綜合化學實驗化學生物學專題實驗二ppt課件

1、綜合化學實驗綜合化學實驗- -化學生物學專題實驗二化學生物學專題實驗二銅配合物氧化斷裂銅配合物氧化斷裂DNA研討研討中山大學化學與化學工程學院中山大學化學與化學工程學院：8413405884134058: : 巢巢 暉暉實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膗了解化學核酸酶了解化學核酸酶u了解斷裂了解斷裂DNA的途徑的途徑 u掌握程度式瓊脂糖凝膠電泳的運用方法掌握程度式瓊脂糖凝膠電泳的運用方法 化學核酸酶化學核酸酶uSigma把生理條件下借助于氧化或光活化產(chǎn)生活性氧中把生理條件下借助于氧化或光活化產(chǎn)生活性氧中間產(chǎn)物導致核酸骨架斷裂，即顯示出

2、與天然核酸酶一樣間產(chǎn)物導致核酸骨架斷裂，即顯示出與天然核酸酶一樣或類似生物活性的過渡金屬配合物及其載體衍生物稱為或類似生物活性的過渡金屬配合物及其載體衍生物稱為化學核酸酶。化學核酸酶。u化學核酸酶既有限制性內(nèi)切酶的高度專注性，又能在化學核酸酶既有限制性內(nèi)切酶的高度專注性，又能在人們預(yù)先設(shè)計的任何位點斷裂人們預(yù)先設(shè)計的任何位點斷裂DNA，而且抑制了傳統(tǒng)的，而且抑制了傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶識別位點僅為限制性內(nèi)切酶識別位點僅為48個核苷酸的限制，還具個核苷酸的限制，還具有分子小、構(gòu)造簡單、易于提純、本錢低等優(yōu)點。有分子小、構(gòu)造簡單、易于提純、本錢低等優(yōu)點。u可用于基因分別、染色體圖譜分析、大片段基因的序

3、可用于基因分別、染色體圖譜分析、大片段基因的序列分析以及列分析以及DNA定位誘變、腫瘤基因治療與新的化學療定位誘變、腫瘤基因治療與新的化學療法等領(lǐng)域。法等領(lǐng)域。DNA斷裂的途徑斷裂的途徑u水解斷裂水解斷裂DNA。僅影響磷酸二酯鍵，不呵斥堿基和核。僅影響磷酸二酯鍵，不呵斥堿基和核糖環(huán)損傷。糖環(huán)損傷。 u氧化斷裂氧化斷裂DNA。以氧化作用攻擊。以氧化作用攻擊DNA的核糖環(huán)及堿的核糖環(huán)及堿基，產(chǎn)生各種氧化物，可以直接引起基，產(chǎn)生各種氧化物，可以直接引起DNA的單鏈或雙的單鏈或雙鏈發(fā)生斷裂。鏈發(fā)生斷裂。 u光斷裂光斷裂DNA。化合物經(jīng)過光反響產(chǎn)生多種氧化性的自?；衔锝?jīng)過光反響產(chǎn)生多種氧化性的自在基，

4、如超氧陰離子在基，如超氧陰離子O2，超氧自在基，超氧自在基OOH或羥基自在基或羥基自在基OH等。這些物質(zhì)都等。這些物質(zhì)都可以氧化可以氧化DNA的鳥嘌呤堿基，從而使的鳥嘌呤堿基，從而使DNA發(fā)生斷裂。發(fā)生斷裂。 程度式瓊脂糖凝膠電泳程度式瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 天然瓊脂天然瓊脂Agar是一種多聚糖，主要由瓊脂糖是一種多聚糖，主要由瓊脂糖Agarose ，約占，約占80及瓊脂膠及瓊脂膠Agaropectin組組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基

5、的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲景象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而較強的電滲景象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分別效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，影響電泳速度及分別效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進展平板電泳。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進展平板電泳。uDNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。u核酸為兩性分子，在核酸為兩性分子，在pH3.5時，整個分子帶正電；時，整個分子帶正電；pH8左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶

6、負電。左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負電。 u可進展分別。可進展分別。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。u可以分別相對分子質(zhì)量一樣，但構(gòu)型不同的可以分別相對分子質(zhì)量一樣，但構(gòu)型不同的DNA分子。分子。u共價閉環(huán)超螺旋共價閉環(huán)超螺旋DNAccDNA直線直線DNALDNA，2條鏈發(fā)生斷裂開環(huán)的雙鏈環(huán)狀條鏈發(fā)生斷裂開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNAocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂。條鏈發(fā)生斷裂。電泳實驗原理電泳實驗原理溴化乙錠溴化乙錠 (Ethidium Bromide, EB)uEB能插入能

7、插入DNA分子堿基對之間，導致分子堿基對之間，導致EB與與DNA結(jié)合。結(jié)合。DNA吸收的吸收的260nm的的紫外光傳送給紫外光傳送給EB，或者結(jié)合的，或者結(jié)合的EB本身本身在在300和和360吸收的射線，均可在可見光吸收的射線，均可在可見光區(qū)以區(qū)以590波長發(fā)射出來，呈橙紅色。波長發(fā)射出來，呈橙紅色。uEB染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的或更少的DNA即可檢即可檢出；可以加到樣品中可膠中。出；可以加到樣品中可膠中。uEB是誘變劑，運用時一定要戴手套。是誘變劑，運用時一定

8、要戴手套。 EB廢液要經(jīng)過處廢液要經(jīng)過處置才干丟棄。置才干丟棄。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容u Cu(phen)2(H2O)(ClO4)2的制備的制備u 銅配合物氧化斷裂銅配合物氧化斷裂 DNAu 瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠的制備 u DNA氧化斷裂的檢測氧化斷裂的檢測實驗試劑實驗試劑 u質(zhì)粒質(zhì)粒pBR322 DNAuCu(phen)2(H2O)(ClO4)2u Tris 緩沖液緩沖液1000 mL：稱：稱Tris 6.057 g (50 mM), NaCl 1.052 g (18mM), 再用鹽酸調(diào)理酸度到再用鹽酸調(diào)理酸度到pH = 7.2。u溴酚藍指示劑點樣緩沖液：溴酚藍指示劑點樣緩沖液： 10 mL

9、甘油甘油5 mL, Tris2緩沖溶緩沖溶液液5mL，溴酚蘭，溴酚蘭 0.0251 g，EDTA 0.186 g，pH8；2u1 g/ml溴化乙錠溶液溴化乙錠溶液 (瓊脂糖凝膠染色用瓊脂糖凝膠染色用)u電泳緩沖液電泳緩沖液TAE：40mmol/L Tris-乙酸，乙酸，1 mol/L EDTA (配制方法：配制方法：24.2克克Tris堿，堿，5.71ml冰乙酸，冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至，定容至5000mlu0.8% 瓊脂糖凝膠配制方法：稱取瓊脂糖瓊脂糖凝膠配制方法：稱取瓊脂糖0.4克，參與克，參與50ml TAE電泳緩沖液。電泳緩沖液。 實驗儀器實驗

10、儀器 u電磁攪拌器電磁攪拌器u恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋u微量移液器微量移液器u電泳儀電泳儀u程度電泳槽程度電泳槽u透射紫外察看儀透射紫外察看儀 實驗內(nèi)容一：銅配合物制備實驗內(nèi)容一：銅配合物制備NNNNCuOHH(ClO4)2將將Cu(ClO4)2.6H2O (270 mg, 1.0 mmol) 和和1,10-鄰菲咯鄰菲咯啉啉 (phen) (360 mg, 2.0 mmol) 參與參與15 ml甲醇中甲醇中, 25 oC下電磁攪拌半小時下電磁攪拌半小時, 產(chǎn)生的綠色沉淀經(jīng)減壓抽濾并用產(chǎn)生的綠色沉淀經(jīng)減壓抽濾并用少量的冷甲醇淋洗后少量的冷甲醇淋洗后, 再用再用P2O5真空枯燥真空枯燥. (參見文獻：

11、參見文獻：G. Murphy, C. Murphy, B. Murphy, B. Hathaway, J.Chem. Soc., Dalton Trans., 1997, 2653)實驗內(nèi)容二：銅配合物氧化斷裂實驗內(nèi)容二：銅配合物氧化斷裂DNA首先用首先用Tris緩沖液配置緩沖液配置Cu(phen)2(H2O)(ClO4)2溶液溶液200 M，為使樣品溶解，可參與不超越總體積，為使樣品溶解，可參與不超越總體積10%的的DMF和抗壞血酸溶液和抗壞血酸溶液(0.1 mM。在陳列固。在陳列固定好的樣品管里，依次用微量取液器參與定好的樣品管里，依次用微量取液器參與1 L 稀釋稀釋5倍的倍的pBR322

12、 DNA原液、原液、Cu(phen)2(H2O)(ClO4)2 (5 L和抗壞血酸和抗壞血酸 (1 L，再用，再用Tris緩沖液把一切緩沖液把一切樣品都補到樣品都補到10 L另外要有一個另外要有一個DNA的空白。的空白。37 oC下溫育下溫育1小時后，每個樣品管里加點樣液小時后，每個樣品管里加點樣液2 L，上，上樣，進展瓊脂糖凝膠電泳。樣，進展瓊脂糖凝膠電泳。 實驗內(nèi)容三：瓊脂糖凝膠的制備實驗內(nèi)容三：瓊脂糖凝膠的制備u選擇適宜的程度式電泳槽，調(diào)理電泳槽平面至程度。檢查穩(wěn)壓電源選擇適宜的程度式電泳槽，調(diào)理電泳槽平面至程度。檢查穩(wěn)壓電源與正負極的線路。與正負極的線路。u選擇孔徑大小適宜的點樣梳子，

13、垂直架在電泳膠模的一端，使點樣選擇孔徑大小適宜的點樣梳子，垂直架在電泳膠模的一端，使點樣梳子底部離電泳膠模底部的間隔為梳子底部離電泳膠模底部的間隔為1.0mm。u制備制備1%瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠，100水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。 u用吸管取少量瓊脂糖凝膠溶液將電泳膠模四縝密封好，防止?jié)补喹傆梦苋∩倭凯傊悄z溶液將電泳膠模四縝密封好，防止?jié)补喹傊悄z板時發(fā)生浸透。待瓊脂糖凝膠冷卻至脂糖凝膠板時發(fā)生浸透。待瓊脂糖凝膠冷卻至60左右時，參與一滴左右時，參與一滴溴化乙錠，搖勻，悄然倒入電泳膠模中，瓊脂糖凝膠的厚度在溴化乙錠，搖勻，悄然倒入電泳膠模中，瓊脂糖凝膠的厚度在

14、35mm。倒膠時要防止產(chǎn)生氣泡，假設(shè)有氣泡可用吸管小心吸去。倒膠時要防止產(chǎn)生氣泡，假設(shè)有氣泡可用吸管小心吸去。u瓊脂糖凝膠凝固后，在室溫放置瓊脂糖凝膠凝固后，在室溫放置20分鐘，小心拔掉點樣梳子和電泳分鐘，小心拔掉點樣梳子和電泳膠模兩端的擋板，堅持點樣孔的完好。膠模兩端的擋板，堅持點樣孔的完好。u將電泳膠模放入電泳槽中，參與電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出將電泳膠模放入電泳槽中，參與電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠外表瓊脂糖凝膠外表12mm。如點樣孔內(nèi)有氣泡，用吸管小心吸出，以。如點樣孔內(nèi)有氣泡，用吸管小心吸出，以免影響加樣。免影響加樣。實驗內(nèi)容四：實驗內(nèi)容四：DNA氧化斷裂的檢測氧化斷

15、裂的檢測u將實驗二得到的反響液樣品與將實驗二得到的反響液樣品與1/5體積的溴酚藍指示劑點樣緩體積的溴酚藍指示劑點樣緩沖液混合。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度，使樣品均勻沖液混合。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣品孔內(nèi)，還可以使樣品帶顏色，便于上樣和估計電泳時沉到樣品孔內(nèi)，還可以使樣品帶顏色，便于上樣和估計電泳時間和判別電泳的位置。間和判別電泳的位置。u用微量移液器將樣品小心參與加樣孔內(nèi)，記錄樣品點樣次序。用微量移液器將樣品小心參與加樣孔內(nèi)，記錄樣品點樣次序。 u蓋上電泳槽，開啟電源開關(guān)，最高電壓不超越蓋上電泳槽，開啟電源開關(guān)，最高電壓不超越5V/cm100150V恒壓電泳，

16、使恒壓電泳，使DNA從負極向正極挪動。從電泳槽中取出從負極向正極挪動。從電泳槽中取出凝膠，將凝膠置于凝膠，將凝膠置于1 ug/ml溴化乙錠水溶液中，室溫下振搖染色溴化乙錠水溶液中，室溫下振搖染色3045分鐘。回收染色液，自來水沖洗凝膠后，于紫外燈下察看。分鐘?；厥杖旧?，自來水沖洗凝膠后，于紫外燈下察看。u電泳時間隨實驗的詳細要求而異。電泳普通需電泳時間隨實驗的詳細要求而異。電泳普通需13小時。電小時。電泳終了后封鎖電源，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡能夠?qū)⒁挥窘K了后封鎖電源，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡能夠?qū)⒁磺械碾娪揪彌_液淋干，在切的電泳緩沖液淋干，在254nm波長的透射紫外燈下察看。波長的

17、透射紫外燈下察看。 參考文獻參考文獻 uSigman D. S., Mazumder A. Perrrin D. M. Chem. Rev. 1993, 93, 2295uSigman D. S., Acc. Chem. Res., 1986, 19, 180.uDetmer III C. A., Pamatong F. V., Bocarsly J. R., Inorg. Chem., 1996, 35, 6292.u劉長林，周井炎，徐輝碧，無機化學學報，劉長林，周井炎，徐輝碧，無機化學學報，1998，3，253.uSteenken S., Jovanovic S., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 617.uHazlewood C., Davies M. J., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1995, 895.uChakravartya A. R.,