掃描電鏡的結(jié)構(gòu)與操作.doc

掃描電鏡的結(jié)構(gòu)與操作透射電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡一樣，照明束穿過樣品経過透鏡的放大后，整個像是同時形成的。而掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，簡稱掃描電鏡或SEM)則以完全不同的方式成像。其基本要點是：用極狹窄的電子束去掃描樣品，即電子束在樣品上作光柵運(yùn)動。電子束與樣品相互作用將會產(chǎn)生各種信息，例如樣品的二次電子發(fā)射，發(fā)射出來的電子稱為二次電子。使用我們下面將討論的方法，二次電子能產(chǎn)生樣品表面放大的形貌像。這個像是在樣品被掃描時按時序地建立起來的，即使用逐點成像的方法獲得放大的像。 早在1935年，透射電鏡發(fā)明后不久，Knoll就提出利用一個掃描電子束從固體表面獲得圖像的原理。但由于技術(shù)上的原因，直至1965年掃描電鏡才成為商品而被利用。此后，由于掃描電鏡具有許多優(yōu)點，使它在許多學(xué)科包括生物學(xué)的各個方面獲得廣泛的應(yīng)用，成為極有價值的工具。 結(jié)構(gòu)掃描電鏡主要是由電子光學(xué)系統(tǒng)和顯示單元組成，電子光學(xué)系統(tǒng)也稱為鏡筒，它的外觀與透射電鏡的鏡筒相似，實際上相當(dāng)于透射電鏡的照明系統(tǒng)(SEM不需要成像系統(tǒng))，它是由電子槍、幾個磁透鏡、掃描線圈以及樣品室組成(見圖2-1) 電子槍與透射電鏡的電子槍基體相同，只是加速電壓較低，一般在40kV以下。磁透鏡一般有三個：第一、二聚光鏡和物鏡，其作用與透射電鏡的聚光鏡相同：縮小電子束的直徑，把來自電子槍的約30m大小的電子束經(jīng)過第一、二聚光鏡和物鏡的作用，縮小成直徑約為幾十埃的狹窄電子束。這是因為掃描電鏡的分辨率主要取決于電子束的直徑，所以要盡可能縮小它,為此物鏡還裝備有物鏡可動光欄和消散器。 一個帶有掃描電路的偏轉(zhuǎn)線圈通以鋸齒波的電流，產(chǎn)生的磁場作用于電子束上使它在樣品上掃描。掃描的區(qū)域、掃描速率和每厘米的掃描線數(shù)都可以選擇。這個電路同時輸送鋸齒波電流給顯示部分的顯像管(CRT)的偏轉(zhuǎn)線圈，所以鏡筒的電子束與顯像管的電子束是嚴(yán)格同步的。出于與透射電鏡同樣的理由，鏡筒也是被真空系統(tǒng)排氣至高真空，一般為10-3Pa的真空度。掃描電鏡的真空系統(tǒng)也與透射電鏡的真空系統(tǒng)相似，由機(jī)械泵、擴(kuò)散泵、檢測系統(tǒng)、管道及閥門等組成。樣品室位于鏡筒的底部，樣品放于樣品臺上，樣品臺帶有使樣品移動(前后、左右、上下)、傾斜和旋轉(zhuǎn)的控制桿。為了能觀察大塊樣品，樣品室是大于透射電鏡的。與透射電鏡一樣，掃描電鏡的鏡筒也有一套合軸調(diào)整裝置，但相對比較簡單。 顯示單元包括信號的收集、放大、處理、顯示與記錄部分(見圖22)。信號的收集是由探測器(或稱收集器,見圖23)完成，二次電子的探頭是一個閃爍片，這是一個圓形玻璃片，其上鍍有約0.07m厚的鋁導(dǎo)電層，在導(dǎo)電層上加上+10kY的高壓。入射電子射到樣品上引起的二次電子發(fā)射,二次電子被高壓吸引射到閃爍片上使其發(fā)光，在閃爍片后面接上一光導(dǎo)棒，用它把閃爍片產(chǎn)生的光信號送到它后面的光電倍增管。經(jīng)光電倍增管放大接到后面的前置放大器和視頻放大器，最后接到顯像管的柵極。 顯示和記錄部分包括兩個顯像管和照相機(jī)。一個顯像管是長余輝的，用于觀察，另一顯像管是高分辨率的、短余輝的，用于照相。為了完成聚焦、消散以及放大率，視野和加速電壓的選擇以及反差與亮度的調(diào)節(jié)，需一系列的電路以及相應(yīng)的調(diào)節(jié)旋鈕。 編輯成像原理掃描電鏡的工作過程是這樣的：從電子槍燈絲發(fā)出的直徑約2035m的電子束，受到陽極的140kV高壓的加速射向鏡筒，并受到第一、二聚光鏡(或單一聚光鏡)和物鏡的會聚作用，縮小成直徑約幾十埃的狹窄電子束射到樣品上。與此同時，偏轉(zhuǎn)線圈使電子束在樣品上作光柵狀的掃描。電子束與樣品相互作用將產(chǎn)生多種信號，其中最重要的是二次電子。各種信息的探測要用不同的探測器，二次電子探測器如上所述，二次電子能量很低(小于50eV)，受到閃爍片上的高壓(+10kV)的吸引而加速射向閃爍片，閃爍片受到二次電子的沖擊把電子的動能轉(zhuǎn)變成可見光，光通過光導(dǎo)棒送到光電倍增管，在那里光被高倍放大并轉(zhuǎn)換成為電流。這個電信號經(jīng)過前置放大、視頻放大后，用它去調(diào)制顯像管的亮度。由于控制鏡筒入射電子束的掃描線圈的電路同時也控制顯像管的電子束在屏上掃描，因此兩者是嚴(yán)格同步的，在樣品上被掃描的區(qū)域與顯像管的屏是點點對應(yīng)的。在樣品上任何一點上的二次電子發(fā)射的強(qiáng)度的任何變化將表現(xiàn)為在屏上對應(yīng)點的亮度的變化，用這種方法就如電視機(jī)屏上的像一樣，一點一點，一線一線地組成了像。這個像可以在觀察顯像管的屏上觀察，也可以把照相顯像管屏上的像拍攝記錄下來。 由二次電子所形成的像二次電子像，反映了樣品表面的形貌。我們可以這樣理解：二次電子像每一點的相對亮度取決于樣品對應(yīng)點的二次電子發(fā)射率，每點的二次電子發(fā)射率取決于電子束的加速電壓、束流、電子束的入射角(即入射束與樣品表面法線間的夾角)和樣品原子序數(shù)。對于加速電壓和束流給定的電子束，二次電子發(fā)射率主要取決于電子束的入射角； 次電子發(fā)射率 可見，二次電子的產(chǎn)生額隨入射角的變化而變化，這個問題可以圖24作定性的說明。二次電子的發(fā)射是由于入射電子碰撞樣品的核外電子，核外電子獲得能量脫離原子而成為二次電子。因此二次電子只產(chǎn)生于入射電子的散射區(qū)域，這個散射區(qū)域呈“淚滴”狀的。二次電子的能量很低(50eV)，所以能逸出固體表面而進(jìn)入空間的電子，只限于發(fā)生在非常靠近樣品表面(大約100 )的二次電子。在圖24(a)的情況，電子束垂直入射， =0,散射區(qū)與樣品表面非常接近的區(qū)域面積很少，故二次電子發(fā)射很少。在(b)和(c)的情況， 0，散射區(qū)與樣品表面接近的區(qū)域面積較大，故二次電子發(fā)射就多。當(dāng) 90，二次電子發(fā)射最多。所以二次電子的產(chǎn)生額隨入射角而變化。當(dāng)樣品表面是凹凸不平時，入射角不斷改變，二次電子的產(chǎn)生額也隨之而變化，二次電子像的亮度也隨著樣品的表面形貌而變化，所以二次電子像能反映樣品表面的形貌。實際的像與日常照片中的負(fù)片相似。圖25是在掃描電鏡中樣品表面形貌(剖面)和二次電子產(chǎn)生額的對應(yīng)關(guān)系，說明二次電子像確實是反映樣品表面的形貌。 此外關(guān)于放大倍數(shù)，分辨率以及焦深等作簡單介紹如下： 放大倍率：掃描電鏡像的放大倍率(M)由屏的大小(某邊長乚)與電子束在樣品上掃描區(qū)域的大小(對應(yīng)邊長l)的比例決定：M=l/L。通常顯像管屏的大小是固定的，而電子束掃描區(qū)域大小很容易通過改變偏轉(zhuǎn)線圈的交變電流的大小來控制。因此掃描電鏡的放大倍數(shù)很容易從幾倍一直達(dá)到幾十萬倍，而且可以連續(xù)地迅速地改變，這相當(dāng)于從放大鏡到透射電鏡的放大范圍。這是掃描電鏡的一大優(yōu)點。 分辨本領(lǐng)：掃描電鏡像的分辨本領(lǐng)取決于一些因素，其中最主要的是電子束斑的直徑。但電子槍亮度，樣品的性質(zhì)，相互作用的方式以及掃描速度和像的線數(shù)也是有關(guān)的。二次電子由于作用區(qū)最小因而像的分辨率最高，接近電子束斑直徑。其他如背散射電子、X射線以及陰極熒光等作用區(qū)較大因而像的分辨率較低。目前商品掃描電鏡的二次電子像的分辨率一般達(dá)到20-30 ，使用場發(fā)射電子槍可達(dá)約5 。 焦點深度(即焦深)：焦深是指保持像清晰(即保持一定的分辨率)的條件下，物面允許的移動范圍。大的焦深不僅使聚焦變得容易，而且對于凹凸不平的樣品仍然獲得清晰的像，從而增強(qiáng)了像的立體感，使圖象易于分析。掃描電鏡的焦深很大，這是由于電子束孔徑角很小的原因。從而造成掃描電鏡像的立體感非常強(qiáng)，這也是掃描電鏡的另一大優(yōu)點。 編輯掃描電子顯微鏡的功能和特點編輯功能由于掃描電鏡是採用逐點掃描的方法獲得放大的像，因此入射電子與樣品的相互作所產(chǎn)生的全部信息，只要有合適的探測器，掃描電鏡都能用它們來成像，因而功能很多。這是掃描電鏡又一大優(yōu)點。那么電子與樣品相互作能產(chǎn)生那此信息，它們反映樣品什幺性質(zhì)呢？電子與樣品的相互作用會產(chǎn)生多種的信息，基本上分成兩大類：一是電子，有二次電子(Secondary electron)、背散射電子(或稱反射電子，Back scattered electron)；俄歇電子(Auger electron)、透射電子(Transmission electron)、吸收電子(Absorbed electron)等。二是射錢，有X射線和陰極熒光(Cathodoluminescence)等。下面作簡單的介紹： 二次電子：入射電子與樣品的核外電子碰撞，使后者脫離原子變成二次電子。用二次電子所成的二次電子像反映了樣品表面的形貌，它的分辨率最高，是掃描電鏡主要的用途。 背散射電子：是入射電子被樣品反射回來的一次電子，用背散電子獲得的圖像有兩種情況：一種可以反映樣品表面的形貌與二次電子像相似，優(yōu)點是較穩(wěn)定，不受充電效應(yīng)和污染的影響，缺點是分辨率較低。另一種情況是反映樣品的密度和原子序數(shù)。利用這種特性，可以將生物組織中各種細(xì)胞用重金屬染色，再把它檢測出來。這種組織化學(xué)和掃描電鏡結(jié)合的方法已受到廣泛的重視。 X射線：入射電子與樣品核外電子碰撞使后者脫離原子變成二次電子，而原子在失掉一個電子后變成離子，此稱電離。電離使原子處于較高能量激發(fā)態(tài)，這是不穩(wěn)定的。外層電子會迅速填補(bǔ)內(nèi)層電子空穴而使能量降低，稱為復(fù)位。如一個原子在入射電子的作用下失掉一個K層電子，它就處于K激發(fā)態(tài)，能量是Ek。當(dāng)一個L2層電子填補(bǔ)了這個空穴后，K電離就變成L2電離，能量由Ek變?yōu)镋L2這就會有數(shù)值等于(Ek-EL2)的能量釋放出來。能量釋放可以采取兩種方式：一種是產(chǎn)生X射線，即該元素的K輻射。X射線的波長是有特定數(shù)值，隨元素不同而異。這種X射線一般稱為特征X射線或標(biāo)識X射線。如果我們測定出特征X射線的波長及強(qiáng)度就能對樣品成分進(jìn)行定性和定量的分析。用特征X射線對樣品進(jìn)行成分析的方法有二種： 波長分散X射線微區(qū)分析法(Wavelength dispersive Xray microanalysis，簡稱WDX) 能量分散X射線微區(qū)分析法(Energy dispersive Xray microanalysis，簡稱EDX) 前者優(yōu)點是分辨率高，分析范圍大，但靈敏度低，速度慢，容易造成樣品的污染與損傷，適宜于定量分析。后者優(yōu)點是靈敏度高，簡單快速，對樣品污染和損傷小，但分析范圍窄，分辨率低，適宜于定性分析。無論是EDX或WDX都越來越廣泛應(yīng)用于生物學(xué)中。尤其EDX，與計算機(jī)結(jié)合對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實用而有效。 Auger電子：另一種能量釋放方式是繼續(xù)發(fā)生電離。上述K層電子復(fù)位釋放出的能量(EKEL2)，使另一核外電子脫離原子變成二次電子。如果ExEL2EL2，就可能使L2層電子逸出，產(chǎn)生相應(yīng)的電子空穴，這種二次電子稱為KL2L2電子。它的能量近似地等于EK-EL2-EL2,也有固定值，隨元素不同而異。這種具有特征能量值的電子是俄歇(Auger)在1925年發(fā)現(xiàn)的，故稱為俄歇電子。既然俄歇電子有特征能量，我們就可以利用它來進(jìn)行樣品元素分析，稱為俄歇電子能譜分析(Auger Electron Spectroscopy簡寫為AES)。綜上所述，K激發(fā)及復(fù)位釋放出來的能量或者產(chǎn)生K幅射(X射線)或者給出K俄歇電子，這兩個過程是對立的，有此無彼的。在輕元素俄歇電子放出率高而X射線低，在重元素則正好相反。故X射線適合于重元素的成份分，而俄歇電子適合于輕元素的成份分析。 陰極熒光：入射電子與樣品相互作用而發(fā)射出可見光或紅外光,紫外光的現(xiàn)象稱為陰極熒光。陰極熒光具有一種電子束激發(fā)的光譜，和原子里面層狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此，若將熒光光譜進(jìn)行分光分析，可用來鑒別主體物質(zhì)和分析雜質(zhì)含量，是非常富有發(fā)展前景的分析手段，甚至有人期待于向免疫陰極熒光(immunocathodoluminescence)的方向發(fā)展。Pease和hayes使用陰極熒光來觀察用硫黃素(Thioflavin，T)染色的菠萊葉，可以看到這種染料選擇性地分布手細(xì)胞壁上。此外還有透射電子，由它成的像和透射電鏡成像基本一致。上述可見，掃描電鏡不單能觀察樣品表面形貌，而且還能對樣品的微區(qū)成分進(jìn)行定性和定量的分析等。這種能對樣品進(jìn)行多種性能的分析,是掃描電鏡的一個大優(yōu)點。 編輯特點綜合上述，我們可以看出掃描電鏡具有一些極有價值的特點。 1. 它能在很大的放大倍數(shù)范圍工作，從幾倍到幾十萬倍，相當(dāng)于從放大鏡到透射電鏡的放大范圍。以致使用者可以首先概觀整個樣品：如昆蟲、植物種子等，然后迅速轉(zhuǎn)換到觀察某些選擇的結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)，這給觀察帶來很大的方便。 2. 掃描電鏡具有很大的焦深,其焦深300倍于光學(xué)顯微鏡。例如在放大倍數(shù)是500倍時，焦深可達(dá)1000m。因而對于復(fù)雜而粗糙的樣品表面，仍然可得清晰聚焦的圖像。并且圖像立體感強(qiáng)，易于分析。 3. 由于樣品與終像之間沒有透鏡，使掃描電鏡的操作十分簡單。 4. 樣品制備較簡單，甚至可以不作任何處理。并且樣品可以很大，如直徑可達(dá)10cm以上。 5. 在觀察樣品表面形貌的同時又可對樣品進(jìn)行微區(qū)成分的無損分析。 編輯掃描電子顯微鏡的實踐掃描電鏡的操作，因型號不同而有所差異，但一般要較透射電鏡容易。隨著儀器自動化程度的提高，操作越來越簡便。但是要熟練地運(yùn)用掃描電鏡，并能獲得高質(zhì)量的照片，仍然需要掌握一定的要領(lǐng)。 編輯一般的操作掃描電鏡的一股操作步驟如下： 1. 啟動電鏡。包括接通電源，開動真空系統(tǒng)進(jìn)行排氣，在真空度達(dá)到要求后，接通顯示單元電源。 2. 放入樣品，注意調(diào)節(jié)樣品高度。 3. 設(shè)定觀察條件。這些條件包括：加速電壓、束電流、光欄直徑、工作距離、放大倍率以及傾斜角等。注意選擇好視野。 4. 聚焦，消散。 5. 照相攝影。根據(jù)底片特性選擇合適的反差、亮度及拍攝時間。 6. 停機(jī)。關(guān)掉電源和冷卻水。 正確操作的目的是為了獲得高質(zhì)量的照片。高質(zhì)量的照片應(yīng)滿足以下要求： 分辨率高; 視野選擇好; 圖像景深大，立體感強(qiáng); 圖像層次豐富，即要求反差與亮度適當(dāng); 要獲得高質(zhì)量的照片就要求正確地操作和正確地選擇觀察條件。操作具體步驟，各型號儀器有所不同，儀器說明書有詳盡介紹。這里簡單介紹操作中幾個帶有普遍性的問題： 1. 合軸:與透射電鏡一樣，掃描電鏡也應(yīng)良好地合軸，合軸不良將引起像差使分辨率下降，而且會便訊號減弱，降低信噪比，使圖像質(zhì)量變差。物鏡光欄不合軸，使像散無法消除，從而降低分辨率。在操作中如發(fā)現(xiàn)聚焦過程圖像移動，有可能是物鏡光欄不對中，此時像散無法徹底消除。 2. 聚焦和消散:消散和聚焦是需要熟練掌握的操作，稍有不慎圖像質(zhì)量明顯下降，兩者是交替同時進(jìn)行的。方法如下：首先放大倍數(shù)放在10000倍以上，先粗聚焦，然后在像中選擇一邊緣清晰，反差較強(qiáng)的小顆粒，在焦點附近反復(fù)做稍欠焦正焦稍過焦操作。如果存在像散，就會出現(xiàn)在欠焦和過焦時像被拉長，而且欠焦與過焦時拉長方向是垂直的；在正焦時像不被拉長但不清晰。此時在正焦情況調(diào)節(jié)消散器的方位和大小，直至圖像最清晰為止。然后重做欠焦正焦過焦操作，如果圖像沒有被拉長，說明像散已被消除。此時可進(jìn)行精確聚焦，由于掃描電鏡在改變放大倍率時焦點不變，因此，聚焦時通常把放大倍數(shù)放在拍攝時使用的倍數(shù)的23倍進(jìn)行，這樣更容易判斷是否正焦；調(diào)節(jié)聚焦旋鈕至圖像最清晰就是正焦。值得注意的是：樣品高度改變，焦點就會改變，就要重新進(jìn)行聚焦。因此，移動樣品后，樣品高度可能有所變化，此時必須重新聚焦。 3. 反差和亮度的調(diào)整:如果圖像的反差與亮度調(diào)整不當(dāng)，會使圖像層次少，細(xì)節(jié)會掉失。通常掃描電鏡圖像的反差調(diào)整是靠改變光電倍增管的電壓(300600V)來進(jìn)行的，而亮度是靠改變信號的直流成分來調(diào)節(jié)。但是一般來說，增加反差也增加了直流成份，因而亮度水平也會增高，所以調(diào)節(jié)反差要和調(diào)節(jié)亮度水平同時進(jìn)行。過高過低的反差或亮度，圖像細(xì)節(jié)會掉失。在拍攝時應(yīng)根據(jù)底片的型號和特性來調(diào)整反差和亮度，而圖像的反差大小與亮度水平由曲線的振幅和高低來確定。 編輯掃描電子顯微鏡圖像的缺陷掃描電子顯微鏡圖像由于種種原因會發(fā)生多種的缺陷，我們了解這些缺陷及產(chǎn)生原因，就可以在實驗中盡可能避免或減少這些圖像缺陷，從而獲得高質(zhì)量的圖像。常常發(fā)生的圖像缺陷有: 荷電效應(yīng)： 當(dāng)入射電子作用于樣品時，從樣品上會發(fā)出二次電子、背散射電子和俄歇電子(假定電子不能穿透樣品而無透射電子)。但主要是二次電子，它的數(shù)量遠(yuǎn)大于后兩者，二次電子的發(fā)射率會隨入射電子的加速電壓而變化。圖26是表示二次電子發(fā)射率隨入射電子的加速電壓變化的曲線，圖中橫軸Vo表示入射電子的加速電壓?？v軸表示二次電子發(fā)射數(shù)與入射電子數(shù)之比。 Image:Example.jpg 從圖中可見，只有在Vo=Vol和V0=V02， 等于l，即入射電子數(shù)與二次發(fā)射電子數(shù)相等，此時樣品既不增加電子也沒有失掉電子，樣品不帶電。除此兩點外， 1，樣品會因吸收或失障電子而帶電。一般電鏡的加速電壓VoV02(例如金的V01=150，V02=2000V)。如果樣品不導(dǎo)電(生物樣品一般不導(dǎo)電)，此時樣品會因吸收電子而帶負(fù)電。就會產(chǎn)生一個靜電場干擾入射電子束和二次電子發(fā)射，并且當(dāng)電荷積累到一定程度會發(fā)生放電，這些會對圖像產(chǎn)生嚴(yán)重影響此稱荷電效應(yīng)，荷電效應(yīng)對圖像會產(chǎn)生一系列的影響： 異常反差。由于荷電效應(yīng)，二次電子發(fā)射受到不規(guī)則影響，造成圖像一部分異常亮，另一部分變暗(圖27)。 圖像畸變。由于靜電場作用使電子束被不規(guī)則地偏轉(zhuǎn)，結(jié)果造成圖像的畸變或出現(xiàn)階段差。 圖像漂移。由于靜電場作用使電子束不規(guī)則偏移引起圖像的漂移。 亮點與亮線。帶電樣品常常發(fā)生不規(guī)則放電，結(jié)果圖像中出現(xiàn)不規(guī)則的亮點和亮線。 出現(xiàn)像散。由于靜電場作用使電子束難于聚集，或使得像散方向發(fā)生變化，以致無法消除。 減少荷電效應(yīng)的方法有如下： 導(dǎo)電法。用金屬鍍膜、導(dǎo)電染色等方法使樣品本身導(dǎo)電，使吸收電子通過樣品臺流向“地”，從而消除荷電效應(yīng)。生物樣品幾乎都采用這方法，但不是能完全消除。 降低電壓法。把加速電壓降低，使Vo=V02, =1，入射電子數(shù)與二次電子發(fā)射數(shù)相等，就不產(chǎn)生電荷積累，消除荷電效應(yīng)。通常使用加速電壓為15kV。但因此會使分辨率下降。 快速觀察法。以盡快的速度觀察和拍攝，使荷電效應(yīng)影響不大時結(jié)束。一旦出現(xiàn)較明顯的荷電效應(yīng)只能改變觀察區(qū)域或更換樣品。另外，應(yīng)盡可能用低倍觀察。因為倍數(shù)越大，掃描范圍越小，電荷積累越迅速，影響越大。 邊緣效應(yīng): 在電子與樣品相互作用的介紹中指出，二次電子的發(fā)射數(shù)量取決于“淚滴”形的電子散射區(qū)域與樣品表面接近的面積大小。這樣在樣品表面凹凸變化大的邊緣區(qū)域，散射區(qū)域與樣品表面接近的面積異常增大，結(jié)果使邊緣區(qū)域二次電子發(fā)射異常地增加。在圖像中這些區(qū)域特別亮，造成不自然的反差，這稱為“邊緣效應(yīng)”如圖28所示，凹凸的邊緣特別亮。這雖然并非由于操作引起的圖像缺陷，但可通過適當(dāng)?shù)牟僮鞅M量減少。主要減少方法是降低加速電壓，它可以使邊緣效應(yīng)相對減輕。 污染: 污染主要是鏡筒真空中油和脂的蒸氣等碳?xì)浠衔锖蜌埓娴乃魵猓陔娮邮淖饔孟露纸?，碳等物質(zhì)聚積在電子照射的部位而引起的。結(jié)果造成： 由于污染物的覆蓋，使樣品表面精細(xì)結(jié)構(gòu)被遮蔽，從而使分辨率下降。 由于污染覆蓋物的二次電子發(fā)射率低，使二次電子發(fā)射數(shù)目下降，從而造成污染區(qū)變暗。 當(dāng)然，污染物同樣也會污染鏡筒使像散增加，從而使掃描電鏡分辨率下降。 觧決污染的方法有： 改善電鏡真空，減少真空中的油、脂的蒸氣和水蒸氣。 快速觀察，在污染還不嚴(yán)重時完成觀察和記錄。 如果被污染區(qū)域的圖像質(zhì)量顯著下降，應(yīng)更換觀察區(qū)域或更換樣品。 損傷：掃描電鏡觀察時，樣品可能受到的損傷有：真空損傷；電子束損傷。生物樣品從大氣中放入真空中時，就會產(chǎn)生真空損傷，主要是由于樣品干燥引起的。努力避免真空損傷是掃描電鏡生物樣品制備的一個重要課題，臨界點干燥法是一種較好方法。電子束損傷是由于入射電子的能量引起的。由于電子束照射引起樣品照射點局部加熱造成樣品部分龜裂，也會引起化學(xué)結(jié)合的破壞。電子束損傷對某些對電子照射敏感的材料是一個嚴(yán)重影響，但對多數(shù)生物樣品影響不大嚴(yán)重。 減少電子損傷的辦法有；降低加速電壓，減小電子束流，盡可能用低倍觀察和拍攝；加厚噴鍍金屬膜。 編輯觀察條件的確定掃描電鏡的觀察條件，如加速電壓，光欄直徑，聚光鏡電流以及工作距離等，對掃描電鏡的圖像有明顯的影響。對不同樣品和不同的要求有各種選擇，而每種選擇都有其利弊。因此我們在工作中應(yīng)根據(jù)樣品特點及工作要求，權(quán)衡得失，選擇適當(dāng)?shù)挠^察條件。簡述如下： 1. 加速電壓效應(yīng)：電子束入射樣品的能量取決于加速電壓。加速電壓越高，電子深入樣品的深度大，散射區(qū)域范圍擴(kuò)大。相反加速電壓越低，掃描圖像的信息越限于表面，圖像就越能反映表面真實面貌。加速電壓越低，荷電效應(yīng)越小，使圖像質(zhì)量改善，灰度層次豐富而且電子束造成的損傷也減弱。但加速電壓越低，樣品表面對于污染變得更敏感。而且，加速電壓越高，電子束越容易聚集變細(xì)，易得到高分辨率，受外界干擾也較少，故合適于高倍工作。 2. 物鏡光欄的選擇：物鏡光欄直徑越小則掃描電鏡焦深越大，不單聚焦變得容易而且對于凹凸不平的復(fù)雜樣品，在低倍時仍然可獲得清晰聚焦的圖像，圖像立體感強(qiáng)，易于分析。其次使電子束最小束班直徑也縮小，從而提高像的分辨率。但光欄孔縮小會使束流減少，從而使信號減弱，信噪比下降而使噪音增大。此外，光欄會因孔徑小而易被污染從而產(chǎn)生像散，造成掃描電鏡性能下降。因此，權(quán)衡得失，根據(jù)需要選擇最佳物鏡光欄孔的直徑。 3. 工作距離的選擇：從物鏡對樣品的距離稱為工作距離(WD)，一般掃描電鏡的工作距離是在540mm之間。在高分辨率工作時，希望提高分辨率，要求獲得較小的束斑，就必須使用短焦距的強(qiáng)磁物鏡。因為強(qiáng)磁透鏡像差小，從而能獲得較小的束斑。而強(qiáng)透鏡的焦距小，就要求小的工作距離，如WD=5mm。在低倍觀察時，樣品凹凸不平，要求圖像有較大的焦深，則要使用大的工作距離，如WD=40mm。 4. 聚光鏡電流的選擇: 在掃描電鏡中聚光鏡的作用是縮小束斑直徑。聚光鏡電流增大，透鏡變強(qiáng)，聚光作用也大，束斑直徑變小，則圖像分辨率提高，但是，束流變?nèi)?，結(jié)果信號變?nèi)酰旁氡冉档?，噪音影響大，圖像質(zhì)量下降。因此，在要求高分辨率工作時；使用大的聚光鏡電流。在低倍工作時用小聚光鏡電流，以減少噪音影響。 結(jié)束語：掃描電鏡的特點顯著地不同于透射電鏡。后者重點在于達(dá)到高分辨率，對于細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)、生物大分子及其復(fù)合體、組裝體的高分辨結(jié)構(gòu)的研究，透射電鏡是一個十分令人滿意的儀器。然而，獲得高分辨率的代價是復(fù)雜的儀器和復(fù)