血清蛋白的分離、提純與鑒定.doc

血清清蛋白、-球蛋白的分離、提純于鑒定1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法 2、掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法 3、掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法 4、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法 5、了解柱層析技術(shù)2、 實(shí)驗(yàn)原理： 蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，其分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用不同蛋白質(zhì)在這些性質(zhì)上的差別，利用相應(yīng)的物理方法可分離純化不同蛋白質(zhì)。A.鹽析法：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性無(wú)機(jī)鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。同時(shí)，加鹽后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，從而破壞了蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間易于聚集沉淀，進(jìn)而使蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀析出。B.凝膠層析：利用蛋白質(zhì)與無(wú)機(jī)鹽類之間分子量的差異。當(dāng)溶液通過(guò)SephadeG-25凝膠柱時(shí)，溶液中分子直徑大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔，而分子量小的無(wú)機(jī)鹽能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔中，因此在洗脫過(guò)程中，小分子的鹽會(huì)被阻滯而后洗脫出來(lái)，從而達(dá)到去鹽的目的。C.離子交換層析:離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固定相上的離子進(jìn)行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離。 D.純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳）：血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，一般都低于pH7.4。它們?cè)趐H8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此電泳時(shí)可將它們分離為清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5條區(qū)帶。3、 材料與方法A材料樣品：人混合血清試劑：葡聚糖凝膠（G-25)層析柱、DEAE纖維離子交換層析柱、飽和硫酸銨溶液、醋酸銨緩沖溶液、20%磺基水楊酸、1%BaCl2溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥緩沖溶液、電泳儀、電泳槽B實(shí)驗(yàn)步驟鹽析（粗分離）葡聚糖凝膠層析（脫鹽）DEAE纖維素離子交換層析（純化）醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）具體操作流程示意：（一） 鹽析+凝膠柱層析除鹽：取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白)沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解過(guò)葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.07cm）過(guò)葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.07cm）用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液洗脫，流出液量約1ml時(shí)開(kāi)始檢測(cè)蛋白質(zhì)用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時(shí)開(kāi)始檢測(cè)蛋白質(zhì) 磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì) 磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12滴收集含有蛋白質(zhì)的峰液12滴繼續(xù)用 2ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液洗滌繼續(xù)用2ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測(cè)SO42-陰性 BaCl2檢測(cè)SO42-陰性用2-3ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平衡用2-3ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平衡（二） 離子交換層析（純化）：除鹽后收集的球蛋白過(guò)DEAE-纖維素層析柱（1.06cm）用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開(kāi)始檢測(cè)蛋白質(zhì)取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10滴，連續(xù)收集3管除鹽后收集的清蛋白過(guò)DEAE-纖維素層析柱（1.06cm）DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白用1ml 0.0mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約mL 0.06mol/L NH4AC緩沖液流洗，除去球蛋白和球蛋白 磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10滴，連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液流洗再生平衡2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)（三）醋酸纖維素薄膜電泳：1、點(diǎn)樣（如下圖）： - 點(diǎn)樣線 +2cm 點(diǎn)樣區(qū) （粗面）1.5cm 點(diǎn)樣線盡量點(diǎn)得細(xì)窄而均勻,寧少勿多 2、電泳：薄膜粗面向下點(diǎn)樣端置陰極端兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應(yīng)輕輕拉平電壓：110V時(shí)間：50min 3、染色和漂洗：電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2次），至背景顏色脫凈為止。 取出膜，用濾紙吸干即可。注意事項(xiàng)：1、所用血清應(yīng)新鮮，無(wú)沉淀物及細(xì)菌滋生。2、使用時(shí)勿將各時(shí)段所應(yīng)用的溶液濃度弄錯(cuò)。3、上樣時(shí)，滴管應(yīng)沿柱上端內(nèi)壁加入樣品，動(dòng)作應(yīng)輕、慢，勿將柱床沖起。流洗平衡時(shí)亦應(yīng)如此。4、洗脫時(shí)應(yīng)注意及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，并注意層析柱不要流干，進(jìn)入空氣。5、切勿將檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查SO42-的BaCl2混淆，因二者與相應(yīng)物質(zhì)生成的沉淀均為白色。6、葡聚糖凝膠價(jià)錢昂貴，要回收再生,避免損耗，嚴(yán)禁倒掉!4、 結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的現(xiàn)象：加樣時(shí)：把飽和硫酸銨加入到血清后觀察到溶液渾濁。溶液下層呈米黃色，上層呈淡黃色。離心后溶液分層為：下層為沉淀，呈乳白色。上層為清液，呈淡黃色。 原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：將4條經(jīng)過(guò)染色的醋酸纖維素薄膜并列，使點(diǎn)樣線位于同一水平。以正常血清蛋白圖譜為對(duì)照，觀察提純的物質(zhì)屬哪種蛋白。所得的照片如下圖：結(jié)果：從電泳圖譜中可以看出，血清樣品的電泳分離情況并不理想，除清蛋白外，1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白這4條區(qū)帶未能清晰分離。對(duì)于清蛋白第1管和清蛋白第2管，其電泳結(jié)果與血清的清蛋白電泳圖譜幾乎一致，可以確定管內(nèi)的蛋白質(zhì)為清蛋白，同理球蛋白管內(nèi)的蛋白質(zhì)為-球蛋白。討論： 1，對(duì)于血清樣品的電泳圖譜中4條球蛋白區(qū)帶分離情況不佳的情況，其可能為在滴加血清樣品時(shí)滴加過(guò)多，使得球蛋白的4條區(qū)帶彼此靠近而導(dǎo)致分離情況不佳的情況發(fā)生。2，對(duì)于清蛋白管和球蛋白管中區(qū)帶顏色淺的情況，其可能為提純操作中滴加洗脫液過(guò)多導(dǎo)致血清蛋白稀釋過(guò)度，導(dǎo)致收集的提純蛋白溶液的蛋白濃度降低而使得電泳所得區(qū)帶顏色較淺。3，對(duì)于清蛋白1管中清蛋白區(qū)帶彎曲的情況，其可能為未水平點(diǎn)樣或電泳時(shí)薄膜為放正所致。結(jié)論：本次試驗(yàn)所獲得的結(jié)果除血清樣品的電泳圖譜外基本與預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果相一致。思考題：1.硫酸銨鹽析一步,為什么是0.8ml血清加0.8ml飽和硫酸銨?答：因?yàn)榍宓鞍缀颓虻鞍椎柠}析濃度不一樣，使用半飽和硫酸銨溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml飽和硫酸銨混合可以形成半飽和硫酸銨溶液從而達(dá)到分離的目的。2.為什么實(shí)驗(yàn)中DEAE纖維素柱分離-球蛋白后不用再生,可直接用于純化清蛋白?答：因?yàn)榫彌_液相同并且分離球蛋白后DEAE纖維素柱的成分沒(méi)