霍亂弧菌檢驗(yàn)操作規(guī)程.doc

霍亂弧菌檢驗(yàn)操作規(guī)程1 范圍本操作規(guī)程規(guī)定了帶菌者糞便，患者糞便、嘔吐物、肛拭子，外環(huán)境水樣，水生動(dòng)物、食品等標(biāo)本中的霍亂弧菌的檢驗(yàn)方法。2 檢驗(yàn)依據(jù)國家傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)：WS 2892008衛(wèi)生部疾病控制司霍亂防治手冊第五版北京市衛(wèi)生防疫站衛(wèi)生防疫微生物檢驗(yàn)操作規(guī)程北京市常見傳染病防制工作手冊（北京市疾病預(yù)防控制中心傳地所2008年12月內(nèi)部資料） 3 設(shè)備和材料3.1 冰箱： -204。3.2 恒溫培養(yǎng)箱： 361。3.3 暗視野顯微鏡： 10100。3.4 架盤藥物天平： 0g500g, 精確至0.5g。3.5 錐形瓶： 100 mL、500 mL。3.6 滅菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。3.7 滅菌平皿： 直徑90 mm。3.8 滅菌試管：10 mm75 mm、16 mm160 mm.。3.9 滅菌注射器： 1 mL。3.10 載玻片。3.11 蓋玻片。3.12 無菌棉簽。3.13 500mL滅菌采樣瓶。3.14 生物安全柜：級。4 培養(yǎng)基和試劑4.1 堿性蛋白胨水（Ph8.8-9.0 ， 1015mL/管 ， 10 50mL/瓶）。4.2 慶大霉素瓊脂（15-20 mL/塊）。4.3 普通營養(yǎng)瓊脂（15-20 mL/塊）。4.4 半固體培養(yǎng)基（3mL/小管，5mL/中管 ）。4.5 霍亂弧菌單克隆抗體(國家CDC流研所提供， 510L/菌落)。4.6 泰國SA診斷血清（510L/菌落)。5 檢驗(yàn)程序霍亂弧菌檢驗(yàn)程序見圖1。6 標(biāo)本的收集與送檢要求見表標(biāo)準(zhǔn)與要求（一）（四）7 操作步驟7.1 快速輔助診斷：其結(jié)果只是初步報(bào)告，不是確診報(bào)告。7.1.1 動(dòng)力及動(dòng)力抑制試驗(yàn)：7.1.1.1 如是急性期病人的水樣便，則用接種環(huán)或滴管取1滴水樣便在玻片上然后蓋上蓋玻片，直接用暗視野顯微鏡觀察動(dòng)力；或加生理鹽水1滴在玻片上，用接種環(huán)取較干的便1環(huán)放置生理鹽水中研勻，蓋上蓋玻片直接用暗視野顯微鏡觀察動(dòng)力；高度可疑的標(biāo)本可取已增菌的堿性蛋白胨水1滴在玻片上然后蓋上蓋玻片，直接用暗視野顯微鏡觀察動(dòng)力。如在鏡下見到穿梭樣運(yùn)動(dòng)（象夜空中的流星）即動(dòng)力試驗(yàn)陽性，否則陰性。7.1.1.2 動(dòng)力試驗(yàn)陽性的標(biāo)本，則取O1和O139群霍亂弧菌診斷用單克隆抗體各2滴放置玻片上，取標(biāo)本1滴或1環(huán)放在其中研勻，蓋上蓋玻片，用暗視野顯微鏡觀察是否有原來的穿梭樣運(yùn)動(dòng)，如穿梭樣運(yùn)動(dòng)已迅速停止并凝集成塊狀即動(dòng)力抑制試驗(yàn)陽性，否則陰性。7.1.1.3 動(dòng)力試驗(yàn)和動(dòng)力抑制試驗(yàn)結(jié)果可口頭初步報(bào)告，但不是確診報(bào)告。雙陽時(shí)口頭報(bào)告高度可疑。7.2 分離培養(yǎng)7.2.1 糞便、嘔吐物和肛拭子：對急性期病人水樣便標(biāo)本在堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)的同時(shí)可用接種環(huán)取一滿環(huán)或用棉拭子直接接種在慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基上；所有病人標(biāo)本都應(yīng)接種堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)。37增菌68h后，從菌膜下表層取一接種環(huán)培養(yǎng)物，把接種環(huán)在試管壁上輕輕碰一下，待接種環(huán)上留有殘液后劃線接種慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基，劃線時(shí)接種環(huán)在基線處反復(fù)多次劃線以接種的菌液干了為準(zhǔn)，最后用接種環(huán)從基線處開始不間斷劃線到完成或四區(qū)劃線（必須劃出單個(gè)菌落）。37培養(yǎng)，18h-24h。必要時(shí)（高度可疑或密接服藥的病人）可取第一次增菌液1 mL轉(zhuǎn)種于8-10mL堿性胨水管中37二次增菌培養(yǎng)68h后做分離。7.2.2 水樣：十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法 水體的采集一般用無菌的500mL水樣瓶采集相對靜止的表層水(深度為30cm以內(nèi))500mL，23小時(shí)內(nèi)送檢。取450mL水樣，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)整至pH8.8-9.0。然后加10倍濃縮堿性胨水50mL。為抑制雜菌可再加入1%亞碲酸鉀0.25 mL和1000單位/ mL青霉素1 mL。37培養(yǎng)過夜劃線接種慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基，接種劃線方法同7.2.1。培養(yǎng)時(shí)把瓶蓋打開三分之一。培養(yǎng)后取菌膜下表層培養(yǎng)物0.2-0.3 mL接轉(zhuǎn)種于10mL堿性胨水管中作二次增菌，37培養(yǎng)68h，再劃線接種慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基，37培養(yǎng)18-24h。接種劃線方法同7.2.1。7.2.3 食品及水產(chǎn)品樣本：7.2.3.1 液體食品：同7.2.2 7.2.3.2 涂抹標(biāo)本：使用無菌棉簽涂抹35只以上水水生動(dòng)物表面、腮部及泄殖腔或食品等表面，直接接種到10 mL堿性蛋白胨水，37增菌培養(yǎng)812h劃線培養(yǎng)。同時(shí)取菌膜下表層培養(yǎng)物接種慶大培養(yǎng)基分離培養(yǎng)同時(shí)吸0.20.1 mL轉(zhuǎn)種于10mL堿性胨水管中作二次增菌，37培養(yǎng)812h再劃線接種慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基，37培養(yǎng)18-24h。接種劃線方食品及水產(chǎn)品、物品表面涂抹涂樣本表面涂拭物病人糞便標(biāo)本水樣、液體食品等標(biāo)本 增菌過夜培養(yǎng)增菌 8-12h增菌 6-8h二次增菌6-8h二次增菌8-12h二次增菌6-8h 動(dòng)力試驗(yàn)（+）動(dòng)力抑制試驗(yàn)（+）慶大平皿劃線培養(yǎng)18-24h 每皿挑取9-10個(gè)可疑菌落血清凝集試驗(yàn)口頭報(bào)告高度可疑 霍亂分群診斷（單克隆抗體）群群 霍亂分型診斷凝集和氧化酶試驗(yàn)陽性：確診報(bào)告PCR（測 CT） 分純（普通瓊脂）18-24h 半固體瓊脂18-24h分純（普通瓊脂） 上送菌種 圖1 法同7.2.1。7.2.3.3 固體食品：25-50克標(biāo)本放入堿性胨水中增菌培養(yǎng)同7.2.3.2。標(biāo)本與堿性胨水的比例為1：5。7.3 可疑菌落：每一慶大霉素瓊脂平板上各挑取9-10個(gè)少于9個(gè)的全部挑取)可疑菌落做玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。可疑菌落的形態(tài)：略帶青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑濕潤。如延長培養(yǎng)時(shí)間或室溫放置到48h，菌落略帶黃色，中心形成黑色金屬碲沉淀。7.4 鑒定分型7.4.1 玻片凝集試驗(yàn)7.4.1.1 01、0139群霍亂弧菌初步鑒定：挑取可疑菌落與01群、0139霍亂弧菌單克隆抗體做玻片凝集試驗(yàn)。如可疑菌落很快(一般在10s內(nèi))出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集顆粒，在生理鹽水中不凝集者判為陽性。均為陰性時(shí)方可報(bào)告：未檢出01、0139群霍亂弧菌。7.4.1.2 分純：用接種環(huán)取抗原抗體復(fù)合物接種于普通營養(yǎng)瓊脂板上分純，37過夜培養(yǎng)。7.4.1.2 復(fù)核及分型：挑取可疑菌落和純培養(yǎng)物進(jìn)行復(fù)核及分型。01、0139群霍亂弧菌用診斷血清和單克隆抗體復(fù)核。01群霍亂弧菌分型使用小川型及稻葉型的單價(jià)血清和單克隆抗體做玻片凝集反應(yīng)，同時(shí)用生理鹽水做對照。與小川型單價(jià)血清和單克隆抗體凝集，與稻葉型單價(jià)血清和單克隆抗體不凝集者為小川型。與小川型單價(jià)血清和單克隆抗體不凝集，與稻葉型單價(jià)血清和單克隆抗體凝集者為稻葉型。與小川型、稻葉型單價(jià)血清和單克隆抗體均呈明顯凝集者為彥島型。7.4.2 氧化酶試驗(yàn)和菌種保存：取純單個(gè)菌與相應(yīng)的血清和單克隆抗體進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定的結(jié)果，如凝集陽性者做氧化酶試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意不要用過期試劑和金屬鐵質(zhì)的接種針（環(huán)），操作見WS 2892008附錄A（ A.4.1.2）。氧化酶試驗(yàn)陽性者保存菌種：用接種環(huán)取單個(gè)菌落穿刺半固體培養(yǎng)基中，底部1/3以下不必穿刺。37過夜培養(yǎng)，換膠塞密封室溫保存。7.4.3 PCR檢測霍亂毒素基因，見WS 2892008附錄B。7.4.4 菌種上送：半固體一支；純培養(yǎng)普通瓊脂一塊；填寫統(tǒng)一的送檢單。8 質(zhì)量控制81 用接種環(huán)取完標(biāo)本、診斷血清、做完每一份標(biāo)本實(shí)驗(yàn)等，接種環(huán)應(yīng)嚴(yán)格在酒精燈火焰上消毒，避免交叉污染。82 玻片凝集試驗(yàn)陽性時(shí)，一定同時(shí)做生理鹽水對照。在生理鹽水中不凝集者，方可判斷為陽性。83 標(biāo)本、增菌管、培養(yǎng)平皿要嚴(yán)格編號，標(biāo)識清晰，避免結(jié)果錯(cuò)報(bào)。84 診斷血清、培養(yǎng)基保存在指定溫度范圍內(nèi)；診斷血清要在有效期內(nèi)使用，培養(yǎng)基保存不超過一個(gè)月。9 實(shí)驗(yàn)室生物安全91 標(biāo)本檢測要穿實(shí)驗(yàn)專用服、戴口罩、手套，用過的口罩、手套放黃色污物袋中，及時(shí)高壓處理。92 用過的玻片及時(shí)放入消毒缸中浸泡；實(shí)驗(yàn)完畢，用浸泡消毒液的抹布擦拭實(shí)驗(yàn)臺面，或紫外線照射消毒。93 消毒制品要有有效的批準(zhǔn)文號，在有效期內(nèi)使用。 配制的消毒使用液，要表明配制日期。94 標(biāo)本、培養(yǎng)物、實(shí)驗(yàn)廢棄物等，要經(jīng)高壓消毒處理后，方可丟棄。標(biāo)準(zhǔn)與要求（一）內(nèi) 容霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)WS289-20082009年霍亂檢測具體要求一標(biāo)本的收集1標(biāo)本種類患者糞便、嘔吐物、肛拭子必取腸道門診以患者糞便為主；爆發(fā)疫情患者糞便、嘔吐物、肛拭子必?。凰畼?，水生動(dòng)物、污染的標(biāo)本以涂抹為主、食品（可疑或剩余）等標(biāo)本。2標(biāo)本數(shù)量 水樣便取1-3 mL成形便取指甲大小肛拭子用直腸棉拭或采便管取水樣便或嘔吐物取1-3 mL；成形便取指甲大小；肛拭子用采便管；水樣500mL，涂抹標(biāo)本以3-5支無菌棉拭涂抹后為一件。食品 液體：250 mL；固體：25-50克標(biāo)準(zhǔn)與要求（二） 內(nèi) 容霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)WS289-20082009年霍亂檢測具體要求二標(biāo)本的送檢1運(yùn)送液種類堿性蛋白胨水（增菌液）；文臘二氏保存液；Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基；pH8.89.0堿性蛋白胨水（增菌液）2運(yùn)送液數(shù)量標(biāo)本與保存液比例約為1：5pH8.89.0堿性蛋白胨水（增菌液）1015mL標(biāo)準(zhǔn)與要求（三） 內(nèi) 容霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)WS289-20082009年霍亂檢測具體要求三標(biāo)本的分離培養(yǎng)1 直接分離培養(yǎng)急性期病人水樣便直接接種選擇性培養(yǎng)基腸道門診：急性期病人水樣便直接接種選擇性培養(yǎng)基；動(dòng)力、制動(dòng)試驗(yàn)。爆發(fā)疫情患者糞便、嘔吐物、肛拭子直接接種選擇性培養(yǎng)基。2 增菌后分離培養(yǎng)所有標(biāo)本用堿性蛋白胨水放37增菌68h后接種選擇性培養(yǎng)基腸道門診非水樣便放37增菌68h后接種選擇性培養(yǎng)基；動(dòng)力、制動(dòng)試驗(yàn)。爆發(fā)疫情患者糞便、嘔吐物、肛拭子放37增菌68h后接種選擇性培養(yǎng)基；外環(huán)境標(biāo)本37二次增菌。標(biāo)準(zhǔn)與要求（三） 內(nèi) 容霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)WS289-20082009年霍亂檢測具體要求三標(biāo)本的分離培養(yǎng)3.分離培養(yǎng)基種類強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基：慶大霉素瓊脂、4號瓊脂和TCBS瓊脂弱選擇性培養(yǎng)基：堿性營養(yǎng)瓊脂強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基：慶大霉素瓊脂4. 培養(yǎng)時(shí)間和可疑菌落的描述 標(biāo)本接種分離培養(yǎng)基放37培養(yǎng)1824h可疑菌落：慶大霉素瓊脂和4號瓊脂：灰色、圓形、透明或半透明、光滑、濕潤、扁平、大小約為2mm.堿性營養(yǎng)瓊脂:無色，其余同上灰色、圓形、透明或半透明、光滑、濕潤、扁平、大小約為2mm.標(biāo)準(zhǔn)與要求（四） 內(nèi) 容霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)WS289-20082009年霍亂檢測具體要求四菌株鑒定1.菌株初篩玻片凝集試驗(yàn):O1、0139群挑慶大霉素瓊脂、4號瓊脂和堿性營養(yǎng)瓊脂5個(gè)以上可疑菌落氧化酶試驗(yàn):腸道門診：玻片凝集試驗(yàn)O1、0139群挑慶大霉素瓊脂910個(gè)可疑菌落標(biāo)準(zhǔn)比較與要求（四） 內(nèi) 容霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)WS289-20082009年霍亂檢測具體要求四菌株鑒定2. 菌株復(fù)篩玻片凝集試驗(yàn):氧化酶試驗(yàn):區(qū)CDC: 玻片凝集試驗(yàn)用普通瓊脂的純菌O1、0139群、小川、稻葉氧化酶試驗(yàn)PCR檢測霍亂毒素基因2.菌株上送按菌株管理要求進(jìn)行上送半固體一支普通瓊脂一塊立即送檢或電話聯(lián)系根據(jù)情況而定，填寫統(tǒng)一的送檢單北京市腸道傳染病樣本送檢表送檢單位： 送檢日期： 年 月 日標(biāo)本來源：散發(fā)病例/ 疫情 / 監(jiān)測 / 鑒定 /其他（請注明） 采樣日期： 年 月 日 檢測項(xiàng)目：霍亂弧菌 / 志賀菌 / 腸致瀉性大腸桿菌 / O157：H7 / 沙門菌 / 腹瀉病毒 / 其他（請注明） 編號姓名性別年齡主要癥狀糞便性狀標(biāo)本類型臨床檢測結(jié)果采樣地點(diǎn)檢測結(jié)果（所有檢測結(jié)果均報(bào)）備注糞便可疑陽性培養(yǎng)物其他白細(xì)胞紅細(xì)胞其他試驗(yàn)主要癥狀：1發(fā)熱（ ）；2腹瀉（ 次/天）；3腹痛；4惡心；5嘔吐（ 次/天）；6里急后重；7其他（請描述，如呼吸道癥狀）：（可多選）糞便性狀：1稀便，2水樣便，3米泔水樣便，4洗肉水樣便，5粘液便，6膿血便，7血便，8其他（請注明）：檢測腹瀉病毒：需將原始糞便樣本保存在便盒立即送檢。24小時(shí)內(nèi)不能送檢的，凍存在-20冰箱內(nèi)，運(yùn)送時(shí)加冰運(yùn)送。送樣人