蜂毒素溶血過程及溶血作用的生化機理研究

第十屆“挑戰(zhàn)杯”全國大學生課外學術科技作品競賽 作品名稱：蜂毒素溶血過程及溶血作用的生化機理研究 學校全稱： 華 南 農 業(yè) 大 學 申報者姓名： 李 日 清 類別：自然科學類學術論文哲學社會科學類社會調查報告和學術論文科技發(fā)明制作A類科技發(fā)明制作B類27蜂毒素溶血過程及溶血生化機理研究作者：李日清，林先豐，陳柏剛指導老師：趙亞華 教授（華南農業(yè)大學生命科學學院，廣州，510642）摘 要：觀察了蜂毒素溶血過程并研究了其溶血作用的生化機理。 1）以熒光素FITC標記的蜂毒素作用于紅細胞，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)蜂毒素迅速包圍紅細胞，吸附到細胞表面，該過程可能由靜電作用介導。10min后細胞表面從圓盤邊緣部位開始破損，破損程度和蜂毒素濃度與紅細胞濃度的比值相關，達到一定比值時紅細胞完全裂解。低濃度蜂毒素處理的紅細胞，在掃描電鏡下呈凹陷不規(guī)則形狀，表面褶皺粗糙。 2）以SPQ為熒光探針測定蜂毒素作用下帶3蛋白陰離子轉運活性，結果顯示轉運活性比正常情況增加1倍以上。推測蜂毒素C端吸附帶3蛋白負電荷糖化基，N端影響帶3 跨膜域疏水區(qū)及膜脂流動性，促使陰離子轉運活性顯著增強，引起紅細胞內環(huán)境酸化。 3）采用鉬藍法測定Na+/K+-ATPase活性。在蜂毒素附著血紅細胞質膜或游離于反應溶液的反應條件下，Na+/K+-ATPase活性均受到抑制，后者的抑制可通過加入EDTA得到部分解除。 蜂毒素一方面插入質膜促使Na+/K+-ATPase二聚體解離，破壞酶結構，另一方面通過正電荷殘基（Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24）與ATP產生靜電吸引，跟Na+/ K+-ATPase競爭底物，抑制其活性，從而引起紅細胞內離子環(huán)境失衡。 4）分光光度計測定G-6-PD活性，發(fā)現(xiàn)蜂毒素抑制G-6-PD活性，當其濃度達到或大于10mol/L時強烈抑制，加入EDTA可迅速解除部分抑制。反應啟動前和反應啟動時兩個時刻加入蜂毒素，G-6-PD活性無明顯差異，說明蜂毒素對G-6-PD二聚體無破壞作用。底物G-6-P或輔酶NADP與蜂毒素混合后加入反應系統(tǒng)均出現(xiàn)G-6-PD活性檢出滯后現(xiàn)象，表明蜂毒素與G-6-P及NADP都具有親和性，它是通過與G-6-PD競爭底物及輔酶來抑制G-6-PD活性的。蜂毒素抑制G-6-PD活性從而阻礙紅細胞HMP途徑，損害紅細胞還原系統(tǒng)。關鍵詞： 蜂毒素 膜活性 溶血活性 帶3蛋白 G-6-PD Na+/K+-ATPaseMelittin-induced hemolytic Process and the Study of biochemical Mechanism of Hemolysis induced by MelittinAuthor: Riqing Li, Xianfeng Lin, Baigang ChenDirector teacher: Yahua Zhao(South China Agricultural University, College of Life Science, GuangZhou, 510642)Abstract: Melittin-induced hemolytic process was observed, then its biochemical mechanism was studied. 1) The treatment of erythrocytes with FITC-marked melittin, as observed by laser confocal scan microscope, showed that melittin surrounded and adsorbed the surface of erythrocytes quickly, which might be induced by static gravitation. The verge of cellular surface began to stave in 10min, and the degree of this process was related to the ratio of concentrations of melittin and erythrocytes. Erythrocytes collapsed when the ratio reached to a given value. As observed by scanning electron microscope, erythrocytes appeared lacunose and coarse after they were disposed with melittin with low concentration. 2) By measuring anion transport activity of band 3 with SPQ, its showed the activity was enhanced over two folds than the normal level. A mechanism is proposed that melittin adsorbs glycated groups of band 3 by its C-terminus, and influences hydrophobic region of transmenbrane domain of band 3 and lipid fluidity of plasma membrane by its N-terminus, then enhances anion transport activity, which induces inner acidification of erythrocytes. 3) Measuring Na+/K+-ATPase activity by Molybdenum-blue Spectrophotometry showed that the activity of Na+/K+-ATPase was restrained when melittin targeted to the plasma membrane of erythrocytes or when melittin was dissociative, and the latter restraining was weakened when EDTA was added to the reaction. Melittin can inserts the plasma membrane of erythrocytes, which leads to the breakage of Na+/K+-ATPase. On the other hand, melittin statically attracts ATP and restrains the activity of Na+/K+-ATPase. The restraining will break cellular ion balance. 4) Measuring G-6-PD activity by a spectrophotometer showed that the activity of G-6-PD was restrained seriously when the concentration of melittin was 10mol/L or higher. However, this restraining effect was reduced in the presence of EDTA. Melittin did not damage the dimmer configuration of G-6-PD. A lag of activity mensuration was observed when a pre-mixture of G-6-P or NADP with melittin was set in the reaction system. This demonstrates that there is affinity between melittin and G-6-P and NADP separately, and melittin restrains the G-6-PD activity by competing G-6-P and NADP. The restraining checks cellular HMP, and damages the ability of deoxidization of erythrocytes.Key words: melittin membrane activity hemolysis activity band 3 proteinNa+/K+-ATPase G-6-PD 蜂毒素（melittin）是一種由26個氨基酸殘基組成的兩親性螺旋抗菌肽（antimicrobial peptide）分子，是蜂毒（bee venom）中的主要成分，其分子量為2840D。蜂毒素具有極強的廣譜抗菌消炎活性，能結合到磷脂膜上，裂解各種類型的細胞和脂質體，還有抗癌、抗電離輻射的功能1，以及有抗艾滋病毒的作用2。隨著傳統(tǒng)抗生素廣泛使用，出現(xiàn)了細菌耐藥性，耐藥菌株愈來愈多，甚至出現(xiàn)能對抗所有抗生素的耐藥菌3,4。研發(fā)具有抗耐藥菌的新一代抗生素已經(jīng)是迫切的課題?？咕耐ㄟ^作用于細菌細胞膜而抑制或殺死細菌，不易誘發(fā)細菌耐藥性，而有望替代傳統(tǒng)抗生素成為新一代抗生素5。蜂毒素因其生物活性高，且結構特殊，已經(jīng)成為生物學界研究這類抗菌物質的模式材料。然而蜂毒素具有溶血副作用，極大地限制了其在醫(yī)藥方面的應用。在蜂毒素抗菌機制和溶血機理研究的基礎上，通過生化或基因工程手段改造蜂毒素分子以保留其抗菌活性和消除其溶血活性已成為研究熱點6,7。蜂毒素的溶血機理的研究是其分子改造的理論基礎。目前主要通過蜂毒素與脂質體、合成磷脂雙層膜或天然質膜的作用關系來研究其溶血機理。研究認為蜂毒素溶血活性主要是基于穿孔機制8,9。但是蜂毒素與紅細胞膜上以及細胞內重要酶的作用關系目前還沒有深入研究，使得蜂毒素溶血機理尚不完備。筆者通過激光共聚焦掃描顯微鏡直接觀察蜂毒素的溶血過程，進而研究蜂毒素對紅細胞膜上和胞質重要酶的生化作用關系，從而全面闡述蜂毒素溶血機理，探索其溶血活性的生化基礎，為蜂毒素分子改造、溶血活性消除提供理論依據(jù)。帶3蛋白是紅細胞整合蛋白，在紅細胞膜骨架形成和穩(wěn)定中起重要作用。同時具有介導Cl/HCO3離子交換的活性，維持紅細胞內環(huán)境pH值穩(wěn)定。鈉鉀ATP酶（Na+/K+-ATPase）是紅細胞膜上重要的ATP酶，維持紅細胞的滲透性和靜息電位、保持細胞體積及可塑性。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）是磷酸戊糖途徑(HMP)的限速酶，能催化產生紅細胞還原當量NADPH，從而保護紅細胞免受氧化損傷。這些蛋白和酶在血紅細胞穩(wěn)定及避免溶血中起著關鍵作用。研究蜂毒素對帶3蛋白、Na+/K+-ATPase和G-6-PD的作用機理將有助于蜂毒素溶血機理的闡明。1 材料與方法1.1 材料新鮮肝素（Heparin）抗凝雞血（每100mL血液加入20mg肝素）。Melittin、Heparin、FITC、SPQ、G-6-P、NADP、Ouabain、ATP-Na2均為Sigma公司產品。戊二醛、鋨酸由華南農業(yè)大學測試中心電鏡室提供。其他試劑為國產分析純。1.2 方法 1.2.1 紅細胞懸液的制備 新鮮的肝素抗凝雞血，4 3000rpm 離心20min得到積壓紅細胞，以4預冷生理鹽水洗滌3次，懸浮，制成5紅細胞懸液，4保存（可穩(wěn)定一周）。1.2.2 溶血素的制備 取10mL 5%紅細胞懸液，4 5000rpm離心10min，去上清，沉淀用9.5mL 4預冷雙蒸水（每100mL加入5L -巰基乙醇）溶解，即可得到1 : 20溶血素，4保存（不宜超過8h）。1.2.3 紅細胞膜的制備按文獻10中的方法制備紅細胞膜，用0.75mmol/L蔗糖制成膜制劑溶液，用改良Lowry法測定蛋白濃度，-20貯藏。1.2.4 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察蜂毒素溶血過程40L 35mol/L蜂毒素溶液加入1L 1FITC溶液（丙酮做溶劑），混勻，25避光標記2h。取其中10L加到60L 5紅細胞懸液中，涂布于雞蛋清處理過的載玻片上，激光共聚焦顯微鏡下觀察，ex=492nm，enm=518nm，每15S掃描一次。1.2.5 掃描電鏡觀察蜂毒素處理后紅細胞1mL 5%紅細胞懸液加入30L蜂毒素溶液，混合，37水浴10min，1500rpm離心10min，棄上清，沉淀以等滲PBS洗3次。4%戊二醛溶液固定過夜，等滲PBS洗3次。1500rpm離心2min，沉淀以1%鋨酸固定1h，70%乙醇洗3次。1500rpm離心2min，沉淀上臺點樣，CO2干燥，真空噴金。（以上步驟均在4下進行。）樣品在掃描電鏡下觀察拍照。1.2.6 帶3蛋白陰離子轉運活性測定采用文獻11報道的方法。紅細胞以低滲法轉載SPQ熒光探針后，重懸于等滲溶液中（紅細胞濃度2%），加入蜂毒素（終濃度0.4mol/L），用F-4500型熒光分光光度計測定熒光強度，激發(fā)波長=320nm，發(fā)射波長=445nm，每5min記數(shù)一次。1.2.7 Na+/K+-ATPase活性的測定以500mol/L KH2PO4為標準溶液，測定、繪制D660nm值與磷（Pi）濃度關系的標準曲線。Na+/K+-ATPase活性參考文獻12報道的方法測定，以有和無Ouabain條件下水解ATP生成Pi的量的差值來表征。各組試驗經(jīng)三次平行測定，取平均值。1.2.8 G-6-PD活性的測定按文獻13中的方法測定。蜂毒素與底物G-6-P或輔酶NADP混合加入反應體系以啟動反應。各組試驗均經(jīng)三次平行重復，取平均值。2 結果與分析2.1 蜂毒素的溶血過程熒光探針FITC標記蜂毒素在ex = 492nm條件下發(fā)射綠色熒光。將FITC標記蜂毒素加入紅細胞懸液中，激光共聚焦掃描顯微鏡下動態(tài)觀察蜂毒素與紅細胞的作用過程和程度。FITC標記蜂毒素濃度為5mol/L（可完全溶血）時，看到蜂毒素迅速聚集到紅細胞周圍，附著細胞表面，使紅細胞呈現(xiàn)略黑的圓盤狀。圓盤邊緣附著蜂毒素最為密集（見圖1）。10min后，紅細胞圓盤邊緣附著蜂毒素部位呈小碎片脫落，紅細胞逐漸變薄、變亮。接著細胞邊緣開始破損，裂解，并逐漸向細胞中央發(fā)展，直至細胞成為碎片狀殘骸。該過程在2min內完成。細胞裂解程度與蜂毒素濃度相關，降低加入蜂毒素的濃度時（10mol/L），e引發(fā)活性滯后（形成四聚體），而d由于存在EDTA沒有出現(xiàn)活性檢出滯后，表明EDTA抑制melittin聚集形成四聚體。表3 梯度濃度melittin與EDTA對G-6-PD活性的作用Table 3 Effects of G-6-PD activity caused by melittin with concentration grads and EDTA體系試劑(L)defgh1mol/L Tris-HCl(pH7.4)30303030305mmol/L EDTA302mmol/L NADP30303030301mmol/L MgCl2303030303035mol/L melittin10010057100198100mmol/L G-6-P1212121212蒸餾水689814198 混勻，37水浴預熱體系中d、e、f、g、h的melittin濃度依次為11.7mol/L、11.7mol/L、6.65mol/L、11.7mol/L、23.4mol/L。d組含EDTA，其他組不含EDTA。d、e、f、g、h的Tris-HCl、 NADP、Mg+濃度與體系d、e、f、g、h是一致的。 In I system, melittin concentration of d、e、f、g、h were 11.7mol/L、11.7mol/L、6.65mol/L、11.7mol/L、23.4mol/L, respectively。d contained EDTA, and the others contained no.體系試劑(L)defgh1mol/L Tris-HCl(pH7.4)1701701701701705mmol/L EDTA1701702mmol/L NADP1701701701701701mmol/L MgCl21701701701701701:20溶血素4040404040蒸餾水980980115011501150 37溫育10min體系試劑加于石英比色杯中。體系d、e、f、g、h分別加到d、e、f、g、h中啟動反應（體系不含底物G-6-P，而體系含G-6-P，體系加到體系后啟動反應）， 此時d、e、f、g、h各反應體系中melittin的終濃度為：1.76mol/L、1.76mol/L、1.00mol/L、1.76mol/L、3.52mol/L。 In the system, all reagents were added in the respective quartz cup. d、e、f、g、h added in d、e、f、g、h separately and relevant reactions were started, when the melittin concentration of d、e、f、g、hwere 1.76mol/L、1.76mol/L、1.00mol/L、1.76mol/L、3.52mol/L, respectively.圖8 梯度濃度melittin及EDTA對G-6-PD活性的作用d、e含EDTA，反應啟動前melittin濃度為11.7mol/L；f、g、h不含EDTA，反應啟動前melittin濃度分別為6.65mol/L、11.7mol/L、23.4mol/L。 Fig. 8 Effects of G-6-PD activiry caused by melittin with concentration grads and EDTAd、econtained EDTA, the melittin concentration was 11.7mol/L；f、g、hcontained no EDTA, the melittin concentration were 6.65mol/L、11.7mol/L、23.4mol/L, respectively.G-6-PD活性檢出滯后延續(xù)較短的時間，G-6-P與melittin混合液加入反應體系后，隨melittin濃度降低（比如表3中d組，濃度從11.7mol/L變?yōu)?.76mol/L）四聚體解體，活性檢出滯后消失，G-6-PD進入平緩穩(wěn)定的抑制期，表明melittin的不同結構形態(tài)（四聚體與單體）對G-6-P的相互作用差異懸殊。將表2中2mmol/L NADP和6mmol/L G-6-P位置對換，6mmol/LG-6-P與35mol/L melittin混合液改為2mmol/L NADP與35mol/L melittin混合液（即由NADP或者NADP與melittin混合液來啟動反應），進行表2的操作，結果出現(xiàn)跟圖7類似的現(xiàn)象（見圖9，曲線a、b、c對應表2的 a、b、c）。 a、b、c斜率分別低于a、b、c，b的活性檢出滯后時間約1.5min，略小于b（約2min）?？梢奊-6-P及NADP與melittin的作用關系是相同的。G-6-P、NADP、EDTA、melittin的分子結構如圖10所示。G-6-P、NADP和EDTA的共同特點是帶有帶負電荷的基團（磷酸基團和羧基）。Melittin肽鏈中Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24等5個殘基帶正電荷，聚集為四聚體時，形成疏水中心，親水面向外，正電荷均勻分布在四聚體分子周圍25。推測G-6-P、NADP與melittin的相互作用是由磷酸基團與melittin正電殘基的靜電作用引起的。Melittin單體（無規(guī)則卷曲肽鏈）的正電荷無序而分散，四聚體的形成使得正電荷集中且均勻地分布，造成四聚體和單體對G-6-P和NADP的作用差異明顯。EDTA以四個空間分布特殊的羧基，阻止melittin聚集形成四聚體，同時削弱了其與G-6-P和NADP的靜電作用。G-6-PD正常反應曲線、反應體系加入melittin或melittin與EDTA混合液時的反應曲線（見圖11），與以上推測相吻合。圖9 以輔酶啟動發(fā)應時G-6-PD催化NADPH生成速率隨時間的變化a：以NADP啟動反應；b：以melittin與NADP混合液啟動反應；c：melittin和NADP分開，但同時加入反應體系，啟動反應。 Fig.9 Velocity of NADPH forming catalyzed by G-6-PD when the reaction are start with NADPa: reaction started with NADP; b: reaction started with the mixture of melittin and NADP; c: melittin and NADP were disjoined, but added in at the same time.圖10 G-6-P、NADP、EDTA、ATP、melittin分子結構Fig.10 The molecular structures of G-6-P、NADP、EDTA、ATP and melittin圖11 EDTA對G-6-PD活性的影響i：正常反應（不含melittin）； j：加入2mol/L melittin和0.5mmol/L EDTA；k：加入2mol/L melittin。Fig.11 The G-6-PD activity effected by EDTAi: contained no melittin; j: contained 2mol/L melittin and 0.5mmol/L EDTA; k: contained 2mol/L melittin. 以2mol/L melittin處理溶血素（含G-6-PD）30min后啟動反應，與不經(jīng)melittin處理而在啟動反應時加入2mol/L melittin，兩種反應條件下的G-6-PD活性沒有明顯差異（見圖12），表明melittin不會損傷G-6-PD二聚體，而是通過與其底物（G-6-P）及輔酶（NADP）的靜電作用來抑制G-6-PD。 圖12 melittin對G-6-PD二聚體的影響m： 2mol/L melittin處理G-6-PD 30min后啟動反應； n： 不經(jīng)melittin處理而在啟動反應時加入2mol/L melittin。 Fig.12 The effect of melittin on G-6-PD dimmer formation m: 2mol/L melittin was added 30 min before the start of reaction; n: 2mol/L melittin was added at the time the reaction started. G-6-PD存在輔酶結合位點和底物結合位點，輔酶結合位點與輔酶NADP親和作用極強，極低NADP濃度下即可反應，NADP的濃度變化對G-6-PD活性影響不明顯；底物結合位點對G-6-P親和性較弱，G-6-P濃度降低時G-6-PD活性下降顯著。在NADP為40mol/L的情況下，若G-6-P濃度從600mol/L下降至250mol/L，G-6-PD活性則減少53.6。melittin靜電吸引G-6-P，降低溶液中G-6-P濃度而影響G-6-PD活性。在血紅細胞內，NADP/ NADPH=1/71，NADPH穩(wěn)定濃度為65mol/L，NADP濃度約為1mol/L26，G-6-P濃度為83mol/L27，由于在紅細胞內環(huán)境中NADP、G-6-P濃度很低，1mol/L melittin將幾乎完全抑制G-6-PD的活性。3 結 論蜂毒素溶血過程里，蜂毒素分子首先迅速聚集并吸附在紅細胞表面周圍，推測該過程由蜂毒素C端正電荷殘基密集部位與紅細胞帶3蛋白以及血影蛋白負電荷糖化基之間的靜電作用引起。吸附紅細胞表面的蜂毒素經(jīng)過10min的作用過程，引發(fā)紅細胞圓盤邊緣開始破損、脫落。破損程度和蜂毒素濃度及紅細胞濃度的比值相關，達到一定比值時紅細胞被裂解。低濃度蜂毒素使紅細胞膜受到一定程度的損害，細胞內外滲透平衡打破，使紅細胞凹陷、不規(guī)則形狀，表面粗糙。這與紅細胞帶3蛋白及Na+/K+-ATPase活性受到蜂毒素影響相關。蜂毒素可能通過正電荷殘基密集的C端與帶3蛋白負電荷糖化基作用，同時疏水N端引起帶3蛋白結構以及其周圍膜脂流動性變化，促使帶3蛋白陰離子轉運活性顯著增加，Cl出胞、HCO3入胞過程得以加速，將影響紅細胞CO2運轉和排出功能，同時引起細胞內pH值迅速降低。Melittin以其膜活性破壞血紅細胞質膜完整性，從而間接破壞Na+/K+-ATPase活性，同時也通過與底物ATP的靜電作用直接抑制Na+/K+-ATPase的酶活。ATP是紅細胞內的供能分子，melittin的作用將影響ATP參與的代謝反應，對紅細胞代謝產生廣泛的干擾（見圖10）。Melittin對G-6-PD的抑制作用基于其與輔酶NADP及底物G-6-P的靜電作用（G-6-P、NADP的負電荷磷酸基團與melittin的正電荷氨基酸殘基），而對G-6-PD二聚體沒有直接的損害。當melittin從無規(guī)則卷曲單體聚集形成四聚體時，由于正電荷排布的均勻及有序化，對G-6-P及NADP的親和發(fā)生急劇變化。細胞內NADP的穩(wěn)定濃度為1mol/L 26 ，低濃度melittin將幾乎完全抑制G-6-PD的活性，中斷紅細胞HMP途徑，胞內還原系統(tǒng)受到抑制，紅細胞于是容易受到強氧化性分子的攻擊而使細胞膜受損，誘發(fā)溶血。G-6-P既是G-6-PD的底物，也是血紅細胞糖酵解（EMP）中的關鍵性中間產物，melittin與G-6-P的作用干擾EMP途徑，造成細胞內代謝干擾。EDTA存在四個空間分布特殊的羧基，阻止melittin聚集形成四聚體，同時也削弱melittin與NADP、G-6-P、ATP等分子的靜電作用。EDTA可作為melittin結構機理研究的一種工具性試劑。參考文獻1 Zhao YH, Liu AS, Li RQ, et al. Progress in biological mechanism of melittinJ. Acta Entomologica Sinica, 2007, 50(7): 7377442 Wachinger M, Kleinschmidt A, Winder D. Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus 1 by suppressing viral gene expression J. J Gen Virol, 1998, 79(4): 7317403 Bonomo RA. Multiple antibiotic-resistant bacteria in long-term-carefacilities: an emerging problem in the practice of infectious diseases J. Clin Infect Dis, 2000, 31: 14144 Wong AH, Wenzel RP, Edmond MB. Epidemiology of bacteriuria caused by vancomycin-resistant enterococci a retrospective studyJ. Am J Infect Control, 2000, 28: 2775 Andrea G, Giovanna P, Silvia FN. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeuticsJ. Central European Journal of Biology, 2007, 2(1): 1336 Zhao YH, Dong JN, Cui H, et al. Renaturation and Purification of Single Cliain Fv Fragment of Monoclonal Antibody Against HaemachromeJ. China Biotechnology, 2005, 25(2): 45-48 7 Sun XJ, Chen SX, Li SZ, et al. Deletion of two C-terminal Gln residues of 1226-residue fragment of melittin improves its antimicrobial activityJ. Peptides, 2005, 26: 3693758 Park SC, Kim JY, Shin SO. Investigation of toroidal pore and oligomerization by melittin using transmission electron microscopyJ. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 343: 2222289 Lin Y, Thad AH, Thomas M, et al. Barrel-Stave Model or Toroidal Model? A Case Study on Melittin Pores. Biophysical Journal, 2001, 81: 1475 148510 李建新, 魏堯梅, 許文生, 等. 人紅細胞膜Na+/K+-ATPase的研究J. 第二軍醫(yī)大學學報, 1983，4(4): 27528011 Dechecchi MC, Tamanini A, Berton G, et al. Protein kinase C activities chloride conductance in C127 cells stably expressing the cystic fibrosis geneJ. J Biol Chem, 1993, 268(15): 113211132512 董偉. 人紅細胞Na+/K+-ATP酶活力研究J. 生物化學與生物物理進展, 1983，10(3): 313313 叢玉隆, 殷宗健, 張立交,等. 貧血、血栓及遺傳學檢驗技術與臨床M. 天津：科學技術出版社，2002: 666814 Casey JR, Ding Y, Kopito RR, et al. The role of cysteine residues in the erythrocyte plasma membrane anion exchange protein, AE1J. J Biol Chem, 1995, 270(15): 8521852715 Bicknese S, Zimet D, Park J, et al. Detection of water proximity to tryptophan residues in proteins by single photon radioluminescenceJ. J Biol Chem, 1995, 54(3): 279-29016 Zhu Q, Lee DW, Casey JR. Novel topol