食品微生物檢驗基礎(chǔ)知識ppt課件

.,食品微生物檢驗,.,第一部分、食品微生物檢驗基礎(chǔ)知識,認(rèn)識微生物食品微生物的來源、食品腐敗食品微生物檢驗的任務(wù)和內(nèi)容微生物形態(tài)學(xué)檢驗、大小、數(shù)目檢驗培養(yǎng)基配制、滅菌、分離純化、接種及微生物培養(yǎng)微生物生理學(xué)檢驗,第二部分、食品微生物一般檢驗技術(shù),微生物檢驗的基本程序和要求檢樣制備菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌檢驗及相關(guān)國標(biāo),.,第一節(jié)認(rèn)識微生物,.,微生物從不知到知的過程,釀酒、天花，列文虎克、巴斯德、科赫,.,遠(yuǎn)古人類發(fā)現(xiàn)，吃剩的米粥數(shù)日后變成了醇香可口的飲料人類最早發(fā)明的酒,.,天花是感染痘病毒引起的，無藥可治，每4名天花病人當(dāng)中便有一人死亡，而剩余的3人卻要留下丑陋的痘痕。明代以后，人痘接種法盛行起來。到目前為止，天花是在在世界范圍被人類消滅或控制的第一個傳染病。,天花病毒,.,安東列文虎克荷蘭,格拉夫霍霍夫利特微生物的鼻祖,無孔不入的微生物，何時何地不在與人們打交道。甚至在我們體內(nèi)到處安營扎寨，自由出入?？墒?，人們不肉眼看見它們，因而幾千年來，人類竟不知道世界上還有微生物這東西存在。直到1673年列文虎克用自制顯微鏡發(fā)現(xiàn)了“小動物”的微生物世界！他一生當(dāng)中磨制500多個鏡片，制造400多種顯微鏡，其中只有9種至今仍有人使用。雖然他活著的時候就看到人們承認(rèn)了他的發(fā)現(xiàn)，但要等到100多年以后，當(dāng)人們在用效率更高的顯微鏡重新觀察列文虎克描述的“小動物”，并知道他們會引起人類嚴(yán)重疾病和產(chǎn)生許多有用物質(zhì)時，才真正認(rèn)識到列文虎克對人類認(rèn)識世界所作出的偉大貢獻(xiàn)。,.,法國科學(xué)家路易斯巴斯德(1822-1895)被后人譽(yù)為“微生物學(xué)之父”。,證實發(fā)酵由微生物引起,免疫學(xué)預(yù)防接種,鵝頸燒瓶實驗也創(chuàng)造了一種有效的滅菌方法巴氏滅菌法。,反駁微生物自然發(fā)生說,鵝頸燒瓶實驗,科學(xué)雖沒有國界，但科學(xué)家卻有自己的祖國,德國的波恩大學(xué)普法戰(zhàn)爭爆發(fā),.,傳染病是人類健康的大敵。從古至今，鼠疫、傷寒、霍亂、肺結(jié)核等許多可怕的病魔奪去了人類無數(shù)的生命。人類要戰(zhàn)勝這些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第一個發(fā)現(xiàn)傳染病是由病原細(xì)菌感染造成的人就是羅伯特科赫。,羅伯特科赫（18431910）-德國醫(yī)學(xué)家,羅伯特.科赫發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌一百周年,被后人尊為細(xì)菌學(xué)鼻祖，傳染病的克星，細(xì)菌學(xué)的奠基人和開拓者,2003年，經(jīng)過全球10個國家的科學(xué)家的共同努力，終于確認(rèn)了冠狀病毒是SARS的病原體。最終判定這種冠狀病毒是否真正的元兇，依靠的是100多年前德國偉大的細(xì)菌學(xué)家科赫提出的“科赫原則”。,1870結(jié)婚-1873年30歲生日-1910,.,腐敗-食品因變質(zhì)而產(chǎn)生臭氣、刺激味和毒性物質(zhì)的現(xiàn)象。變質(zhì)凡引起食品理化性質(zhì)發(fā)生改變的現(xiàn)象。防腐-防止或阻止微生物生長繁殖的方法。防腐劑-能殺死微生物或抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)消毒劑-用于殺滅傳播媒介上的微生物使其達(dá)消毒或滅菌要求的制劑。滅菌劑-可殺滅一切微生物(包括細(xì)菌芽孢)使其達(dá)到滅菌要求的制劑。無菌-不含有活的微生物的意思。商業(yè)無菌-殺滅在正常的商品管理條件下的貯運銷售期間有礙人類健康的細(xì)菌。無菌技術(shù)（無菌操作）：防止微生物進(jìn)入機(jī)體或物體的方法。,術(shù)語,.,概論,微生物概念：微生物是一個通稱，形體微小，結(jié)構(gòu)簡單的低等生物。,微生物類別：包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌、支原體、衣原體、立克次氏體、微藻及原生動物類等。,.,細(xì)菌,單細(xì)胞原核生物：光學(xué)顯微鏡（油鏡）下放大一千倍以上并染色才能清楚看見其個體。如人體腸道內(nèi)的大腸桿菌、糞鏈球菌，用于釀醋的醋酸桿菌，使牛奶變酸的乳酸桿菌，生產(chǎn)味精的谷氨酸短桿菌，生產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌等。,細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖，功能包括：保持細(xì)胞外形；抑制機(jī)械和滲透損傷；介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用；防止大分子入侵；協(xié)助細(xì)胞運動和分裂。細(xì)胞膜主要成分是磷脂，蛋白質(zhì)糖脂組成。功能包括：使細(xì)胞維持穩(wěn)定代謝的胞內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)和選擇物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)主要成分是可溶性酶、糖、無機(jī)鹽和水等。功能包括：進(jìn)行新陳代謝的主要場所，絕大多數(shù)的化學(xué)反應(yīng)都在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。同時它對細(xì)胞核也有調(diào)控作用。細(xì)胞核含有DNA是細(xì)胞的控制中心，在細(xì)胞的代謝、生長、分化中起著重要作用。功能：控制細(xì)胞的遺傳，生長和發(fā)育。莢膜是某些細(xì)菌在細(xì)胞壁外包圍的一層粘液性物質(zhì)，一般由糖和多肽組成。功能：抗吞噬作用粘附作用抗有害物質(zhì)的損傷作用抗干燥作用等鞭毛在某些細(xì)菌菌體上具有細(xì)長而彎曲的絲狀物，是細(xì)菌的運動器官。,.,霉菌,真核生物，單細(xì)胞或多細(xì)胞絲狀真菌可用低倍或高倍鏡觀察其形態(tài)。如釀制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生產(chǎn)葡萄糖的曲霉菌、生產(chǎn)青霉素的青霉等。,酵母菌,單細(xì)胞真菌，最低等的真核生物。一般用高倍鏡（401600倍）觀察其個體細(xì)胞形態(tài)。如面包酵母、釀酒酵母、紅酵母等。,.,支原體、衣原體、立克次氏體,單細(xì)胞，介于細(xì)菌與病毒之間的一類原始而小型的原核微生物。,衣原體模型,微細(xì)藻類,單細(xì)胞藻類：如紅藻、綠藻、小球藻等。,原生動物,單細(xì)胞，無真正細(xì)胞壁。如變形蟲、吸管蟲、草履蟲等。,.,種類多-到目前為止，人們已認(rèn)識的微生物已有10多萬種。分布廣-微生物因其形體微小，重量輕，故可以隨著風(fēng)和水流到處傳播。繁殖快-微生物驚人的生長繁殖速度是其他任何生物都望塵莫及的。一般細(xì)菌的世代時間為幾十分鐘到一百多分鐘。在最適宜的條件下，人們最熟悉的大腸桿菌每1320min就可分裂出新的一代。代謝強(qiáng)-微生物的代謝強(qiáng)度比起高等生物要高出幾百到幾萬倍，主要表現(xiàn)在吸收多轉(zhuǎn)化快。易變異-微生物結(jié)構(gòu)簡單,因而在受到外界物理或化學(xué)因素影響后，很容易引起細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，結(jié)果導(dǎo)致變異。另一個原因是細(xì)胞增殖速度快。,微生物的特性,.,第二節(jié)、食品中微生物的來源來自土壤,自然界中微生物的分布極為廣泛，水中、高山、海底、荒漠、極地、空氣等到處都生存著各種各樣、形形色色的微生物。土壤是微生物的天然培養(yǎng)基，它具備微生物正常發(fā)育所必須的一切條件：土壤中含有一定的無機(jī)物和有機(jī)物；土壤中含有適當(dāng)?shù)乃郑淮蠖鄶?shù)中性偏堿,適合大多數(shù)微生物生長；土壤中還含有氣體，主要是CO2、O2和N2；溫度變化不大（10-25）。土壤中含有大量的微生物，土壤中的細(xì)菌來自天然生活在土壤中的自養(yǎng)菌和腐物寄生菌以及隨動物排泄物及其尸體進(jìn)入土壤的細(xì)菌。土壤中微生物的分布：表層受日光照射和干燥的影響，不利于其生存，所以細(xì)菌數(shù)量少，離地面10-20厘米土層微生物最多.土層越深，菌數(shù)越少。,.,來自水源,水也是微生物存在的天然環(huán)境，水中的細(xì)菌來自土壤、塵埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。水中微生物種類及數(shù)量因水源不同而異。受到污染的水中含有大量的有機(jī)物，適合微生物的生存。靜水中的微生物多，流水中的少；離岸近處微生物多，離岸遠(yuǎn)處少；經(jīng)過大城市的河流，水受到污染，含有大量的糞便.并含有大量的致病菌。井水和泉水中細(xì)菌少，雨水、雪水中也少，城市上空的雨水細(xì)菌多，鄉(xiāng)村上空雨水細(xì)菌少。國家規(guī)定，自來水中，細(xì)菌總數(shù)每升不得超過100個，大腸菌群不得超過3個/升.,.,來自空氣,在冬春季節(jié)，更容易發(fā)生感冒等傳染病，就是因為空氣的傳播，特別是在公共場所，人多，空氣流通差，細(xì)菌多；大城市上空微生物數(shù)量最多，鄉(xiāng)村少；森林、草地和田野上空空氣清潔，海洋、高山、冰雪覆蓋的地面上空，微生物更為稀少。雨后空氣特別新鮮。,.,來自人體,人自出生后，外界的微生物就逐漸進(jìn)入人體。在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種控道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部位，存在著對人體無害的微生物群，包括細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體等。皮膚：表皮葡萄球菌、類白喉桿菌、綠膿桿菌、恥垢桿菌等口腔：球菌（甲型或乙型）、乳酸桿菌、螺旋體、梭形桿菌、白色念球菌、（真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、類白喉桿菌等胃：正常一般無菌腸道：類桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、厭氧性鏈球菌、糞鏈球菌、葡萄球菌、白色念球菌、乳酸桿菌、變形桿菌、破傷風(fēng)桿菌、氣莢膜桿菌等鼻咽腔：甲型鏈球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感桿菌、乙型鏈球菌、葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等眼結(jié)膜：皮表葡萄球菌、結(jié)膜干燥桿菌、類白喉桿菌等,.,第三節(jié)、微生物引起食品腐敗變質(zhì),食品中含有蛋白質(zhì)，脂肪，碳水化合物，這些成份是微生物的生長基質(zhì)，所以微生物在食品中能夠生長繁殖。食品腐敗變質(zhì)的原因有物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)和微生物學(xué)方面的原因，但最普遍、最主要的因素是微生物。環(huán)境中無處不存在微生物，食物在生產(chǎn)、加工、運輸、儲存、銷售過程中，很容易被微生物污染。只要溫度適宜，微生物就會生長繁殖，分解食物中的營養(yǎng)素，以滿足自身需要。這時食物中的蛋白質(zhì)就被破壞了，食物會發(fā)出臭味和酸味，失去了原有的堅韌性和彈性，顏色也會發(fā)生變化從而造成食品變質(zhì)。,.,新鮮果蔬和果汁的腐敗變質(zhì),開始引起新鮮水果變質(zhì)的微生物是酵母菌和霉菌。引起蔬菜變質(zhì)的主要是酵母菌、霉菌和少數(shù)細(xì)菌。起初霉菌在果蔬表皮，或其污染物上生長，然后霉菌侵入果蔬組織，首先分解細(xì)胞壁中的纖維素，進(jìn)一步分解其中的果膠、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、淀粉、糖類等，使其變成簡單物質(zhì)。在外觀上出現(xiàn)深色斑點，組織變松、變軟、凹陷，漸成液漿狀，并出現(xiàn)酸味、芳香味或酒味等。果汁中主要發(fā)生乳酸菌以果汁中糖分、檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸為發(fā)酵基質(zhì)的乳酸發(fā)酵和最常見的酵母菌引起的酒精發(fā)酵。在濃縮果汁中，一般性細(xì)菌難以忍受高濃度的糖分。果汁常見的霉菌是青霉，其次是曲霉。果汁變質(zhì)后會呈現(xiàn)渾濁、產(chǎn)生酒精和有機(jī)酸變化，結(jié)果原有風(fēng)味被破壞或產(chǎn)生一些不愉快的異味。,.,乳及乳制品的腐敗變質(zhì),乳及乳制品的營養(yǎng)成分比較完全，都含有豐富的蛋白質(zhì)、極易吸收的鈣和完全的維生素等。因此極易為微生物所腐敗變質(zhì)。鮮乳中污染微生物主要來源于乳房內(nèi)的污染微生物和環(huán)境中的微生物。主要有乳酸細(xì)菌、胨化細(xì)菌、脂肪分解細(xì)菌、酪酸細(xì)菌、產(chǎn)氣細(xì)菌、產(chǎn)堿細(xì)菌、以及酵母和霉菌。它們在鮮乳中的生長有一定的順序性，可以分為抑制期、乳酸鏈球菌期、乳酸桿菌期、真菌期和胨化細(xì)菌期，pH值也是先下降再逐步回升。含水量合格的奶粉不適宜微生物生長。但原料奶污染嚴(yán)重，加工又不當(dāng)?shù)哪谭壑锌赡芪廴居猩抽T氏菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）等病原菌。這些病原菌可能產(chǎn)生毒素而易引起中毒。微生物引起淡煉乳變質(zhì)，一是產(chǎn)生凝乳，即使煉乳凝固成塊。由于作用的微生物不同，凝乳又可為甜性凝乳和酸凝乳；二是產(chǎn)氣乳，即使煉乳產(chǎn)氣，使罐膨脹爆裂；三是由一些分解酪蛋白的芽孢桿菌作用，使煉乳產(chǎn)生苦味。微生物引起甜煉乳變質(zhì)也有三種結(jié)果：一是由于微生物分解甜煉乳中蔗糖產(chǎn)生大量氣體而發(fā)生脹罐；二是許多微生物產(chǎn)生的凝乳酶使煉乳變稠；三是霉菌污染時會形成各種顏色的鈕扣狀干酪樣凝塊，使甜煉乳呈現(xiàn)金屬味和干酪味等。,.,肉、魚、蛋類的腐敗變質(zhì),禽畜肉類的微生物污染，一是在宰殺過程中各個環(huán)節(jié)上的污染，二是病畜、病禽肉類所帶有的各種病原菌，如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌、布魯氏菌（Brucella）等。腐生性微生物污染肉類后，在高溫高濕條件下很快使肉類腐敗變質(zhì)。肉類腐敗變質(zhì)，先是由于乳酸菌、酵母菌和其他一些革蘭氏陰性細(xì)菌在肉類表面上的生長，形成菌苔而發(fā)粘。然后分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的H2S與血紅蛋白形成硫化氫血紅蛋白而變成暗綠色，也由于各種微生物生長而產(chǎn)生不同色素，霉菌生長形成各種霉斑。同時可產(chǎn)生各種異味，如哈喇味、酸味、泥土味和惡臭味等。魚類極易為水生微生物所引起腐敗變質(zhì)。假單胞菌、無色桿菌（Achromobacter）、黃桿菌（Flavobacterium）、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）、氣單胞菌（Aeromonas）等，是新鮮魚類的主要腐敗菌。新鮮魚類變質(zhì)后組織疏松，無光澤，由于組織分解產(chǎn)生的吲哚、硫醇、氨、硫化氫、糞臭素等，而常有難聞惡臭。腌魚由于嗜鹽細(xì)菌的生長而有橙色出現(xiàn)。鮮蛋也由于卵巢內(nèi)污染、產(chǎn)蛋時污染和蛋殼污染而發(fā)生微生物性腐敗變質(zhì)。污染鮮蛋的微生物有禽病病原菌、其他腐生性細(xì)菌和霉菌等。它們使鮮蛋成為散黃蛋，并進(jìn)一步分解產(chǎn)生硫化氫、氨、糞臭素等，蛋液成灰綠色，惡臭或粘附于蛋殼、蛋膜上。,.,罐藏食品的腐敗變質(zhì),罐藏食品也會發(fā)生腐敗變質(zhì)，其原因在于殺菌不徹底，罐內(nèi)仍殘留有一定量的微生物，或者罐頭密封不良而漏罐，外界進(jìn)入微生物。由于滅菌不徹底而殘留的微生物，一般以嗜熱性芽孢桿菌為主。它們所引起的罐頭腐敗變質(zhì)有三種：一是罐頭外觀正常，但內(nèi)部pH值可下降0.10.3，稱為平酸變質(zhì)；二是TA（thermo-anaerobes）嗜熱性厭氧菌腐敗，產(chǎn)氣、產(chǎn)酸并可使罐頭脹裂；三是產(chǎn)生硫化物腐敗食品。如罐頭中未殺滅的是厭氧性梭狀芽孢桿菌，則可能會進(jìn)行丁酸發(fā)酵，并產(chǎn)生氫氣和CO2，不產(chǎn)芽孢細(xì)菌的污染主要是由于罐頭漏罐所引的，它們使罐頭內(nèi)食品發(fā)生渾濁、沉淀風(fēng)味改變和產(chǎn)氣脹罐。對于發(fā)生腐敗變質(zhì)的罐頭食品，必須根據(jù)腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象作微生物學(xué)分析，如是否產(chǎn)氣脹罐，是否渾濁沉淀，是否變酸或pH上升等等，以便作出正確判斷，避免腐敗變質(zhì)的進(jìn)一步發(fā)生。,.,第四節(jié)、食品微生物檢驗的任務(wù)和內(nèi)容,任務(wù)通過測定微生物指標(biāo)，判斷食品在加工環(huán)境和食品原料及其在加工過程中被微生物污染及生長的情況，為食品環(huán)境衛(wèi)生管理和食品生產(chǎn)管理及某些傳染病的防疫措施提供科學(xué)依據(jù)。,.,食品微生物檢驗的任務(wù)和內(nèi)容,檢驗的范圍生產(chǎn)環(huán)境的檢驗原輔料的檢驗食品加工、儲藏、銷售環(huán)節(jié)的檢驗食品檢驗（重點）,.,食品微生物檢驗的任務(wù)和內(nèi)容,食品微生物檢驗的指標(biāo)食品微生物檢驗的指標(biāo)就是根據(jù)食品衛(wèi)生的要求，從微生物學(xué)的角度，對不同食品所提出的與食品有關(guān)的具體指標(biāo)要求。我國衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標(biāo)有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項。菌落總數(shù)（個/1g、1cm、1cm2)：清潔狀態(tài)的標(biāo)志；預(yù)測食品可能存放的期限.大腸菌群(MPN/100ml):較為理想的糞便污染的指標(biāo)菌群；作為腸道致病菌污染食品的指示菌.mostprobablenumber致病菌(不得檢出）：沙門氏菌、肉毒梭菌、志賀氏菌、變形桿菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、霉菌霉菌及其毒素：我國還沒有制定出霉菌的具體指標(biāo)，鑒于有很多霉菌能夠產(chǎn)生毒素，引起疾病，故應(yīng)該對產(chǎn)毒霉菌進(jìn)行檢驗。例如：曲霉屬的黃曲霉、寄生曲霉等，青酶屬的桔青酶、島青酶等，鐮刀酶屬的串珠鐮刀酶，禾谷鐮刀酶等等。其它指標(biāo)：微生物指標(biāo)還應(yīng)包括病毒，肝炎病毒、豬瘟病毒、雞新城疫病毒、馬立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，豬水泡病毒等；另外，從食品檢驗的角度考慮，寄生蟲也被很多學(xué)者列為微生物檢驗的指標(biāo)：如旋毛蟲，囊尾蚴，住肉孢子蟲、蛔蟲，肺吸蟲，弓形體，螨，姜片吸蟲，中華分枝睪吸蟲等等。,.,.,微生物檢驗室,微生物檢驗室要求高度清潔衛(wèi)生，要盡可能地為其創(chuàng)造無菌條件。為達(dá)此目的，房屋的墻壁和地板，使用的各種家具都要符合便于清洗的要求。,第五節(jié)、食品微生物檢驗條件,.,實驗室管理制度,1實驗室應(yīng)制定儀器配備管理使用制度，藥品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根據(jù)安全制度和環(huán)境條件的要求，本室工作人員應(yīng)嚴(yán)格掌握，認(rèn)真執(zhí)行。2進(jìn)入實驗室必須穿工作服，進(jìn)入無菌室換無菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非實驗室人員不得進(jìn)入實驗室，嚴(yán)格執(zhí)行安全操作規(guī)程。3實驗室內(nèi)物品擺放整齊，試劑定期檢查并有明晰標(biāo)簽，儀器定期檢查、保養(yǎng)、檢修,嚴(yán)禁在冰箱內(nèi)存放和加工私人食品。4各種器材應(yīng)建立請領(lǐng)消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應(yīng)填寫報告；藥品、器材、菌種不經(jīng)批準(zhǔn)不得擅自外借和轉(zhuǎn)讓，更不得私自拿出，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行菌種保管制度。5禁止在實驗室內(nèi)吸煙、進(jìn)餐、會客、喧嘩，實驗室內(nèi)不得帶入私人物品，離開實驗室前認(rèn)真檢查水、電、暖氣、門窗，對于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕的物品和廢棄物品應(yīng)按有關(guān)要求執(zhí)行。6科、室負(fù)責(zé)人督促本制度嚴(yán)格執(zhí)行，根據(jù)情況給于獎懲，出現(xiàn)問題立即報告，造成病原擴(kuò)散等責(zé)任事故者，應(yīng)視情節(jié)直至追究法律責(zé)任。,.,實驗注意事項,非必要的物品不要帶進(jìn)實驗室，必須帶進(jìn)的物品（包括帽子、圍巾等）應(yīng)放在不影響實驗操作的地方每次實驗前須用濕布擦凈臺面，必要時可用0.1“新潔爾滅”溶液擦。實驗前要洗手，以減少染菌的概率。微生物實驗中最重要的一環(huán)，就是要嚴(yán)格地進(jìn)行無菌操作，防止雜菌污染。為此，在實驗過程中，每個人要嚴(yán)格做到以下幾點：操作時要預(yù)防空氣對流：在進(jìn)行微生物實驗操作時，要關(guān)閉門窗，以防空氣對流。接種時不要走動和講話：接種時盡量不要走動和講話，以免因塵埃飛揚和唾沫四濺而導(dǎo)致雜菌污染。含菌器具要消毒后清洗：凡用過的帶菌移液管、滴管或涂布棒等，在實驗后應(yīng)立即投入5%石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染環(huán)境。含培養(yǎng)物的器皿要殺菌后清洗：在清洗帶菌的培養(yǎng)皿、三角瓶或試管等之前，應(yīng)先煮沸10min或進(jìn)行加壓蒸汽滅菌。要穿干凈的白色工作服：微生物學(xué)工作者在進(jìn)行實驗操作時應(yīng)穿上白色工作服，離開時脫去，并經(jīng)常洗滌以保持清潔。凡須進(jìn)行培養(yǎng)的材料，都應(yīng)注明菌名、接種日期及操作者姓名（或組別），放在指定的溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，按時觀察并如實地記錄實驗結(jié)果，按時交實驗報告。實驗室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙，不準(zhǔn)吃東西，切忌用舌舔標(biāo)簽、筆尖或手指等物，以免感染。節(jié)約藥品、器材和水、電、煤氣。各種儀器應(yīng)按要求操作，用畢按原樣放置妥當(dāng)。實驗完畢，立即關(guān)閉煤氣，整理和擦凈臺面，離開實驗室之前要用肥皂洗手。值日生負(fù)責(zé)打掃實驗室及進(jìn)行安全檢查(門窗、水、電及煤氣等),.,實驗注意事項,冷靜處理意外事故：打碎玻璃器皿：如遇因打碎玻璃器皿而把菌液灑到桌面或地上時，應(yīng)立即以5%石炭酸液或0.1%新潔爾滅溶液覆蓋，30min后擦凈。若遇皮膚破傷，可先去除玻璃碎片，再用蒸餾水洗凈后，涂上碘酒或紅貢。菌液污染手部皮膚：先用70%乙醇棉花拭凈，再用肥皂水洗凈。如污染了致病菌，應(yīng)將手浸于23來蘇爾或0.1%新潔爾滅溶液中，經(jīng)1020min后洗凈。菌液吸入口中：應(yīng)立即吐出，并用大量自來水漱口多次，再根據(jù)該菌的致病程度作進(jìn)一步處理：非致病菌：用0.1高錳酸鉀溶液漱口。一般致病菌（葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌等）：用3H2O2、0.1高錳酸鉀溶液或0.02米他芬液漱口。致病菌：如吸入白喉棒桿菌，在用法處理后，在注射1000U白喉抗毒素作緊急預(yù)防；若吸入傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌或霍亂弧菌等腸道致病菌，在經(jīng)法處理后，可注射抗生素預(yù)防發(fā)病。衣服或易燃品著火：應(yīng)先斷絕火源或電源，搬走易燃物品(乙醚、汽油等)，再用濕布掩蓋滅火，或?qū)⑸眢w靠墻或著地滾動滅火，必要時可用滅火器。皮膚燙傷：可用5鞣酸、2苦味酸（苦味酸氨苯甲酸丁酯油膏）或2龍膽紫液涂抹傷口?；瘜W(xué)藥品灼傷強(qiáng)酸、溴、氯、磷等酸性藥劑：先用大量清水洗滌，再用5NaHCO3或5%NaOH中和。NaOH、金屬鈉（鉀）、強(qiáng)堿性藥劑：先用大量清水洗滌，再用5硼酸或5乙酸中和石炭酸：用95乙醇洗滌如遇眼睛灼傷：則應(yīng)先用大量清水沖洗，再根據(jù)化學(xué)品的性質(zhì)作分別處理，例如，遇堿灼燒可用5硼酸洗滌，遇酸灼燒可用5NaHCO3洗滌，在此基礎(chǔ)上再滴入12滴橄欖油或液體石蠟加以潤濕即可。,.,檢驗室建設(shè)要求,選址與規(guī)模（1）化驗室應(yīng)建設(shè)在遠(yuǎn)離粉塵、噪聲、散發(fā)異味氣體等地點，電源電壓應(yīng)當(dāng)相對穩(wěn)定的地點。根據(jù)企業(yè)規(guī)模和產(chǎn)品種類，應(yīng)建設(shè)不同要求的化驗室。但是，最小建筑面積：理化檢驗室不能小于30平方米；微生物檢驗室（無菌室）不能小于8平方米。這樣有助于儀器設(shè)備的合理擺放，便于操作，便于樣品流通和空氣流通。（2）室內(nèi)應(yīng)有足夠的照明條件。（3）室內(nèi)必須配置干粉或二氧化碳滅火器，以備電器或化學(xué)品燃燒滅火使用。（4）所有電器插坐均應(yīng)有牢固的地線裝置，以防止設(shè)備帶電，造成操作人員觸電事故。有條件的還應(yīng)在地面鋪設(shè)絕緣膠板。其次還應(yīng)必須有上下水設(shè)施、通風(fēng)櫥（在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行對發(fā)生出有害氣體的分析操作）。室內(nèi)的布局(1)動儀器與靜儀器分開：精密儀器（如光度計、天平、比色計、酸度計、色譜儀等）應(yīng)必須與震動儀器（如震蕩器、驗粉篩、離心機(jī)、攪拌器等）。(2)常溫與熱源設(shè)備分開：熱源儀器（如電熱蒸餾水器、恒溫干燥箱、高溫電阻爐、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、電爐等）必須與其它一切設(shè)備分開，不然會影響其它設(shè)備的正常使用，嚴(yán)重的會造成熱蒸汽腐蝕其它設(shè)備，影響其使用壽命。(3)化學(xué)分析臺與熱源設(shè)備分開：化學(xué)分析臺面上應(yīng)盡量少放易燃和腐蝕性試劑。使用電爐或酒精燈加熱時應(yīng)堅持有人看管和監(jiān)視?；瘜W(xué)分析臺的擺放應(yīng)遠(yuǎn)離熱源設(shè)備?；炇覒?yīng)建立可行的規(guī)章制度：化驗室人員工作管理制度、標(biāo)準(zhǔn)管理制度、危險化學(xué)試劑的管理制度、檢驗過程的管理制度檢測設(shè)備檢定管理制度,.,檢驗室建設(shè)布局圖,.,微生物實驗室主要設(shè)備和器具,無菌室（接種室）或接種箱恒溫箱電烘箱（干燥箱）冰箱高壓蒸汽滅菌鍋離心機(jī)接種針天平酒精燈顯微鏡常用玻璃器皿均質(zhì)器、試管夾，吸管，移液槍，脫脂棉，牛皮紙，棉繩，紗布，剪刀,.,潔凈工作臺（超凈工作臺、無菌臺）,是一種供人操作的通用型局部凈化設(shè)備，通過風(fēng)機(jī)將空氣吸入，經(jīng)由靜壓箱通過高效過濾器過濾，將過濾后的潔凈空氣以垂直或水平氣流的狀態(tài)送出，使操作區(qū)域持續(xù)在潔凈空氣的控制下達(dá)到百級潔凈度它可造就局部高清潔度空氣環(huán)境。,.,生物安全柜,是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實驗材料時，用來保護(hù)操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計的。,.,高壓滅菌鍋,.,烘箱,.,培養(yǎng)箱,.,水浴鍋,.,顯微鏡,普通光學(xué)顯微鏡,顯微鏡被用來放大微小物體的圖像。一般應(yīng)用于對生物、醫(yī)藥、微觀粒子等觀測。,.,分光光度計,分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量,.,pH計,.,離心機(jī),.,PCR儀,原理：采用實時熒光PCR技術(shù)檢測食品中是否有致病菌；靈敏度：對目標(biāo)菌檢測靈敏度為1個/g效率：檢測過程用時2-4H主要耗材：各菌種試劑盒,.,真空泵冰箱純水機(jī)振蕩器/均質(zhì)機(jī)移液器,其它儀器,.,無菌室建設(shè),.,新建無菌室的處理程序,先用3%的煤酚皂擦洗工作臺面及地面，再用甲醛加高錳酸鉀熏蒸空氣。日后要定期熏蒸；每兩星期用酒精棉球擦拭紫外線燈管；每次使用無菌室前用紫外燈照射3060分鐘；每次使用完無菌室后，要及時用3%的煤酚皂擦洗工作臺面及地面。,.,超凈工作臺的使用,使用工作臺時，先經(jīng)過清潔液浸泡的紗布擦拭臺面，然后用消毒劑擦拭消毒。接通電源，提前50分鐘打開紫外燈照射消毒，處理凈化工作區(qū)內(nèi)工作臺表面積累的微生物，30分鐘后，關(guān)閉紫外燈，開啟送風(fēng)機(jī)工作臺面上，不要存放不必要的物品，以保持工作區(qū)內(nèi)的潔凈氣流不受干擾操作結(jié)束后，清理工作臺面，收集各廢棄物，關(guān)閉風(fēng)機(jī)及照明開關(guān)，用清潔劑及消毒劑擦拭消毒。最后開啟工作臺紫外燈，照射消毒30分鐘后，關(guān)閉紫外燈，切斷電源。每二月用風(fēng)速計測量一次工作區(qū)平均風(fēng)速，如發(fā)現(xiàn)不符合技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)調(diào)節(jié)調(diào)壓器手柄，改變風(fēng)機(jī)輸入電壓，使工作臺處于最佳狀況。每月進(jìn)行一次維護(hù)檢查，并填寫維護(hù)記錄。每次使用完畢，立即清潔儀器，懸掛標(biāo)識，并填寫儀器使用記錄。取樣結(jié)束后，先用毛刷刷去潔凈工作區(qū)的雜物和浮塵、用細(xì)軟布擦拭工作臺表面污跡、污垢目測無清潔劑殘留，用清潔布擦干；要經(jīng)常用紗布沾上酒精將紫外線殺菌燈表面擦干凈,保持表面清潔,否則會影響殺菌能力；設(shè)備內(nèi)外表面應(yīng)該光亮整潔，沒有污跡。,.,微生物檢測作業(yè)規(guī)范,各培養(yǎng)液配制完成后，殺菌前放入冰箱冷藏保存，但必須在48小時內(nèi)對其進(jìn)行分裝殺菌使用。已殺菌未開封的培養(yǎng)液在24小時內(nèi)可直接使用；已殺菌未開封超過24小時或者已殺菌但開封而未用完的培養(yǎng)液都必須重新殺菌后使用。同一培養(yǎng)液反復(fù)殺菌不超過2次。殺菌時間由當(dāng)班微檢員用油筆直接寫在瓶體。殺菌鍋密閉前，內(nèi)桶頂部覆蓋一層報紙。進(jìn)入無菌間作業(yè)時必須做到：緩沖間、無菌間的紫外燈開啟時間超過半小時；關(guān)閉紫外燈后，微檢員把作業(yè)過程中將用到的所有物品放在緩沖間，同時在緩沖間更換專用的工作衣，同時佩戴口罩和衛(wèi)生帽，然后再將物品轉(zhuǎn)移到無菌間；作業(yè)時關(guān)閉紫外燈、空調(diào)、和無菌操作臺風(fēng)機(jī)；每次最多做4個樣品。每次均做空白對比（除非有特殊說明）。完成作業(yè)后，立即做好相關(guān)標(biāo)識、填寫微生物檢驗培養(yǎng)登記表，然后清理無菌間。清理結(jié)束后，開啟紫外燈殺菌30分鐘。無菌間只允許放置無菌操作臺、轉(zhuǎn)椅、水浴鍋；無菌操作臺上最多只允許擺放以下物品：,.,微生物檢測作業(yè)規(guī)范,微生物培養(yǎng)24小時后，當(dāng)班微檢員仔細(xì)觀察、如實填寫培養(yǎng)的現(xiàn)象，任何異常情況都必須及時報告；晚班的微檢員可將有異常情況的培養(yǎng)液交接給白班，并保證其免受污染?？谡?、衛(wèi)生帽每人次使用兩天，無菌間縫單日定期拖地、專用的工作衣每周定期清洗，具體人員由班長另行安排。,.,第五節(jié)、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢驗技術(shù),細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢驗內(nèi)容：菌體形態(tài)、大小、排列、特殊結(jié)構(gòu)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查方法：不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法和染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法,.,1、不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法,不染色的細(xì)菌標(biāo)本的鏡檢可直接觀察到細(xì)菌活體的形態(tài)、大小、運動（了解菌是否有鞭毛）懸滴法和壓滴法,.,不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法懸滴法,制備菌液：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌于盛有12ml無菌水的試管中，制成輕度渾濁的菌懸液。涂凡士林：取潔凈無油的蓋玻片1塊，在其四周涂少量的凡士林。滴加菌液：加1滴菌液于蓋玻片的中央，并用削尖的記號筆在菌液的邊緣做一記號，以便在顯微鏡觀察時，易于尋找菌液的位置。蓋凹玻片：將凹玻片的凹槽對準(zhǔn)蓋玻片中央的菌液，并輕輕地蓋在蓋玻片上，使兩者粘合在一起，然后翻轉(zhuǎn)凹玻片，菌液正好懸在凹槽的中央，再用火柴棒輕壓蓋玻片使四周邊緣閉合，以防菌液干燥。鏡檢：先用低倍鏡找到標(biāo)記，再稍移凹玻片即可找到菌懸滴的邊緣，然后將菌液移到視野中央。由于菌體是透明的，鏡檢時可適當(dāng)縮小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于觀察。鏡檢時要仔細(xì)辨別是細(xì)菌的運動還是分子運動（即布朗運動）,.,不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法壓滴法（水封片法）,制水封片：加1滴菌液于潔凈無油的載玻片中央，然后取1滴潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，再慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。若鏡檢好氧菌時，應(yīng)在水封片中留12個小氣泡，然后再觀察氣泡四周細(xì)菌的運動能力，否則因蓋玻片內(nèi)供氧不足而抑制了細(xì)菌的運動。鏡檢：先用低倍鏡觀察，然后再轉(zhuǎn)至高倍鏡或油鏡下觀察，觀察的要求同懸滴法。,.,不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法注意事項,結(jié)果記錄注意事項檢查細(xì)菌運動的載玻片和蓋玻片都要潔凈無油，否則將影響細(xì)菌的運動制水封片時，菌液不可加得太多，因過多的菌液會蓋玻片下流動，從而影響了對細(xì)菌正常運動的觀察。,.,2、染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法染料,細(xì)菌染色用的染料酸性染料（陰離子染料）：染色離子帶陰電荷，能與帶陽電的物質(zhì)結(jié)合，使之著色。降低菌液的pH而使細(xì)菌帶陽電時，就可用酸性染料染色。（伊紅、剛果紅）堿性染料（陽離子染料）：與帶負(fù)電的物質(zhì)結(jié)合，細(xì)菌一般帶負(fù)電，所以細(xì)菌染色所用的染料，常用堿性染料（堿性復(fù)紅、美藍(lán)）。復(fù)合染料：堿性染料與酸性染料的結(jié)合物（伊紅美藍(lán)、伊紅天青）。單純?nèi)玖希翰荒芘c被染物生成鹽類影響染色的因素細(xì)菌的結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小培養(yǎng)基：組成、菌齡、pH等,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法制片方法,制片：（制片是染色的關(guān)鍵，如不注意菌體涂布的均勻度，會造成染料的大面積堆積，而使觀察結(jié)果不理想）制片：在干凈的載波片（平時放在95%酒精中)上滴一滴蒸餾水或無菌水，用接種工具進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中與水混合做成懸液，并涂成直徑約1cm的薄層。若材料為液體培養(yǎng)物或自固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則可直接涂布于載玻片上。涂布要均勻，菌體間少重疊。干燥：涂布最好在室溫下使其干燥，有時為之使之干燥得快些，小心地在酒精燈火焰高處微微加熱。固定：標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快地來回通過34次，共23s，并不時以載玻片的加熱面觸及皮膚，其目的：殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)；保證菌體能牢固地黏附在載玻片上，防止標(biāo)本被水洗掉；改變?nèi)玖蠈?xì)胞的通透性，因為死細(xì)胞的原生質(zhì)比活細(xì)胞的原生質(zhì)易于染色。注意事項：載玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開，且固定效果不好，水洗時易被水沖掉。為避免因菌數(shù)過多聚成團(tuán)而不利于觀察個體形態(tài)，可在載玻片一端加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層。干燥時，切勿靠火焰太近或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而使菌體變形。,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法染色分類,單染色法：用一種染色劑對涂片進(jìn)行染色。該法簡便易行，但僅能顯示細(xì)胞的外部形態(tài)，而不能辨別其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，適用于微生物的形態(tài)觀察。復(fù)染色法：主要的復(fù)雜染色法有革蘭氏法和抗酸性及特殊染色法。因為細(xì)菌除了具有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、原生質(zhì)和核等基本構(gòu)造外,某些細(xì)菌還具有莢膜、芽孢、鞭毛和異染顆粒等特殊結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)不能被一般染色方法著色，必須用特殊的方法才能著色。負(fù)染色法：負(fù)染色法是一種特殊的染色方法，是指背景著色而細(xì)菌本身不著色。一般使用酸性染料，如剛果紅或水溶性苯胺黑。固定染色涂片可浸于酸性酒精中，因剛果紅經(jīng)酸性酒精處理后，涂片的背景便從紅色（鹽類的顏色）轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色（即剛果紅游離的顏色），這樣可使對比性更為鮮明。負(fù)染色法除用于觀察細(xì)胞形態(tài)外，還可區(qū)別死菌與活菌，因死菌可被酸性染料著色，部分自溶的細(xì)菌也能輕度染上酸性染料，而活菌卻不著色。,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法簡單染色方法,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法革蘭氏染色法,陽性菌,陰性菌,.,革蘭氏染色（1）制片：制片方法與簡單染色相同。（2）初染：加適量（以剛好覆蓋菌膜為宜）的結(jié)晶紫染色液染色12min，水洗。（3）媒染：碘液媒染1min，水洗。（4）脫色：連續(xù)滴加95%乙醇脫色2030s至流出液無色，立即水洗。（5）復(fù)染：滴加番紅復(fù)染2min，水洗。（6）鏡檢：干燥后，油鏡鏡檢觀察。（7）混合涂片法：三區(qū)法染色,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法革蘭氏染色法,注意事項：單一菌落染色后看到紅色桿菌和紫色桿菌共存的情況，特別明顯既有紅色的，也有紫色的？（脫色時間：受涂片之厚薄、脫色時玻片晃動的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。菌齡：選用培養(yǎng)1824h菌齡的細(xì)菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)）顯微鏡觀察：紫和紅好象都是，焦距調(diào)的稍近時紫色，調(diào)的稍遠(yuǎn)時紅色，兩種情況下形狀都看的挺清楚，桿狀。關(guān)于顏色你們怎么確定的？（對照：當(dāng)確證一個未知菌的革蘭氏反應(yīng)時，應(yīng)同時做一張已知革蘭氏陽性菌和陰性菌的混合圖片）染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)甩去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。用洗衣粉水煮沸、清洗、瀝干備用。結(jié)果記錄：,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法芽孢染色法,原理：細(xì)菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁較厚，對染料的透性差，不易著色，但是一旦著色又難以脫色。芽孢染色采用弱堿性染料孔雀綠在加熱條件下進(jìn)行。染色完畢，用自來水沖洗。因孔雀綠是弱堿性染料，與菌體結(jié)合力較差，因此易被水洗掉，而進(jìn)入芽孢中的孔雀綠卻難以溶出。水洗后，再用一種呈紅色的堿性染料復(fù)染使菌體和芽孢呈現(xiàn)不同的顏色。方法與步驟制片：將培養(yǎng)24小時的細(xì)菌涂片、干燥、固定染色：將孔雀綠染色液滴加35滴于標(biāo)本上。用試管夾夾住載玻片在火焰上加熱約5min（當(dāng)染料冒蒸汽時開始計時）。在加熱過程中要隨時加染色液，切勿煮沸或使樣本干涸。水洗：待載玻片冷卻后，用自來水沖洗復(fù)染：用番茄紅染色液染色1min。水洗、干燥，置于油鏡下觀察并繪圖說明。結(jié)果,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法芽孢染色法,改良方法：制備菌液：加12滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)的菌苔于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。加染色液：加5孔雀綠染色液23滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染色液與菌液充分混合。加熱：將此試管浸于沸水浴中，加熱1520min。涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的玻片上，并涂成薄膜。固定：將玻片通過微火3次。脫色：用水洗，直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。復(fù)染：加沙黃染色液，染23min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水吸干。鏡檢：用油鏡觀察結(jié)果紀(jì)錄,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法芽孢染色法,注意事項：供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體內(nèi)。巨大芽孢桿菌在37條件下培養(yǎng)1214h效果最佳。改良法在節(jié)約染料、簡化操作及提高標(biāo)本質(zhì)量等方面都較常規(guī)法優(yōu)越，可優(yōu)先使用。用改良法時，欲得到好的涂片，首先要制備濃稠的菌液，其次從小試管中挑取被染色的菌液時，應(yīng)先用接種環(huán)充分?jǐn)嚢?，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時菌體太少。,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法鞭毛染色法,鞭毛染色方法基本原理雷同，即在染料前先經(jīng)媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑一般為1020nm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。銀染色法：清洗玻片：將玻片插在專用金屬架上，再放入洗衣粉過濾液（洗衣粉煮沸后用濾紙過濾，以除去粗顆粒）中，煮沸20min。取出稍冷后用自來水沖洗，晾干。再放濃洗液中浸泡56d。使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95乙醇中脫水。過火去乙醇，立即使用。配制染色液：A液：鞣酸（丹寧酸）5g，F(xiàn)eCl31.5g，蒸餾水100ml。待溶解后，加1NaOH溶液1ml和15甲醛溶液2ml；B液：硝酸銀2g溶于蒸餾水100ml中。在90mlB液中滴加濃氫氧化銨溶液，到出現(xiàn)沉淀后，再滴加使其變?yōu)槌吻?，然后用其?0mlB液小心滴加至澄清液中，至出現(xiàn)輕霧狀為止（此操作非常關(guān)鍵，應(yīng)格外小心）。在整個滴加過程中要邊滴邊加充分搖蕩。配好的染色液當(dāng)日有效，4h內(nèi)效果最好。,.,涂片：用接種環(huán)挑取數(shù)環(huán)菌液于玻片的一端，立即將玻片傾斜，讓菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。涂片在空氣中自然干燥。染色：滴加A液（46min)用蒸餾水充分洗凈A液用B液沖去殘水，在用B液于涂片上，用微火加熱至冒煙，維持0.51min（加熱時應(yīng)隨時補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染色液，不可使玻片出現(xiàn)干涸區(qū)用蒸餾水洗，自然干燥。鏡檢：用油鏡觀察，并記錄結(jié)果。結(jié)果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法鞭毛染色法,李夫森(Leifson)氏染色法：清洗玻片：同銀染法配制染色液：A液：堿性復(fù)紅1.2g，95乙醇100ml；B液：鞣酸3g，蒸餾水100ml（如加0.2苯酚，可長期保存）；c液：NaCl1.5g，蒸餾水100ml。染色液分別貯藏于磨口玻璃瓶中，在室溫下較穩(wěn)定。使用前將上述溶液等體積混合，將混合液貯藏于封密性良好的瓶中，置冰箱中可保存數(shù)星期。在較高溫度下因混合液發(fā)生化學(xué)變化而使著色力日益減弱。菌液的制備及涂片：菌液的制備同銀染法用記號筆在玻片的反面劃分34個相等的區(qū)域放1環(huán)菌液于每個小區(qū)的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一邊，并用濾紙吸去多余的菌液在空氣中自然干燥。染色：加染色液于第一區(qū)，使染料覆蓋涂片區(qū)。數(shù)隔分鐘后染料加入第二區(qū)，以后以此類推（相隔時間可自行決定），其目的是確定最合適的染色時間，且節(jié)約材料。在染色過程中要仔細(xì)觀察，當(dāng)整個玻片出現(xiàn)鐵銹色沉淀和染料表面出現(xiàn)金色膜時，即用水輕輕地沖洗，一般約染10min。在沒有傾去染料的情況下，就用自來水輕輕地沖去染料，否則會增加背景的沉淀自然干燥。鏡檢,.,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法鞭毛染色法,注意事項：銀染色法比較容易掌握，但染色液必須每次配制，比較麻煩。Leifson氏染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響，要掌握好染色條件必須經(jīng)過一些摸索。其優(yōu)點是染色液可保存較長時間。細(xì)菌鞭毛極細(xì)，很容易脫落，在整個操作過程中，必須仔細(xì)小心。菌齡較老的細(xì)菌鞭毛易脫落，所以在染色前應(yīng)將變形桿菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上（培養(yǎng)基表面濕潤，斜面基部含有冷凝水）連續(xù)移接幾代，以增強(qiáng)細(xì)菌的活動力。最后一代菌種放37恒溫箱中培養(yǎng)1518h。然后用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數(shù)環(huán)，移至盛有12ml無菌水的試管中，使菌液呈輕度渾濁。將該試管放37恒溫中靜置10min（放置時間不宜太長，否則鞭毛會脫落），讓幼齡菌的鞭毛松展開。,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法莢膜染色法,莢膜是細(xì)菌在新陳代謝過程中形成的分泌于細(xì)胞壁外的黏液狀物質(zhì)。其主要化學(xué)成分是多糖、多糖類物質(zhì)。莢膜的折光率低，與染料的親和力差，不易著色。通常采用負(fù)染色方法：使菌體和背景著色而莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90以上，故染色時一般不用熱固定或微熱固定，以免莢膜皺縮變形。,.,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法莢膜染色法,制片：在載玻片一端加一滴6葡萄糖液，取少許培養(yǎng)72h的被檢樣菌與其充分混合，再滴一滴新配制的黑色素溶液（或墨汁），混勻。左手持載玻片，右手拿另一光滑的載玻片（推片），將推片一端邊緣置于菌液前方，然后稍后后拉，當(dāng)接觸菌液后，輕輕地左右移動，使菌液沿推片接觸后緣散開，以30。角迅速而均勻地將菌液推向玻片另一端，將菌液涂成一薄膜，風(fēng)干。染色：加番茄紅染色液于標(biāo)本上，30s后，用細(xì)水流適當(dāng)沖洗。干燥、鏡檢：背景成黑色，菌體呈紅色，莢膜無色結(jié)果與討論按上述方法，在番茄紅之前，用甲醇固定1min亦可；按上述方法，用石炭酸復(fù)紅液代替蕃紅液，染色2min，結(jié)果同上。Tyler法：主要采用結(jié)晶紫冰醋酸染色液染色57min。然后用20CuSO4水溶液洗滌，干燥后鏡檢。結(jié)果莢膜呈藍(lán)紫色，細(xì)胞暗藍(lán)色。,.,第六節(jié)、培養(yǎng)基制備、滅菌技術(shù)-玻璃器皿的清洗,在制備培養(yǎng)基的過程中，首先要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況，經(jīng)過一定的處理，洗刷干凈。有的還要進(jìn)行包裝，經(jīng)過滅菌等準(zhǔn)備就緒后，才能使用。1、新購的玻璃器皿除去包裝沾染的污垢后，先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈，再浸泡于的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時，使游離的堿性物質(zhì)除去，再以流水沖凈。對容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸，數(shù)分鐘后傾去鹽酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。2、用過的玻璃器皿凡確無病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用后可隨時沖洗，吸取過化學(xué)試劑的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定數(shù)量后再集中進(jìn)行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必須經(jīng)過適當(dāng)消毒后，將污垢除去，用皂液洗刷，再用流水沖洗干凈。若用皂液未能洗凈的器皿，可用洗液浸泡適當(dāng)時間后再用清水洗凈。洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸，其作用是將有機(jī)物氧化成可溶性物質(zhì)，以便沖洗。洗液有很強(qiáng)的腐蝕作用，使用時應(yīng)特別小心，避免濺到衣服、身體和其他物品上。,.,培養(yǎng)基制備技術(shù)-培養(yǎng)基分類,根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分：）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學(xué)成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實驗室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號等因素的影響。）合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。）半合成培養(yǎng)基在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：）液體培養(yǎng)基所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。）固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。）半固體培養(yǎng)基如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.21%之間。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。,.,培養(yǎng)基制備技術(shù)培養(yǎng)基的分類,根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分：(1)通用培養(yǎng)基：培養(yǎng)異氧細(xì)菌最常用的培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；配制適合于厭氧菌生長的培養(yǎng)基時，通常須在培養(yǎng)基中加入適量的還原劑如巰基醋酸鈉、維生素C或半胱氨酸來降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，以利于厭氧菌的生長。(2)鑒別培養(yǎng)基：是一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只需用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌落的培養(yǎng)基。(伊紅美藍(lán)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂、微生物快速顯色培養(yǎng)基）(3)選擇性培養(yǎng)基：根據(jù)某微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)δ郴瘜W(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基，具有使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢菌。（馬丁氏培養(yǎng)基、Ashby無氮培養(yǎng)基）有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）。,.,培養(yǎng)基制備技術(shù)培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項,培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長;因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi):液體分裝至試管1/4左右為宜；如固體則分裝量為管高的1/5；半固體培養(yǎng)基，則分裝至試管的1/21/3為宜；錐形瓶分裝培養(yǎng)基時，容量應(yīng)不超過容積的一半為宜；9cm的培養(yǎng)皿可倒入15ml培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)基可采用121C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50C左右的培養(yǎng)基中。,.,滅菌和消毒,消毒是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法，滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。,.,滅菌和消毒物理方法,溫度：利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒瀯游锏氖w等的滅菌。b.干熱空氣滅菌法：這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160C，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。附：電熱恒溫