試驗(yàn)二細(xì)菌的染色及形態(tài)觀察

1、實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的染色及形態(tài)觀察一、目的要求1、了解細(xì)菌染色的基本原理。2、掌握細(xì)菌的簡(jiǎn)單染、革蘭氏染色及其他染色方法。3、觀察和識(shí)別細(xì)菌的形態(tài)及細(xì)菌細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明細(xì)菌菌體微小、 而且折光率低， 在顯微鏡下特別是在油浸物鏡下 幾乎與背景無(wú)反差，很難看清楚，如將其染色，使折光率增大，便容 易觀察。由于菌體的性質(zhì)及各部分對(duì)某些染料的著色性不同， 因此可 以利用不同的染色方法來(lái)區(qū)別不同的細(xì)菌及其結(jié)構(gòu)。用于細(xì)菌染色的染色劑是苯環(huán)上含有發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)的化 合物。發(fā)色基團(tuán)使化合物本身具有染色之能力， 助色基團(tuán)有電離特性， 可以于被染物結(jié)合，使被染物著色。染色劑有三種：酸性染色劑（電離后分子帶

2、負(fù)電荷） ；堿性染色 劑（電離后分子帶電荷） ；復(fù)合染色劑（在電離后分子不帶電荷，故 也稱為中性染色劑） 。酸性染色劑主要用于染細(xì)胞質(zhì)；堿性染色劑主 要用于染核和異染顆粒等細(xì)胞結(jié)構(gòu)； 復(fù)合染色劑主要用來(lái)染螺旋體和 立克次氏體。三、實(shí)驗(yàn)材料1、顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙。2、酒精燈、接種環(huán)、載玻片。3、石炭酸復(fù)紅染色液、革蘭氏染色液、莢膜染色液、鞭毛染色 液（配方見附錄）。四、方法步驟（一）簡(jiǎn)單染色法步驟：涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 鏡檢。1、涂片 在干凈的載玻片中央加一滴蒸餾水，以無(wú)菌操作法， 從斜面上挑取少量菌種，在載玻片上和水混合后，涂成一均勻薄層。2、干燥固定 涂片讓其在空氣

3、中自然干燥，有時(shí)為使其干燥得 快點(diǎn)，也可在酒精燈上加溫，但勿賢緊靠火焰。3、固定 待涂片干燥徨，手持載玻片一端，有菌膜的一面向上， 在酒精燈火焰上通過幾次（用手背觸載玻片背面，以不燙手為宜） ， 待冷卻后，再加染料。4、染色 玻片置于水平位置。加石炭酸復(fù)紅液于菌膜部位。染1-2min 。5、水洗 傾去染液，斜置玻片，用很細(xì)水流的自來(lái)水沖洗（切 勿使水流直接沖刷在菌膜處） ，直至洗下水呈無(wú)色為止。6、干燥 自然干燥或用吸水紙吸干。7、鏡檢。（二）革蘭氏染色法步驟：涂片 干燥 固定 結(jié)晶紫染色 水洗 吸干95% 酒精脫色 水洗 吸干 蕃紅復(fù)染 水洗干燥 鏡檢。1、涂片 同簡(jiǎn)單染色法2、干燥 同簡(jiǎn)單

4、染色法。3、固定 同簡(jiǎn)單染色法。4、用草酸結(jié)晶紫染色 1min 后水洗。5、加碘液媒染 1min。6、水洗。7、用 95%酒精脫色，直至流下的酒精不呈紫色即停止（大約半 分鐘）立即水洗。、復(fù)染 滴加蕃紅染液復(fù)染 1min。、水洗。10、干燥。11、鏡檢。（三）特殊染色法1、芽孢染色法 芽孢壁較厚，透性低，著色和脫色均較困難， 因此，芽孢染色需加熱，并用著色力強(qiáng)的染料。步驟：涂片 固定 孔雀綠染色 水洗 干燥 觀察1、涂片 取一載片，將枯草桿菌以無(wú)菌操作涂片。2、干燥 同簡(jiǎn)單染色法。3、固定 同簡(jiǎn)單染色法。4、加孔雀綠染液于涂片上，在火焰上加熱直至有蒸氣時(shí)開始計(jì)算時(shí)間，維持 3-5min 。加熱

5、時(shí)要隨時(shí)添加染色液，切片讓標(biāo)本干涸。5、水洗 待玻片冷卻后，用自來(lái)水水洗。6、復(fù)染 加蕃紅液復(fù)染 1-2min 。7、水洗 干燥。8、鏡檢。結(jié)果：芽孢呈綠色，芽孢周圍的菌體呈紅色。2、莢膜染色法（用固氮菌或肺炎雙球菌）步驟：1、在載片一端滴一滴自來(lái)水，取菌體置于其中。取一滴墨法與 菌懸液混合，并且用另一載片之一端，將此水滴在載片上刮成薄膜， 風(fēng)干。2、用純甲醇固家 1min。3、加 0.5%蕃紅液數(shù)滴于涂片上沖去甲醇，并染色 30S，然后傾 去染液，立即吸干，鏡檢。結(jié)果：背景黑色、莢膜無(wú)色，細(xì)胞紅色。3、鞭毛染色法（用熒光假單細(xì)胞或普通變形菌）細(xì)菌鞭毛極為 纖細(xì)，在普通光學(xué)顯微鏡下不能看到，

6、只有用特殊的染色方法，才 能把鞭毛顯示出來(lái)。 鞭毛染色的方法很多， 但主要原理都是采取不穩(wěn) 定的膠體溶液做媒染劑， 使在鞭毛上生成沉淀， 加粗鞭毛的直徑使其 達(dá)到光學(xué)顯微鏡辨晰限度以內(nèi)。步驟：要染色的細(xì)菌應(yīng)預(yù)先在新配制的斜面上傳 5-6 代。最后一代用的 斜面部應(yīng)放約 0.5 毫升的無(wú)菌水再進(jìn)行接種。 將最后一代長(zhǎng)好的菌用 細(xì)長(zhǎng)吸管從底部取出放入 1ml 無(wú)菌水中制成菌懸液。放 37溫箱活 化半小時(shí)再取制片。2、涂片 取一無(wú)劃痕且十分清凈無(wú)油脂的載片，可先將載片置 于洗液中浸漬數(shù)日， 用鑷子取后隨即以清水沖洗干凈 （沖洗時(shí)勿用手 指取捏玻片），再斜插于木架上，置 37恒溫箱內(nèi)任其干燥后備用。取上述菌懸液一滴，輕置玻片一端，玻片作傾斜放置，使菌液沿玻片 順向下流，自成一薄菌膜。3、干燥 讓其自然風(fēng)干。4、染色 先用染液 A染 2-4min, 水沖洗,再用 B液染 3