人參皂甙Rh2致MCF7ADM凋亡和逆轉(zhuǎn)MCF7ADM多藥耐藥性的基礎(chǔ).doc

人參皂貳Rh2致MCF一7/ADM凋亡和逆轉(zhuǎn)MCF一7/ADM多藥耐藥性的基礎(chǔ)研究摘要第一部分:乳腺癌耐藥細(xì)胞株體外模型的建立及其耐藥機理研究腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性 (Multidrugresistanee，MDR)是指腫瘤細(xì)胞接觸一種抗癌藥物產(chǎn)生耐藥的同時，對其它結(jié)構(gòu)和作用機理不同的抗癌藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥。MDR的原因是復(fù)雜的，但MDRI基因過度表達(dá)產(chǎn)生的p一糖蛋白 (permeabilityglyeoprotein，p一gp)是MnR產(chǎn)生的最重要原因。本實驗擬針對P一gP介導(dǎo)的多藥耐藥現(xiàn)象，建立人乳腺癌細(xì)胞系MCF一7的耐藥細(xì)胞株，以便為探討乳腺癌細(xì)胞MDR的發(fā)生機制，并探尋逆轉(zhuǎn)MDR的有效方法和藥物提供理想的體外實驗?zāi)Ｐ?。方?通過阿霉素濃度梯度誘導(dǎo)法逐步培養(yǎng)出MCF一7的耐藥細(xì)胞株MCF一7/ADM。MTT法測定并比較阿霉素(ADM)對MCF一7細(xì)胞和MCF一 7/ADM細(xì)胞的ICS。;通過羅丹明123滯留實驗比較MCF一7細(xì)胞和MCF一7/ADM細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強度的差別;RT-PCR和流式細(xì)胞儀比較MCF一7細(xì)胞和MCF一 7/ADM細(xì)胞內(nèi) mdrlmRNA表達(dá)及P一gp表達(dá)的不同。結(jié)果:歷時6個月，成功培養(yǎng)出MCF一7的耐藥細(xì)胞株MCF一 7/ADM。MCF一 7/ADM細(xì)胞的 ADMICS。為 65.43士 3.94pM，顯著高于MCF一7細(xì)胞的 ADMICS。一 1.12士 0.14pM(P0.05)，兩者相差約58倍;培養(yǎng)體系中加入等量羅丹明123，MCF一7lADM細(xì)胞羅丹明123熒光強度為(1.22士0.20)%，顯著低于MCF一7細(xì)胞羅丹明123熒光強度(97.67土1.01)%(P0，05)，兩者相差約80倍;RT.PCR法顯示出MCF一 7/ADM細(xì)胞內(nèi) mdrlmRNA高表達(dá)，MCF一7細(xì)胞內(nèi) mdrimRNA沒有表達(dá);流式細(xì)胞儀測定MCF一7lADM細(xì)胞內(nèi)P一gp表達(dá)為99.80%，而MCF一7細(xì)胞內(nèi)P一gP表達(dá)為53.70%，兩者相比有顯著差異。結(jié)論:MCF一7/ADM細(xì)胞具有典型的MDR現(xiàn)象，其產(chǎn)生MDR的機制主要為MDRI基因過度表達(dá)，導(dǎo)致P一gP過度表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減少。此耐藥細(xì)胞株的建立為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生機制和研究逆轉(zhuǎn)耐藥方法提供了理想的實驗工具。關(guān)鍵詞:MCF一7細(xì)胞系，多藥耐藥，MDRI基因，P一糖蛋白第二部分:人參皂貳RhZ對MCF一7及MCF一7/ADM的抑制作用研究目的:近年來，人們逐漸認(rèn)識到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是惡性腫瘤治療的新目標(biāo)。大量研究表明，單味中藥的有效成分及復(fù)方制劑在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中可以起重要作用。人參(PanaxginsengC.A)為五加科多年生草本植物，其成分具有諸多生物活性，人參皂試助2是由人參中提取的天然活性成分。大量研究證明RhZ具有非常顯著的抗腫瘤作用，其抗腫瘤藥理作用值得深入的研究。本研究擬以人乳腺癌細(xì)胞系MCF一7為受試對象，旨在研究Rh2在抑制MCF一7和MCF一7/ADM細(xì)胞增殖方面的作用及機理。方法:不同濃度Rh:分別作用于MCF一7及MCF一7/ADM細(xì)胞，應(yīng)用MTT法確定各組細(xì)胞在24小時、48小時和72小時三個時間點的增殖抑制率;通過流式細(xì)胞儀檢測RhZ對MCF一7及MCF一 7/ADM細(xì)胞壞死、凋亡和細(xì)胞周期的影響;并檢測RhZ對MCF一7及MCF一7/ADM細(xì)胞easpase3活性的影響。結(jié)果:580pmol/LRhZ可以顯著抑制MCF一7和MCF一7/ADM的增殖(P80pInol/L后細(xì)胞抑制率則不再隨燦:濃度增加而上升;RhZ對MCF一7細(xì)胞的抑制作用更強。40pmol/L助2主要通過導(dǎo)致MCF一7細(xì)胞壞死而抑制其增殖，壞死率為(31.9士2.55)%，凋亡率為(11.33士0.66)%，(P0.05);而相同濃度燦2作用于MCF一 7/ADM細(xì)胞，則主要是通過Caspases途徑誘導(dǎo)其凋亡，壞死率(7.28士0.20)%，而凋亡率達(dá)(26.49士2.42)%，(P0.05)。RhZ對兩種細(xì)胞周期的影響也有所不同:燦2使MCF一7細(xì)胞周期阻滯于S期，GZ/M期細(xì)胞減少;而在MCF一 7/ADM細(xì)胞中，變化卻相反，RhZ導(dǎo)致S期細(xì)胞減少，GZ/M期細(xì)胞增多。結(jié)論:人參皂貳Rh:通過不同機制抑制了MCF一7和MCF一 7/ADM細(xì)胞的增殖:RhZ主要通過導(dǎo)致MCF一7細(xì)胞壞死而抑制其增殖;而對于MCF一7從DM細(xì)胞，則主要是通過Caspases途徑誘導(dǎo)其凋亡。助:誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞系MCF一7/ADM凋亡的研究結(jié)果顯示其在抗腫瘤作用方面的獨特性。關(guān)鍵詞:人參皂貳RhZ，MCF一7細(xì)胞系，凋亡，壞死，細(xì)胞周期第三部分:人參皂貳Rh:逆轉(zhuǎn)MCF一7/ADM多藥耐藥性的研究目的:惡性腫瘤對化療藥物的多藥耐藥是當(dāng)今腫瘤化療失敗的主要原因，而MDRI基因過度表達(dá)產(chǎn)生的P一gp是多藥耐藥性產(chǎn)生的最重要原因，p一gp屬于ABC(ATp一 bindingCassette)轉(zhuǎn)運蛋白家族的一員，是一種能量依賴性藥物轉(zhuǎn)出泵，能將化療藥物從癌細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，從而使藥物在細(xì)胞內(nèi)積蓄濃度降低，藥物的細(xì)胞毒作用降低，導(dǎo)致腫瘤化療的失敗。因此，尋找低毒、有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑是腫瘤化療領(lǐng)域急需解決的問題。中藥治療腫瘤不僅毒副作用小，而且作用途徑比較廣泛。近年大量研究表明，許多單味中藥的有效成分及復(fù)方制劑在體外實驗中有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR的作用。本實驗的研究目的為:人參皂貳RhZ作為抗腫瘤作用非常顯著的中藥單體，是否具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的作用，并探尋其機理。方法:RhZ與ADM作用于MCF一7及MCF一 7/ADM細(xì)胞，72小時后，MTT法比較單獨應(yīng)用ADM與ADM聯(lián)合應(yīng)用助2各組 ADMIC50的變化;羅丹明123加入MCF一7及MCF一7/ADM細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析不同濃度Rh:和維拉帕米抑制羅丹明123外排的情況;RT.PCR法和流式細(xì)胞儀檢測Rh:對MCF一7/ADM細(xì)胞mdrlmRNA表達(dá)及P一gp表達(dá)的影響。結(jié)果:RhZ可以顯著降低MCF一7/ADM的 ADMICS。(P0.05)，40pmol/L燦:可使MCF一7/ADM的ADMICS。下降為2.14士0.26pM，耐藥倍數(shù)僅為1.91，而對MCF一7細(xì)胞的 ADMIC50卻沒有影響;助2可以增加MCF一7/ADM細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光表達(dá)強度(P0.05)，比維拉帕米抑制羅丹明123外排作用更強，在MCF一7細(xì)胞內(nèi)燦2和維拉帕米均無此作用;RhZ對MCF一7/ADM細(xì)胞 mdrlmRNA表達(dá)及P一gp表達(dá)沒有影響。結(jié)論:體外實驗中，人參皂貳Rh:可以有效逆轉(zhuǎn)P一gp介導(dǎo)的MCF一7/ADM的耐藥性，是一種安全、高效的MDR逆轉(zhuǎn)劑，可能成為具有廣闊前景的抗腫瘤藥物。關(guān)鍵詞:人參皂貳RhZ，MCF一7細(xì)胞系，多藥耐藥，逆轉(zhuǎn)，MDRI基因，P一糖蛋白前言腫瘤細(xì)胞對結(jié)構(gòu)、細(xì)胞靶點和作用機理迥然不同的抗癌藥物同時產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象稱為腫瘤多藥耐藥 (multidrugresistanee，MDR)，是腫瘤化療失敗的主要原因。MDR可分為天然性耐藥和獲得性耐藥。前者指細(xì)胞在未接觸到上述MDR相關(guān)藥物情況下即具有的多藥耐藥性，獲得性耐藥是指接觸后才產(chǎn)生的耐藥性。腫瘤多藥耐藥性是當(dāng)前基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱門領(lǐng)域之一，也是腫瘤治療中魚待解決的難題。MDR產(chǎn)生的機制非常復(fù)雜，目前己提出多種可能的途徑。其中，由人類多藥耐藥基因mdr一1所編碼的P一糖蛋白 (Permeabilityglyeoprotein，P一gp)是主要耐藥型之一。P一gp作為能量依賴的藥物泵，將化療藥物主動泵出細(xì)胞外，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥性zl。而要對產(chǎn)生MDR的腫瘤細(xì)胞化療成功，需要破壞P一gp介導(dǎo)的藥物抵抗，從而提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。預(yù)防和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的研究早在10余年前即己經(jīng)開展，其方法策略主要集中于發(fā)展P一gp的競爭性抑制劑及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。如鈣離子通道阻滯劑維拉帕米(Verapamil)和環(huán)抱霉素A(cyelosporinA)等及其衍生物可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性，但毒性過大和療效不佳限制了這些藥物的臨床應(yīng)用。近年來發(fā)展的轉(zhuǎn)錄后基因沉默 (Posttranseriptionalgenesileneing，PTGs)技術(shù)提示要阻止腫瘤細(xì)胞內(nèi)P一gp介導(dǎo)的MDR，就要選擇性地阻斷P一gp特異性mdr一lmRNA的表達(dá)，從而抑制P一gp的合成，這種方法的目的是在提高耐藥腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的效率和特異性的同時減少藥物毒性和副作用，研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用反義寡核昔酸鏈和核酸酶可以成功地抑制mdr一1mRNA的過度表達(dá)Iv。然而在實際應(yīng)用中，由于抑制效率低，專一性較差和較大的毒性成為目前這一方法所面臨的現(xiàn)實問題，另一方面，用藥量較大、成本過高也影響其臨床應(yīng)用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，我國的名貴中藥人參具有抗癌活性，其主要活性成分人參皂試(ginsenoside)能誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。其中 Rh:是從紅參中提取的天然活性成分，屬二醇組皂貳，分子式為C36H62OsHZO，分子量622，化學(xué)名為20(S)一人參二醇一3一氧一p一D-毗喃葡萄糖營(圖l)，簡稱RhZ，屬于小分子物質(zhì)且為脂溶性3”。國內(nèi)外一些學(xué)者先后報道Rh:對多種腫瘤細(xì)胞如小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞、C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞SK一HEP一1等具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并證明對正常細(xì)胞的毒性作用甚低【”一，3。而充分利用中醫(yī)扶正培本的理論，發(fā)揮中藥在抗腫瘤研究中的作用，克服腫瘤細(xì)胞的耐藥，提高化療的療效，是進(jìn)一步提高腫瘤治愈率的努力方向和優(yōu)勢所在。本實驗以人乳腺癌細(xì)胞系MCF一7為受試對象，研究Rh:對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用，并研究Rh:在逆轉(zhuǎn)MDR方面的作用及其機理，旨在進(jìn)一步闡述Rh2在抗腫瘤方面的機制。第一部分乳腺癌耐藥細(xì)胞株體外模型的建立及其耐藥機理研究對象和方法一、試劑與儀器(一)細(xì)胞系與試劑1.人乳腺癌細(xì)胞系MCF一7(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院免疫室提供)2.細(xì)胞培養(yǎng)液 RPMI1640(美國 Invitrogenlireteehnologies公司，含loou/ml青霉素和100只g/ml鏈霉素)3.胎牛血清(美國Gibco公司)4.Tris飽和酚、氯仿、異丙醇、無水乙醇、葡萄糖、NaCI(國產(chǎn)分析純)5.核酸提取試劑Trizol(美國 Invitrogenlifeteehnologies公司)6.凝膠電泳試劑Agarose(美國sigma公司)7.Superseript11逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Clonteeh公司)8.AdvantagePolymerasemix(美國 Invitrogenlifeteehnologies公司)9.EXTaq酶(日本TaKaRa公司)10.dNTP(美國Promega公司)11.ADM(美國Sigma公司)12.MTT(美國Sigma公司)13.羅丹明123(美國sigma公司)14.0.25%胰蛋白酶(美國HyClone公司)15.EDTA(美國Sigma公司)16.DMSO(美國Sigma公司)17.PE標(biāo)記P一170鼠單克隆抗體(UICZ)(美國CHEMICON公司)(二)儀器1.常溫離心機(德國Heraeus)2.低溫高速離心機(德國Heraeus)3.水平及垂直電泳設(shè)備(BioRAD公司)4.照相設(shè)備(BioRAD和Polaroid公司)5.核酸定量分析儀 (BeckmanDU640)6.pCR儀(Eppendorf公司)7.熒光定量pCR儀GeneAmp5700(美國ABI公司)8.倒置顯微鏡(olympus)9.流式細(xì)胞儀 (Beckmaneoulter.EPICS.XL)10.酶標(biāo)儀 (BioTek.SynergyHT)11.CO:培養(yǎng)箱(德國Heraeus)12.制冰機(日本Sanyo公司)13.GMP層流室(天津腫瘤醫(yī)院免疫室提供，衛(wèi)生部驗收合格)二、方法(一)MCF一7細(xì)胞的培養(yǎng)1.MCF一7細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)(1)取15ml離心管一支，加入10ml含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液。(2)從液氮罐中取出凍存MCF一7細(xì)胞一支，將其放入37水浴，輕柔振蕩lmin，使其解凍。待細(xì)胞完全溶化后，將凍存管放入70%乙醇中以清除表面污染。(3)打開瓶口，用吸管將解凍的細(xì)胞吸入(1)步驟中準(zhǔn)備好的15ml離心管中。(4)將離心管在室溫下離心，1000rmpxsmin，棄上清。再加入10ml含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液，重復(fù)離心一次，棄上清。(5)在離心管中加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液以重懸細(xì)胞。(6)將上步制備的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶中。置37oC、5%COZ孵箱中孵育。(7)每日觀察細(xì)胞密度，2一3天換一次培養(yǎng)液。2.MCF一7細(xì)胞傳代(1)當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶的80%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。首先吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS洗滌細(xì)胞兩次。(2)加入0.25%胰酶o.sml(加入胰酶量根據(jù)培養(yǎng)瓶大小有不同)，置于37“C、5%COZ孵箱中孵育l一3min。(3)鏡下觀察細(xì)胞變圓時，加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液使胰酶失活。(4)吹打細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液吸出分裝入新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮的培養(yǎng)液。置37oC、5%COZ孵箱中孵育。3.MCF一7細(xì)胞凍存(1)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長旺盛，進(jìn)入對數(shù)生長期時，用上法胰酶消化細(xì)胞(2)用含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，然后加入含10%DMSO的FBS，將沉淀細(xì)胞團(tuán)吹打，分裝入凍存管中，每管約lml。(3)將凍存管放入一80過夜，然后放入液氮罐中保存，以備后用。(二)MCF一7/ADM細(xì)胞的誘導(dǎo)、篩選和培養(yǎng)1.將MCF一7細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入o.lmg幾阿霉素，篩選出存活細(xì)胞，用含0.lmg/L阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞一個月。2.逐漸增加阿霉素濃度，不斷篩選出存活細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。每次改變阿霉素濃度后均維持培養(yǎng)一月后再增加濃度。3.選用在含有o.smg/L阿霉素的培養(yǎng)液中生長良好的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，即為MCF一7/ADM細(xì)胞。4.MCF一7/ADM細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇同MCF一7細(xì)胞。培養(yǎng)液為含0.smg/L阿霉素和10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液。(三)阿霉素(ADM)對MCF一7和MCF一7/ADM細(xì)胞增殖的抑制實驗1.MCF一7和MCF一7/ADM細(xì)胞的準(zhǔn)備(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)皿的80%時，吸去培養(yǎng)液。使用sml無菌PBS洗兩次。(2)加入0.25%胰酶0.sml，置于37oC、5%COZ孵箱中孵育l3min。(3)鏡下觀察細(xì)胞變圓時，加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液使胰酶失活。(4)吹打細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液吸出轉(zhuǎn)入15ml離心管中。(5)將離心管在室溫下離心， 800rmpxsmin，吸去上清。(6)在離心管中加入含5%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液 1ml以重懸細(xì)胞，并計數(shù)。(7)于離心管中繼續(xù)加入含5%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2又loszml。2.種板和加藥(1)將ADM溶于無菌PBS中(2)選擇擬設(shè)ADM濃度梯度制成 6580pmol/L(4mg/ml)母液備用。共11個。(3)取%孔板，依ADM濃度梯度計算擬種孔數(shù)(每個濃度設(shè)3個復(fù)孔)，將細(xì)胞懸液吹勻后，用移液槍將MCF一7和MCF一7/ADM細(xì)胞分別種于孔中，每孔 50pl，細(xì)胞數(shù)為l只104。(4)用含5%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液將ADM母液稀釋為 172pmol/L(稀釋40倍)，注入無菌Eppendorf管中，再依次倍比稀釋，制成86pmol/L，43林mol/L， 21.5協(xié)mol/L， 10.75協(xié)mol/L， 5.33pmol/L， 2.67pmol/L，l.33pmol/L，0.67pmol/L和0.33pmol/L的ADM溶液。(5)將各濃度ADM溶液按序加入各孔，每孔 50ul，使各孔終濃度依次為 86pmol/L， 43pmol/L，21.5林mol/L，10.75pmol/L，5.33pmol/L， 2.67pmol/L， 1.33pmol/L， 0.67pmol/L， 0.33mg/L，0.17mg/L以及opmol/L。Opmol/L為對照組，并設(shè)試劑對照孔。最終每孔液量為100pl。3。MTT實驗(l)將96孔板置于37oC、5%COZ孵箱中，分別孵育20h，44h，68h。(2)取出96孔板，室溫下每孔加入MTT液 (smg/L)10pl。(3)再次置于37oC、5%COZ孵箱中，孵育4h(4)將96孔板在室溫下離心，1000rmpxsmin，棄上清。(5)每孔加入DMSO100pl，置室溫中避光放置30min。(6)上酶標(biāo)儀震蕩305，在波長57Onm段測定各孔吸光度值(A值)。進(jìn)而計算出細(xì)胞生長抑制率，并估算出ADM對MCF一7和MCF一 7/ADM細(xì)胞的半數(shù)抑制率 (ADMIC50)。細(xì)胞生長抑制率二【1一(實驗組A值一試劑對照組A值)/(對照組A值一試劑對照組A值)IX100%4.實驗重復(fù)3次。(四)細(xì)胞內(nèi)羅丹明123留滯實驗1.MCF一7和MCF一7/ADM細(xì)胞的準(zhǔn)備(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長至75cm2培養(yǎng)皿的80%時，吸去培養(yǎng)液。使用10ml無菌PBS洗兩次。(2)加入0.25%胰酶l.oml，置于37oC、5%C02孵箱中孵育l一3min。(3)鏡下觀察細(xì)胞變圓時，加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液 1oml使胰酶失活。(4)吹打細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液吸出轉(zhuǎn)入15ml離心管中。(5)將離心管在室溫下離心， 800rmpXsmin，吸去上清。(6)在離心管中加入新鮮 RPMI1640培養(yǎng)液 1ml以重暴細(xì)胞，并計數(shù)。(7)于離心管中繼續(xù)加入 RPMI1640培養(yǎng)液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為ZXlo6zml待用。2.將MCF一7和MCF一 7/ADM細(xì)胞吹勻后分別注入無菌Eppendorf管中，每管lml。3.每管加入羅丹明123(l.omg/ml)spl(終濃度為5“g/ml)，37OC、5%tCO:孵箱中孵育60min。4.室溫下離心，1500rmpxZmin，棄上清。5.PBS液洗2遍后，用 lmlPBS重新懸浮細(xì)胞并移入流式管中。6.流式細(xì)胞儀用488nm激發(fā)光測定各組細(xì)胞熒光強度。7.實驗重復(fù)3次。(五)人參皂貳R婉影響MCF一7lADM細(xì)胞mdrl基因表達(dá)的實驗1.MCF一7和MCF一 7/ADM細(xì)胞的準(zhǔn)備(l)取對數(shù)生長期細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)皿的80%時，吸去培養(yǎng)液。使用15ml無菌PBS洗兩次。(2)加入0.25%胰酶 1.sml，置于37OC、5%C02孵箱中孵育l一3min。(3)鏡下觀察細(xì)胞變圓時，加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液 1oml使胰酶失活。(4)吹打細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液吸出轉(zhuǎn)入15ml離心管中，并計數(shù)。2.將McF一7和McF一7/ADM細(xì)胞吹勻后分別種入25。mZ培養(yǎng)瓶中，每瓶細(xì)胞數(shù)應(yīng))lxl護(hù)細(xì)胞。3.每瓶再加入含10FBSRPMI1640培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液量為10ml,375%COZ孵箱中孵育24h。4.用Trizol提取細(xì)胞總RNA(l)將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄去，加入適量的Trizol，吹打后移入Eppendorf管中。確保細(xì)胞完全裂解，液體基本澄清。(2)將上述Eppendor增室溫靜置 1smin，加入氯仿(200林 l/lmlTrizol)，振蕩，室溫靜置一omin，4， 12oooXg，離心lomin。(3)小心吸取上層水相置于另一個新的無菌EpPendor增中，加入異丙醇(500林l八 mlTrizol)，上下顛倒混勻，室溫靜置10min，4，C， 12000Xg，離心lomin。棄上清。(4)用80%乙醇(lml八mlTrizol)洗沉淀，4oC， 750oXg，離心smin，棄上清。重復(fù)此操作一次，吸凈乙醇，將Eppendor增口朝下傾斜放在無菌吸水紙上，室溫靜置15一ZOmin，使沉淀自然干燥。5.RNA定量(1)將RNA沉淀溶于DEPC處理的DDW中，取適量稀釋50倍后于分光光度計260nm處讀數(shù)。(2)按下式計算RNA濃度:RNA(林 g/ml)=40X0D26。 X50(稀釋倍數(shù))(3)計算取2林gRNA所需各標(biāo)本體積。其余RNA標(biāo)本80保存?zhèn)溆谩?.以RNA為模板，RT.PCR擴(kuò)增目的基因mdri和內(nèi)對照p一actin(l)盯實驗(總體系20卜l)配制如下反應(yīng)體系，置于PE一9600型PCR儀中，“，smin，然后立即置于冰上。在反應(yīng)體系中加入以下試劑，置于PE一9600型PCR儀中10mill。-，.二，妞.孟、以林林林、將以上體系置于PE一9600型PCR儀中，42oC，3min;加入 SuperseriPt111卜1(20ou)。42oC，60min;然后75oC， 1smin。加入 RnaseHI林l(Zu)，37，20min。反應(yīng)所得eDN加入DEPe處理的DDwso林l，使之成為 100林l，一20oC保存?zhèn)溆谩?2) 引物設(shè)計（表1）(3) 熒光定量PCR反應(yīng)(六)MCF一7和MCF一7lADM細(xì)胞P一gp蛋白表達(dá)的實驗1.將MCF一7和MCF一7/ADM細(xì)胞消化、吹勻后分別種入6孔板中，每孔1Xlo6細(xì)胞。2.每孔再加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液lml，37OC、5%C02孵箱中孵育24h。3.吸去培養(yǎng)液，每孔使用2ml無菌PBS洗兩次。4.每孔加入0.25%胰酶0.sml，置于37oC、5%COZ孵箱中孵育l一3min。5.鏡下觀察細(xì)胞變圓時，每孔加入含10%FBS的RPMll“0培養(yǎng)液Zm使胰酶失活。6.吹打細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液吸出轉(zhuǎn)入流式管中，并計數(shù)，每組細(xì)胞數(shù)應(yīng)妻IXlo6。7.4oC離心，800xg，smin，棄上清。8.PBS洗細(xì)胞兩次，800xg，smin，棄上清。9.每管加入用pE(Rphyeoe仔thrin)標(biāo)記的鼠xgo，或同型對照20協(xié)l。10.經(jīng)室溫避光孵育30min后上流式細(xì)胞儀檢測。11.實驗重復(fù)3次。(七)統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果以x士s表示，兩組之間比較采用t檢驗，P0.05為具有顯著性差異。結(jié)果一、MCF一7和MCF一7/ADM的 ADMICS。的差別。結(jié)果顯示，MCF一7/ADM的ADMIC，。明顯高于MCF一7，兩者相差約58倍(表2，圖2)。二.MCF一7和MCF一7/ADM細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光表達(dá)的差別。培養(yǎng)體系加入等量羅丹明1