，局部不宜過厚過厚, ,以免脫色不完全造成假陽性。以免脫色不完全造成假陽性?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程 初染初染 將玻片置于玻片擱架上，加草酸將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結(jié)晶紫染色液銨結(jié)晶紫染色液( (加量以蓋滿菌膜為度加量以蓋滿菌膜為度) )，染

8、色染色1-2min1-2min。傾去染色液，用自來水小心。傾去染色液，用自來水小心地沖洗。地沖洗。 媒染媒染 滴加滴加(lugol)(lugol)碘液，染碘液，染1-2min1-2min，水，水洗。洗。 脫色脫色 滴加滴加95%95%乙醇，脫色乙醇，脫色20-25s20-25s立即水立即水洗，以終止脫色。洗，以終止脫色。 復(fù)染復(fù)染 滴加蕃紅，染色滴加蕃紅，染色2-3min2-3min，水洗。，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。最后用吸水紙輕輕吸干?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程 干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌(g )；被

9、染成紅色者是；被染成紅色者是革蘭革蘭氏陰性菌氏陰性菌(g-)。 基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程作業(yè)作業(yè) 實驗報告實驗報告基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程1、涂片、涂片1.取一塊干凈的載玻片平放在載玻片架上，在載取一塊干凈的載玻片平放在載玻片架上，在載玻片中央滴一滴生理鹽水（或蒸餾水）；玻片中央滴一滴生理鹽水（或蒸餾水）；2.無菌操作無菌操作從試管中生長有瓊脂斜面上挑取少許從試管中生長有瓊脂斜面上挑取少許菌苔；菌苔；3.將挑取的菌苔沾入

10、載玻片中央生理鹽水中混勻?qū)⑻羧〉木φ慈胼d玻片中央生理鹽水中混勻并涂成薄膜。并涂成薄膜。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多；涂片要涂抹均勻，不宜過厚。宜過多；涂片要涂抹均勻，不宜過厚?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程2、干燥、干燥v 將涂好菌膜的載玻片平放在載玻片架上，將涂好菌膜的載玻片平放在載玻片架上，室溫下自然干燥。室溫下自然干燥?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程3、固定、固定v手持已經(jīng)自然干燥的涂好菌膜的載玻片，手持已經(jīng)自然干燥的涂好菌膜的載玻片，涂面朝上，在酒精燈火焰上通過涂面朝上，在酒精燈火焰上通過2

11、 23 3次，熱次，熱固定細(xì)菌細(xì)胞。固定細(xì)菌細(xì)胞。原理：加熱使細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固、使細(xì)原理：加熱使細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固、使細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)凝固，從而固定細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，菌細(xì)胞質(zhì)凝固，從而固定細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。并使之牢固附著在載玻片上。注意：熱固定溫度不宜過高，否則會改變甚注意：熱固定溫度不宜過高，否則會改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。至破壞細(xì)胞形態(tài)?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程4、染色、染色v將將熱固定的細(xì)菌熱固定的細(xì)菌涂片平放于在載玻片架上，涂片平放于在載玻片架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。膜為宜）。v染色時間：染

12、色時間：呂氏堿性美藍(lán)染色呂氏堿性美藍(lán)染色12min；石炭酸復(fù)紅染色約石炭酸復(fù)紅染色約1min草酸銨結(jié)晶紫染色約草酸銨結(jié)晶紫染色約1min。基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程5、水洗、水洗v將將細(xì)菌細(xì)菌涂片上染液倒入廢液缸中；涂片上染液倒入廢液缸中；v手持手持細(xì)菌染色細(xì)菌染色涂片，置于廢液缸上方，用涂片，置于廢液缸上方，用洗瓶中自來水沖洗涂片，直至流下的水無洗瓶中自來水沖洗涂片，直至流下的水無色為止。色為止。注意：水洗時，不要直接沖洗涂面，而應(yīng)使注意：水洗時，不要直接沖洗涂面，而應(yīng)使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急，水從載玻片的一端流下。水流不宜過急，過大，以免涂片薄膜脫落。過大，以

13、免涂片薄膜脫落。基礎(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程6、干燥、干燥v自然干燥：將染好色的細(xì)菌涂片平放在載自然干燥：將染好色的細(xì)菌涂片平放在載玻片架上，室溫下自然干燥；玻片架上，室溫下自然干燥；v吹干：將染好色的細(xì)菌涂片平放在載玻片吹干：將染好色的細(xì)菌涂片平放在載玻片架上，用電吹風(fēng)冷風(fēng)或低溫?zé)犸L(fēng)吹干；架上，用電吹風(fēng)冷風(fēng)或低溫?zé)犸L(fēng)吹干；v吸干：將染好色的細(xì)菌涂片平放在一張吸吸干：將染好色的細(xì)菌涂片平放在一張吸水紙上，上面覆蓋一張吸水紙，將細(xì)菌涂水紙上，上面覆蓋一張吸水紙，將細(xì)菌涂片兩面水分吸干。片兩面水分吸干?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程7、鏡檢、鏡檢 涂片干后鏡檢。涂片干后鏡檢。 注意：涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀注意：涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。察。 防止水的折射，以便于觀察。防止水的折射，以便于觀察?；A(chǔ)生物學(xué)實驗基礎(chǔ)生物學(xué)實驗精品課程精品課程microbiological ste