酶工程-題庫(kù)

酶工程酶的定義及其本質(zhì)：指一類具有高效率的特異性的生物催化劑。酶是具有催化活性的：蛋白質(zhì)(enzyme),核酸(ribozyme),或脫氧核酸(deoxyribozyme). 酶工程：它是一項(xiàng)利用酶、含酶細(xì)胞器或細(xì)胞作為生物催化劑來(lái)完成重要化學(xué)反應(yīng)，并將相應(yīng)底物轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的應(yīng)用型生物高新技術(shù)。 1971年，美國(guó)，第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議，確認(rèn)：酶工程的核心內(nèi)容酶的生產(chǎn)與應(yīng)用主要涉及：酶的產(chǎn)生；酶的分離純化；酶的固定化；酶分子的定向改造與修飾；酶生物反應(yīng)器；酶的應(yīng)用。第1章 酶的命名和分類國(guó)際系統(tǒng)分類法及編號(hào)（EC編號(hào)）系統(tǒng)編號(hào)方法是將每一種酶用4個(gè)數(shù)字編號(hào)，中間以“.”隔開(kāi)。第一個(gè)數(shù)字表示反應(yīng)性質(zhì)，分六大類，用1、2、3、4、5、6表示；第二個(gè)數(shù)字表示亞類，根據(jù)底物被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)標(biāo)號(hào)；第三個(gè)數(shù)字表示亞亞類，更精確反應(yīng)了所催化反應(yīng)底物或反應(yīng)物的性質(zhì)第三個(gè)數(shù)字表示亞亞類下的個(gè)別酶的順序號(hào)，一般按酶的發(fā)現(xiàn)先后次序進(jìn)行排列。1961年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：1氧化還原酶，2轉(zhuǎn)移酶，3水解酶，4裂合酶，5異構(gòu)酶，6合成酶酶的組成：?jiǎn)渭兠?，結(jié)合酶（全酶）=酶蛋白+輔助因子輔助因子：輔酶，輔基，金屬激活劑（金屬離子作為輔助因子）酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。輔助因子通常是作為電子，原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體。酶的分子結(jié)構(gòu)：活性部位和必需基團(tuán)必需基團(tuán)：這些基團(tuán)若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失?；钚圆课唬好阜肿又兄苯优c底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。(結(jié)合基團(tuán)專一性，催化基團(tuán)催化性質(zhì))維持酶的空間結(jié)構(gòu)酶活性中心特點(diǎn)：1）活性中心的某些功能基因是酶的必須基團(tuán)。2）活性中心只占酶分子的很小一部分3）酶的活性中心是一個(gè)三維實(shí)體4）酶的活性中心并不是和底物的形狀正好互補(bǔ)的5）酶的活性中心是位于酶分子表面的一個(gè)裂縫內(nèi)6）酶與其專一性底物的結(jié)合通過(guò)次級(jí)鍵實(shí)現(xiàn)的酶催化作用的特點(diǎn)：溫和性，專一性，高效性，可調(diào)性酶含量的調(diào)節(jié)（合成和降解），酶活性的調(diào)節(jié) 共價(jià)調(diào)節(jié)； 別構(gòu)調(diào)節(jié)；（協(xié)同效應(yīng)，同/異促效應(yīng)）；反/前饋調(diào)節(jié)；激素調(diào)節(jié)；同工酶調(diào)節(jié)第二節(jié) 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1. 酶活力與酶促反應(yīng)速度酶活力：在一定條件下，酶催化某一反應(yīng)的反應(yīng)速度（一般測(cè)初速度）。酶促反應(yīng)速率：?jiǎn)挝粫r(shí)間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。 單位：濃度/單位時(shí)間米氏方程米氏常數(shù)的意義：Km 稱為米氏常數(shù)，是當(dāng)反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度，單位為濃度單位。 1.Km是酶的特征性常數(shù)之一，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)；不同的酶其Km不同。但指在一定的溫度、pH、離子強(qiáng)度、一定的底物存在下而言的。 2.Km表示酶與底物之間的親和程度，Km越大，表示親和程度越小，酶的催化活性越低； Km越小親和程度大，酶的活性越高。 3.Km值可幫助判斷某一代謝的方向及生理功能。催化可逆反應(yīng)的酶，對(duì)正逆兩個(gè)方向反應(yīng)的Km常常是不同的。測(cè)定這些Km的大小及細(xì)胞內(nèi)正逆兩向的底物濃度，可以大致推測(cè)該酶催化正逆兩向反應(yīng)的效率；這對(duì)了解酶在細(xì)胞內(nèi)的主要催化方向及生理功能具有重要的意義。4. 判斷酶的最適底物。 有的酶可作用多種底物，因此對(duì)每一個(gè)底物都有一個(gè)Km值，Km最小的那個(gè)底物為該酶的最適底物或天然底物。 5.測(cè)定不同抑制劑對(duì)某個(gè)酶的Km及Vmax的影響，可區(qū)別抑制劑是競(jìng)爭(zhēng)性的還是非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑。 KM與VmaX的算法影響酶促反應(yīng)速度的因素：底物濃度，酶濃度，溫度，pH值，激活劑，抑制劑抑制劑的分類：不可逆抑制作用：1.非專一不可逆抑制劑2.專一性不可逆抑制劑可逆抑制作用：1.競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用2.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3.反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4.線性混合型抑制作用。Ks型不可逆抑制劑：根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的抑制劑，具有和底物類似的結(jié)構(gòu)，可以和相應(yīng)的酶相結(jié)合，同時(shí)所帶活潑化學(xué)基團(tuán)化學(xué)修飾酶分子中必需基團(tuán)從而抑制酶的活性。這種抑制劑是通過(guò)其對(duì)酶的親和力而對(duì)酶進(jìn)行修飾標(biāo)記的，所以又稱親和標(biāo)記試劑。Kcat型不可逆抑制劑（自殺性底物）：具有與天然底物相類似的結(jié)構(gòu)，本身也是酶的底物，被酶催化后，潛伏性的反應(yīng)基團(tuán)因酶的催化而暴露或活化，作用于酶的活性中心或輔基，使酶被共價(jià)修飾而失活。第三節(jié) 酶活力及其測(cè)定酶活力（enzyme activity）又稱酶活性，是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力大小就是指在一定條件所催化的某一化學(xué)反應(yīng)速度的快慢，即酶催化的反應(yīng)速度越快，酶活力越高，反之則表示該酶活力低。 常用的酶活力單位有三種： A. 國(guó)際單位 (IU)這種單位是由國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定的。 在標(biāo)準(zhǔn)條件(25、最適pH、最適底物濃度)下，酶每分鐘催化 1 mmol 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量，定義為1個(gè)國(guó)際單位 (IU)。 B. Katal是由國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)于1972年規(guī)定的一種新單位在最適條件下，每秒鐘能使1mol/L 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要酶的量定義為 1個(gè)Kat 。 1 Kat = 60106 IU1 IU= 1mol /L min=1/60 mol /L s=1/60 Kat= 16.6 nKat C. 自定義的活力單位指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)比活力是酶制劑純度的常用指標(biāo) 比活力越大，表示酶越純轉(zhuǎn)換數(shù) :表示酶的催化中心的活性，指在一定條件下每秒鐘每個(gè)活性中心或每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。 Vm=k3 /Et 轉(zhuǎn)換數(shù)=k3=Vm/Et 第二章 產(chǎn)酶微生物的分離和選育產(chǎn)酶微生物工業(yè)化要求:產(chǎn)酶量高，酶性質(zhì)符合要求最好是分泌型的胞外酶非致病菌,不產(chǎn)生毒素菌株穩(wěn)定,不易退化和感染噬菌體原料廉價(jià),發(fā)酵周期短,易培養(yǎng)提取產(chǎn)酶微生物的分離和選育調(diào)查研究查閱資料設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案（確定采集樣品的生境）采樣（確定特定的富集條件）平板分離（確定培養(yǎng)基及可能的檢測(cè)方法）原種斜面（確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎(chǔ)條件）大致步驟初篩（1株1瓶）復(fù)篩（1株35瓶）結(jié)合初步工藝條件摸索再?gòu)?fù)篩（1株35瓶）菌株35株單株純種分離投入生產(chǎn)：生產(chǎn)性能試驗(yàn)符合工業(yè)生產(chǎn)要求，毒性試驗(yàn)符合安全性要求，菌種鑒定菌種保藏產(chǎn)酶微生物的分離和選育工業(yè)微生物育種方法：誘變育種，雜交育種，基因工程育種第三章 酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)(一) 酶合成調(diào)節(jié)的類型 1.誘導(dǎo) (induction) 凡能促進(jìn)酶生物合成的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)。 組成酶：細(xì)胞固有的酶類。 誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來(lái)底物或其結(jié)構(gòu)類似 物而臨時(shí)合成的一類酶。既可以是酶的底物，也可以是底物的結(jié)構(gòu)類似物，或底物的前體物質(zhì)。 2. 阻遏 (repression) 能阻礙酶生物合成的現(xiàn)象稱為阻遏分解代謝物阻遏(catabolite repression)指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過(guò)甲碳源（或氮源等）在其分解過(guò)程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。反饋?zhàn)瓒?feedback repression)酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受阻的過(guò)程。調(diào)節(jié)基因(regulator gene)：常位于調(diào)控區(qū)的上游，可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatory protein) 調(diào)節(jié)蛋白是一類變構(gòu)蛋白，有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：操縱基因；效應(yīng)物。分為兩種：1）阻遏物，沒(méi)有誘導(dǎo)物時(shí)與操縱基因結(jié)合 2）阻遏物蛋白，只有在輔阻遏物存在時(shí)才與操縱基因結(jié)合（二）基因調(diào)控理論 Jacob and Monod的操縱子學(xué)說(shuō)（operon theory） 操縱子：原核生物中，由幾個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)組成的基因表達(dá)的協(xié)同單位。操縱子：1.結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì)）2.控制部位(操縱基因，啟動(dòng)子)酶生物合成的調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是微生物調(diào)節(jié)酶合成量的重要機(jī)制。意義：通過(guò)阻止酶的過(guò)量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。提高酶產(chǎn)量的策略（一）條件控制1. 添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物分為4類：1）酶的作用底物：淀粉，乳糖2）酶作用底物的前體3）酶的反應(yīng)產(chǎn)物：纖維素酶的產(chǎn)物纖維二糖（一般為胞外水解酶）4）酶的底物類似物或修飾物：IPTG2. 降低阻遏物濃度分解代謝物阻遏 1）盡量使用非阻遏性碳源（果糖，葡萄糖）2）采取流加方式限制阻遏性碳源；反饋?zhàn)瓒?）從培養(yǎng)基中去除終產(chǎn)物2）添加阻止產(chǎn)物的抑制劑3. 促進(jìn)分泌表面活性劑，增加細(xì)胞通透性4. 添加產(chǎn)酶催進(jìn)劑植酸鈣鎂，聚乙烯醇，醋酸鈉（二）菌種選育（一勞永逸）1.改良育種 (1) 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型選育組成型突變株；減少酶合成對(duì)誘導(dǎo)物的依賴性，突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因，使它不能形成阻遏物或失去了結(jié)合阻遏物的能力。(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜停猾@得在引起阻遏的條件下酶的產(chǎn)量也達(dá)到無(wú)阻遏水平2. 基因工程育種（1）改造調(diào)節(jié)基因（2）增加結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)（3）將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞表達(dá)第二節(jié) 酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué) 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)：在分批培養(yǎng)(batch culture)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)一般要經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、靜止期和衰亡期5個(gè)階段。液態(tài)發(fā)酵方法：分批培養(yǎng)：Batch culture在發(fā)酵起始前，將菌種和所需的原料全部投入發(fā)酵罐，然后在合適的條件下完成發(fā)酵過(guò)程。補(bǔ)料分批培養(yǎng)：Fed-batch culture指在分批培養(yǎng)的過(guò)程中補(bǔ)充易耗養(yǎng)料的工藝。連續(xù)培養(yǎng)：Continuouse flow culture連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，生物反應(yīng)器是一個(gè)開(kāi)放系統(tǒng)，通過(guò)連續(xù)補(bǔ)料加入無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液，又不斷地將發(fā)酵液移去。 二、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) （一） 酶生物合成的模式在分批培養(yǎng)過(guò)程中，根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為3種模式，即： 生長(zhǎng)偶聯(lián)型:同步合成型： 酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。中期合成型： 酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開(kāi)始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。 所對(duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型延續(xù)合成型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型 滯后合成型：只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶才開(kāi)始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。 對(duì)于：同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開(kāi)始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。計(jì)算：營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）和生長(zhǎng)速率之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系：Monod模型:比生長(zhǎng)速率（1/h） （specific growth rate）max：最大比生長(zhǎng)速率（1/h）S：營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度） 克/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營(yíng)養(yǎng)物利用常數(shù) 克/L，或 mol/L產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)一般產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表達(dá)為：式中 X細(xì)胞濃度(g /L) m細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(h-1) a生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g) b非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh) E酶濃度(IU/L) t時(shí)間(h) 第四章 酶的分離與純化酶分離純化的一般流程1）預(yù)處理（pretreatment）包括發(fā)酵液處理和細(xì)胞破碎等2）初步純化（rough fractionation）除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì),鹽析，等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑沉淀等3）高度純化（fine fractionation除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì),層析，電泳法等4）濃縮與干燥（concentration and desiccation使酶與溶劑分離的過(guò)程,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，透析，超濾和冷凍干燥等。第一節(jié) 酶的分離一、發(fā)酵液預(yù)處理二、細(xì)胞破碎（細(xì)胞破碎方法）三、酶的提取:把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來(lái)的過(guò)程，以供進(jìn)一步從中分離純化所需要的酶 提取目標(biāo)：a. 將目的酶最大限度地溶解出來(lái)，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。 b. 保持生物活性提取方法：（一）鹽溶液提取:鹽溶（salting in）（二）酸、堿溶液提取:胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，0.12mol/L 硫酸提取,pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)、防止蛋白變性（三）有機(jī)溶劑提取:與脂結(jié)合牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的酶，不溶于水，酸或堿中。 乙醇、丙酮和丁醇四、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同） 通過(guò)改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出。 濃縮作用和純化作用在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法： 中性鹽沉淀（鹽析法） 有機(jī)溶劑沉淀 選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性） 等電點(diǎn)沉淀 有機(jī)聚合物沉淀五、萃?。╡xtraction）分離 利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。萃取操作的3個(gè)步驟：1）混合 2）分離 3）溶劑回收（二） 雙水相萃取技術(shù)，又稱水溶液兩相分配技術(shù)（partion of two aqueous phase system）：用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）進(jìn)行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá)70%90%），故稱“雙水相”系統(tǒng)。 （三） 超臨界流體萃?。杭嬗姓麴s和溶液萃取的特征，與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。 超臨界流體(supercritical fluid，SCF）：超過(guò)氣液共存時(shí)的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點(diǎn)臨界點(diǎn)后的流體。（四） 反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)：又稱反膠束（Reversed Micelles）指表面活性劑（由親水的極性基團(tuán)和疏水的非極性基團(tuán)兩部分組成）分散在連續(xù)有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級(jí)的聚集體。第二節(jié) 酶的精制一、膜分離：借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。 1.透析 2.超濾二、層析法（一）凝膠過(guò)濾層析： 凝膠過(guò)濾又稱分子篩層析,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。基本原理：大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長(zhǎng)而后流出層析柱。（二）離子交換層析1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。兩種離子交換劑：陰離子交換劑； 陽(yáng)離子交換劑（三）親和層析(Affinity Chromatography)：由吸附層析發(fā)展起來(lái)的 ，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。又稱：功能層析（function chromatography）生物專一吸附（biospecific adsorption）選擇層析（selective chromatography）第三節(jié) 電泳電泳（electrophoresis, EP） ：指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過(guò)程。電泳技術(shù)是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。影響遷移率的因素：1）顆粒性質(zhì)：Q越大、r 越小、形狀越接近球形，v 越快。2）電場(chǎng)強(qiáng)度：E越高，v越快。3）溶液性質(zhì)：pH值：離pI越遠(yuǎn)，v越快。（用buffer保持恒定） 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，v 越低。原因：離子氛（ionic atmosphere）。通常，緩沖液離子強(qiáng)度在0.02-0.2之間。4）電滲：在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。 2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。 3.在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。因此，在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，提高了分辨率。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）簡(jiǎn)稱SDSPAGE。是目前測(cè)定蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量（relative molecular mass, Mr）的一種最好的辦法。等電聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質(zhì)（商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù) pI 的小分子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF-PAGE）。原理：兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自pI形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)不再泳動(dòng)，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。應(yīng)用：蛋白質(zhì)的分離純化；測(cè)等電點(diǎn)酶的濃縮和干燥 ：酶的干燥多采用冷凍干燥法。 2、 純化方案的評(píng)價(jià)（三）提純倍數(shù)與回收率: 酶的比活力(純度)=活力單位數(shù)/毫克蛋白比活力越高，酶純度也越好。表示酶制劑純度的一個(gè)指標(biāo)。純化倍數(shù)=提純后比活力/提純前比活力表示提純過(guò)程中純度提高的倍數(shù)。提純倍數(shù)越大，表示該方法純化效果越好?？偦盍γ富盍挝粩?shù) 酶液總體積即樣品中全部酶活力?；厥章侍峒兒竺缚偦盍?提純前酶總活力100表示提純過(guò)程中酶損失程度的大小?；厥章试礁?，損失越小。判斷一個(gè)分離純化方法的優(yōu)劣，常用總活力的回收率和比活力的提純倍數(shù)兩個(gè)指標(biāo)?；厥章剩悍从趁傅膿p失情況。提純倍數(shù)：表示方法的有效程度。一個(gè)好的純化步驟是回收率較高，提純倍數(shù)也較大。第五章 酶與細(xì)胞的固定化什么是固定化酶？被局限在某一特定區(qū)域上的，并且保留了它們的催化活力，可以反復(fù)，連續(xù)使用的酶。固定化酶的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1.易于與產(chǎn)物、底物分離；可以進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)，提高酶的使用率。2.提高酶的穩(wěn)定性。3.產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝。4.酶反應(yīng)過(guò)程能夠加以嚴(yán)格控制。5.較游離酶更適宜于多酶反應(yīng)。酶的固定化方法載體結(jié)合法：物理吸附法,離子交換吸附法,共價(jià)結(jié)合法,交聯(lián)法包埋法(網(wǎng)格型,脂質(zhì)體包埋法),微囊型固定化酶的制備原則 根據(jù)不同酶的性質(zhì)、不同的應(yīng)用目的以及不同的應(yīng)用環(huán)境：（1）保持自然酶的催化活性不破壞酶活性中心結(jié)構(gòu)。（注意結(jié)合部位、和反應(yīng)條件）（2）固定化的載體應(yīng)該與酶結(jié)合牢固。（3）載體不能與反應(yīng)液、產(chǎn)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。（4）有一定的機(jī)械強(qiáng)度，不會(huì)因攪拌破碎。（5）固定化后產(chǎn)生的空間位阻小。（6）成本低，利于工業(yè)化生產(chǎn)。細(xì)胞固定化細(xì)胞的固定化是利用物理、化學(xué)等因素將細(xì)胞約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍能保留其催化活性，并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。固定化細(xì)胞的優(yōu)越性：1)不需要分離純化，酶活力損失少2)固定化細(xì)胞密度大，縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)能力3)固定化細(xì)胞保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而更穩(wěn)定4)固定化細(xì)胞保留了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，既能以單一的酶，又以復(fù)合酶系完成整個(gè)反應(yīng)過(guò)程。特別是需要輔助因子的合成過(guò)程，如合成干擾素等。5)發(fā)酵液菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。固定化酶的性質(zhì)活性：多數(shù)情況下固定化酶活力常低于天然酶；有可能不影響；有時(shí)升高。穩(wěn)定性: 主要表現(xiàn)在對(duì)熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度；保存穩(wěn)定性好，可以保存較長(zhǎng)時(shí)間；對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解；對(duì)變性劑的耐受性提高。最適溫度：固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，但有些固定化酶的最適溫度與游離酶比較會(huì)有明顯的變化。最適pH值：常會(huì)發(fā)生一些變化，主要受載體帶電性質(zhì)和酶催化反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)的影響底物特異性：與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。酶的活性與酶的種類，反應(yīng)系統(tǒng)的組成，固定化方法以及固定化載體的不同而變化。影響酶催化活性的主要因素：構(gòu)象改變：固定化過(guò)程中酶和載體的相互作用，引起酶的活性中心/調(diào)節(jié)中心構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致酶活性改變的一種效應(yīng)。立體屏蔽：由于載體的孔徑太小，或是由于固定化的方式與位置不當(dāng)，給酶的活性中心/調(diào)節(jié)中心造成了空間障礙，底物無(wú)法直接和酶接觸，從而影響了酶活性的一種效應(yīng)。（大孔徑膠，連接臂）微擾：固定化載體的親水，疏水性質(zhì)與介質(zhì)的介電常數(shù)等直接或間接酶的催化能力。分配效應(yīng)：固定化載體的親水和疏水性質(zhì)使酶的底物、產(chǎn)物以及其他效應(yīng)在微觀環(huán)境與宏觀環(huán)境間發(fā)生了不等分配，改變了酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成平衡，從而影響酶反應(yīng)速度的一種效應(yīng)。擴(kuò)散限制效應(yīng)：指底物、產(chǎn)物以及其他效應(yīng)物的遷移和運(yùn)轉(zhuǎn)速度受到限制的一種效應(yīng)。第6章 酶反應(yīng)器什么是酶反應(yīng)器:酶和固定化酶在體外進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，都必需在一定的反應(yīng)容器中進(jìn)行，以便控制酶催化反應(yīng)的各種條件和催化反應(yīng)的速度。用于酶或固定化酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。酶反應(yīng)器是用于完成酶促反應(yīng)的核心裝置。功能：它為酶催化反應(yīng)提供合適的場(chǎng)所和最佳的反應(yīng)條件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。它處于酶催化應(yīng)過(guò)程的中心地位，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。酶反應(yīng)器的類型酶反應(yīng)器特點(diǎn)小結(jié)酶反應(yīng)器的選擇依據(jù)酶的應(yīng)用形式：游離酶，固定化酶依據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)依據(jù)底物 / 產(chǎn)物理化性質(zhì)其他考慮因素操作的簡(jiǎn)便性運(yùn)行的經(jīng)濟(jì)性第八章 酶化學(xué)修飾及修飾目的 一、酶化學(xué)修飾 1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因：1)細(xì)胞外穩(wěn)定性差；2)酶活性不夠高；3)具有抗原性。 2. 改變酶特性有兩種主要的方法： 1)通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變已分離出來(lái)的天然酶的活性。 2)通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。酶選擇性化學(xué)修飾：在較溫和的條件下，以可以控制的方式使一種蛋白質(zhì)同某些化學(xué)試劑起特異反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或其功能基發(fā)生共價(jià)的化學(xué)改變?；瘜W(xué)修飾方式：1. 肽鏈有限水解修飾利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾通常采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。 2. 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定的方法(一般為化學(xué)法)使酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。有氨基、羧基、巰基、咪唑基、吲哚基、酚羥基、羥基、胍基、甲硫基等大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）：是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。 1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。1 聚乙二醇修飾酶2 右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯修飾酶3 糖肽修飾酶4 具有生物活性的大分子修飾酶5 蛋白質(zhì)或其它大分子物質(zhì)修飾酶第九章 酶的蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程概念：是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對(duì)天然蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)和改造。蛋白質(zhì)工程兩種常用方法：定向進(jìn)化 理性設(shè)計(jì)定向進(jìn)化：突變 篩選突變位點(diǎn)是隨機(jī)的，不確定的；突變位點(diǎn)的數(shù)目也是不確定的；突變位點(diǎn)的效應(yīng)更熟不可預(yù)知的；理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學(xué)的，生物的）都可以應(yīng)用于定向進(jìn)化中突變體的產(chǎn)生。定點(diǎn)突變：突變位點(diǎn)是確定的，突變的個(gè)數(shù)也是預(yù)知的；突變的效應(yīng)可能是已知的，也可能是未知的；定點(diǎn)突變的方法一般是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的。重組酶的高效表達(dá) ：一、細(xì)菌表達(dá)體系，二、酵母系統(tǒng)中的表達(dá)，三、絲狀真菌中的表達(dá)第10章 非水介質(zhì)中酶的催化作