酵母雙雜交試驗(yàn)流程.doc

精品文檔4月4日 劃線 配培養(yǎng)基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培養(yǎng)基（YPD YPDA） 取酵母細(xì)胞 劃線 30 生長(zhǎng)3天。需要用品：三角瓶 滅菌封口膜 酵母提取物 蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超凈臺(tái)中完成。4月6號(hào) 星期三（1） 選擇2-3mm的單克?。岊^吸?。┓湃?-5ml的YPDA液體培養(yǎng)基，30搖菌200rpm，8h7號(hào)下午開始，過夜培養(yǎng)，次日若菌液濃度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，可先置于4度冰箱保存。需要用品：200ul滅菌槍頭、50ml三角瓶、YPDA液體培養(yǎng)基、搖床。4月7號(hào) 星期四（2） 吸取2.5-10ul酵母培養(yǎng)液，加入25ml YPDA液體培養(yǎng)基，搖菌16-20h直到OD值0.15-0.3。下午4點(diǎn)開始 8號(hào) 8點(diǎn)結(jié)束Tips：由于第一次活化的菌夜?jié)舛炔灰?，此處建議設(shè)置梯度，分別取2.5、5、10 ul酵母培養(yǎng)液，加入25ml YPDA液體培養(yǎng)基（轉(zhuǎn)化5個(gè)以下質(zhì)粒的話，25ml菌量就夠后續(xù)使用）。4月8號(hào) 星期五（3） 將菌液轉(zhuǎn)移至滅菌的50ml離心管中，用天平配平后，室溫下700g離心5分鐘。（4） 棄掉上清，加入50ml新鮮的YPDA液體重懸菌體（由于離心轉(zhuǎn)速較低，沉淀易懸起來，故倒掉上清液時(shí)要小心操作）。（5） 30震蕩培養(yǎng)，直到OD值達(dá)到0.4-0.5 （3-5h）。8號(hào) 8點(diǎn)開始 下午一點(diǎn)結(jié)束進(jìn)行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并準(zhǔn)備好冰浴。（6） 將上述菌液轉(zhuǎn)移至一個(gè)滅菌的50ml離心管中，用天平配平后，室溫下700g離心5分鐘。（7） 棄掉上清，用30ml無(wú)菌水重懸菌體（小心操作）。（8） 再次用天平配平后，室溫下700g離心5分鐘，棄去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重懸菌體。（9） 將上述溶液轉(zhuǎn)移到滅菌的1.5ml EP管中，高速離心15s。（10） 棄去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受態(tài)細(xì)胞制備完成，置于冰上待用。需要物品：50ml 滅菌離心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml滅菌槍頭、1ml滅菌槍頭、滅菌ddH2O、 YPDA液體培養(yǎng)基、1.1x TE/LIAC。1.1x TE/LIAC 10ML10xTE 1.1ml10xliac 1.1mlDh2O 8.8ml 酵母轉(zhuǎn)化進(jìn)行以下操作之前，配置適量的PEG/LIAC溶液，設(shè)置水浴鍋。（11） 取適量的CarrierDNA，沸水浴變性5-10min，后立即置于冰水混合物中。（每轉(zhuǎn)一個(gè)質(zhì)粒需準(zhǔn)備5ul CarrierDNA，每10個(gè)樣多準(zhǔn)備5ul）（12） 取數(shù)支滅菌的1.5ml EP管編號(hào)，置于冰水混合物上冷卻。（13） 每個(gè)EP管中加入5ul變性后的CarrierDNA，再加入5ul待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，用槍頭混勻。（14） 向每個(gè)EP管中再加入50ul感受態(tài)細(xì)胞，輕敲管壁混勻（不要用槍頭吹打）。（15） 向每個(gè)EP管中再加入500ul PEG/LIAC溶液，上下顛倒混勻（不要用槍頭吹打）。（16） 30水浴30min，每10min拿出來上下顛倒混勻（此過程中倒SD平板）。（17） 向每個(gè)EP管中再加入20ul DMSO，上下顛倒混勻（多顛倒幾次，充分混勻）。（18） 42水浴15min，每5min拿出來上下顛倒混勻。（19） 高速離心15s，用槍頭吸出上清（由于液體粘稠，不能直接倒）（20） 加入1mlYPDA液體培養(yǎng)基，重懸菌體后，高速離心15s。（21） 棄掉上清，加入1ml滅菌的0.9%NaCl溶液重懸菌體。（22） 取100-200ul菌液涂板于相應(yīng)的SD缺陷培養(yǎng)基上。需要物品：BD質(zhì)粒（需提前準(zhǔn)備）、carrier DNA、PEG/LIAC、DMSO、滅菌1.5mlEP管、YPDA培養(yǎng)基、0.9%無(wú)菌NACL、水浴鍋、滅菌10ul、200ul、1ml槍頭。PEG/LIAC YPDAPEG3350 8ml 20g/l 蛋白胨10X TE 1ml 10g/l 酵母提取物10X LIAC 1ml 0.03g/l 腺嘌呤 20g/l 葡萄糖報(bào)告基因的檢測(cè)1 涂板于缺陷形SD固體培養(yǎng)基30培養(yǎng)直至長(zhǎng)出酵母細(xì)胞。2 長(zhǎng)出酵母細(xì)胞后，挑菌至缺陷型SD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)（3份）3 搖菌至OD=0.6-1.0 4 高速離心去上清，用無(wú)菌水重懸。5 稀釋菌液形成4個(gè)梯度 1:1 1:10 1:100 1:100