藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué).doc

第一章 現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)簡(jiǎn)介 第一節(jié) 分子生物學(xué)試驗(yàn)方法與技術(shù) 分子生物技術(shù)在藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛，包括核酸分子探針的標(biāo)記、核酸分子雜交、多聚酶鏈反應(yīng)、蛋白印跡雜交技術(shù)、cDNA文庫(kù)、隨機(jī)分子庫(kù)技術(shù)、外核基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、人類(lèi)基因治療等?，F(xiàn)將更為常用的技術(shù)介紹如下：一、核酸分子探針的標(biāo)記 標(biāo)記核酸分子探針（nucleic acid probe）是進(jìn)行核雜交的基礎(chǔ)，根據(jù)核酸分子探針的來(lái)源及性質(zhì)進(jìn)行選擇，選擇的基本原則是具有高度的特異性，探針選擇直接影響雜交結(jié)果的分析。根據(jù)檢測(cè)對(duì)象和目的不同，可選擇不同的探針?lè)N類(lèi)及標(biāo)記方法。 探針?lè)N類(lèi)1基因組DNA探針 是克隆化的各種基因片斷，也是最常用的核酸探針，探針應(yīng)盡可能選用基因編碼（外顯子），避免使用內(nèi)含子及其它非編碼序列。2cDNA探針 與mRNA互補(bǔ)的DNA鏈稱cDNA，是一種較為理想的核酸探針，特異性較高。3RNA探針 RNA與RNA或DNA雜交體的探針?lè)€(wěn)定性，特異性高。4寡核苷酸探針 人工合成寡核苷酸片段做探針，可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列。 標(biāo)記物 常用的探針標(biāo)記物有兩類(lèi)：放射性同位素和非放射性同位素。標(biāo)記物的檢測(cè)具有高度靈敏性和特異性。標(biāo)記和探針結(jié)合不影響雜交的特異性和穩(wěn)定性。其中放射性同位素是應(yīng)用最多的探針標(biāo)記物，但易造成放射性污染，多數(shù)同位素的半衰期短，不能長(zhǎng)期存放。常用的放射性同位素有32P3P35S，有時(shí)也用14C,125I或131I。二、核酸分子雜交（nucleic acid hybridiazation ） 是指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈在一定的條件下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。核酸分子雜交是分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，靈敏度高、特異性強(qiáng)，主要用于特異DNA或RNA的定性定量檢測(cè)。三、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外酶促擴(kuò)增特異DNA片段的方法。傳統(tǒng)的DNA擴(kuò)增法是分子克隆法，需經(jīng)過(guò)DNA酶切、鏈接、轉(zhuǎn)化等步驟構(gòu)建含有目的基因的載體。然后導(dǎo)入細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，再用同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行篩選，操作復(fù)雜，耗時(shí)。PCR技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便。PCR是本世紀(jì)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中最重要的發(fā)明之一。四、cDNA文庫(kù) 是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ) DNA（complementary DNA,cDNA）。cDNA文庫(kù)是指一群含重組DNA細(xì)菌或嗜菌體克隆。每一個(gè)克隆只含一種mRNA的信息，足夠數(shù)目克隆的總和則含細(xì)胞的全部mRNA信息，此種克隆群體叫cDNA文庫(kù)。五隨機(jī)分子庫(kù)技術(shù)（random moleculer library） 采用不同技術(shù)手段和在不同的分子水平有效地實(shí)現(xiàn)分子的多樣性。其技術(shù)路線，一是利用化學(xué)合成的方法生成已知結(jié)構(gòu)的化合物，以某種特定方式和一定規(guī)律組合在一起，只要確定某一化合物具有活性，即可根據(jù)建庫(kù)的組合方式確定其結(jié)構(gòu)，圍繞此技術(shù)發(fā)展的隨機(jī)分子庫(kù)總稱為化學(xué)合成庫(kù)（synthetic chemical library）。二是利用基因工程方法直接合成的DNA或RNA的核酸庫(kù)（nucleic acid library ）,由DNA隨即編碼表達(dá)的小分子和大分子的混合群體而表達(dá)物的表面顯露又提供了可從龐大的復(fù)雜的群體中快速篩選到目的物，這就是近幾年發(fā)展起來(lái)的極富有應(yīng)用潛力的核酸編碼分子肽庫(kù)（oligonucleotide-encoded peptide library ）。六真核基因的表達(dá)調(diào)控技術(shù) 真核細(xì)胞具有比原核細(xì)胞更為龐大的和復(fù)雜的基因組。高等真核細(xì)胞基因組編碼成千上萬(wàn)個(gè)基因，基因內(nèi)遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過(guò)程，即基因表達(dá)過(guò)程受不同層次調(diào)節(jié)機(jī)制精密調(diào)控，此調(diào)控既決定著基因表達(dá)的量，又決定基因表達(dá)的時(shí)空順序。調(diào)控過(guò)程精密復(fù)雜，涉及到轉(zhuǎn)錄前染色質(zhì)的活化；轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)；轉(zhuǎn)錄后的加工；翻譯水平的調(diào)節(jié)及翻譯后的修飾等。基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。七轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 是用實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物。此種方法可建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，以研究外源基因在整體動(dòng)物中的表達(dá)調(diào)控率；能改變動(dòng)物基因使其表現(xiàn)更符合人類(lèi)需要；也可用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生人類(lèi)所需要的生物活性物質(zhì)。第二節(jié) 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)中的重要分支，它以生命基本單位細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用近代物理、化學(xué)和實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法，從顯微、亞顯微和分子水平來(lái)揭示細(xì)胞生命活動(dòng)及規(guī)律，其中包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、分化、遺傳、變異（包括癌變）、興奮、運(yùn)動(dòng)、代謝、衰老與死亡等基本生命現(xiàn)象，并且利用與調(diào)控細(xì)胞的行為活動(dòng)，已達(dá)到為生產(chǎn)實(shí)踐尤其為醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)服務(wù)。當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)藥保健事業(yè)聯(lián)系的較為緊密的熱點(diǎn)問(wèn)題主要有以下幾種：1）真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控；2）細(xì)胞膜、膜系、受體與信號(hào)傳遞研究；3）細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、衰老、癌變、死亡，尤其是程序性細(xì)胞死亡的研究；4) 細(xì)胞工程，包括基因工程及體細(xì)胞核移植的研究。一、細(xì)胞培養(yǎng)常用方法 1、細(xì)胞原代培養(yǎng)（primay culture） 又稱初代培養(yǎng)，即直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織、或器官、讓他們?cè)隗w外維持與生長(zhǎng)。原代細(xì)胞的特點(diǎn)是細(xì)胞或組織剛離開(kāi)機(jī)體，他們的生物狀態(tài)尚未發(fā)生很大的改變，一定程度上可反映他們?cè)隗w內(nèi)的狀態(tài)，表現(xiàn)出來(lái)源組織或細(xì)胞的特性，因此用于藥物實(shí)驗(yàn)尤其是藥物對(duì)細(xì)胞活動(dòng)、結(jié)構(gòu)、代謝、有無(wú)毒性或殺傷作用等研究是極好工具。常用的原代培養(yǎng)方法有組織快培養(yǎng)法及消化培養(yǎng)法。前者方法簡(jiǎn)單，細(xì)胞也較易生長(zhǎng)，尤其是培養(yǎng)心肌有時(shí)能觀察到心肌組織塊的搏動(dòng)。細(xì)胞從組織塊外長(zhǎng)并鋪滿培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶后即可進(jìn)行傳代。2、細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至單層匯合時(shí)，便需要進(jìn)行分離培養(yǎng)否則會(huì)因無(wú)繁殖空間、營(yíng)養(yǎng)耗竭而影響生長(zhǎng)，甚至整片細(xì)胞脫離基質(zhì)懸浮起來(lái)直至死亡。為此當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度時(shí)必須傳代或再次培養(yǎng)，目的是借此繁殖更多的細(xì)胞，另一方面是防止細(xì)胞的退化死亡。二、器官培養(yǎng)方法器官培養(yǎng)（organ culture）是指用特殊的裝置使器官、器官原基或它們的一部分在體外存活，幷保持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。器官培養(yǎng)可模擬體內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)，用于觀察組織間的相互反應(yīng)、組織與細(xì)胞的分化以及外界因子包括藥物對(duì)組織細(xì)胞的作用。器官培養(yǎng)方法很多，最經(jīng)典的方法即表玻皿器官培養(yǎng)法；一種最常用的方法是不銹鋼金屬網(wǎng)格法及Wolff培養(yǎng)法和擴(kuò)散盒培養(yǎng)法，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)情況選擇采用。三、放射自顯影術(shù)測(cè)定放射自顯影術(shù)（autoradiography）是利用放射性同位素電離輻射對(duì)核子乳膠的感光作用，顯示標(biāo)本或樣品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在緊密接觸的感光乳膠中記錄下它存在的部位和強(qiáng)度，準(zhǔn)確顯示出形態(tài)與功能的定位關(guān)系?，F(xiàn)已可將放射自顯影術(shù)與電鏡以及生物分子結(jié)合起來(lái)。不但可以研究放射性物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布代謝，而且可以揭示核酸合成及其損傷等改變，目前已在生命科學(xué)各領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。四、染色體分析技術(shù) 染色質(zhì)或染色體是遺傳物質(zhì)在細(xì)胞水平的形態(tài)特征。前者是指當(dāng)細(xì)胞處于合成期時(shí)遺傳物質(zhì)經(jīng)堿性染料著色后，呈現(xiàn)出細(xì)絲狀彌漫結(jié)構(gòu)；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂期時(shí)，染色質(zhì)細(xì)絲高度螺旋化凝聚為形態(tài)有特征的染色體。特別是在分裂中期，復(fù)制后的染色體達(dá)到最高程度的凝聚，稱為中期染色，是進(jìn)行染色體形態(tài)觀察分析的最佳時(shí)期。染色體分析應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣，主要用于以下幾方面：1）為臨床診斷提供新手段；2）研究不育和習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)；3) 通過(guò)檢查胎兒的染色體，預(yù)防有染色體異?；純撼錾ㄏ忍煊扌停?）根據(jù)染色體的多肽性進(jìn)行親子和異型配子的起源研究；結(jié)合DNA重組技術(shù)可以將基因定位于染色體的具體區(qū)帶上。五、電鏡技術(shù) 早在1940年，英國(guó)劍橋大學(xué)首先試制成功掃描電子顯微鏡，但因分辨率低無(wú)實(shí)用價(jià)值。1965年英國(guó)劍橋科學(xué)儀器有限公司開(kāi)始生產(chǎn)出商品掃描電鏡，其以顯著優(yōu)點(diǎn)廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、電子學(xué)及勘探、冶金、國(guó)防、公安、機(jī)械與輕工業(yè)等諸多領(lǐng)域，并已成為非常有用的研究工具。電鏡主要特點(diǎn)：1）景深大，較光學(xué)顯微鏡大幾百倍；2）圖像富有立體感，是一個(gè)具有真實(shí)感的三維結(jié)構(gòu)立體圖象；3）圖像放大范圍大，光學(xué)顯微鏡有效放大倍數(shù)為1000倍左右，透視電鏡的放大倍數(shù)為幾百倍至100萬(wàn)倍，掃描電鏡可放大十幾倍至幾十萬(wàn)倍；4）分辨率高，掃描電鏡可達(dá)63nm；5）樣品可在三度空間平移和旋轉(zhuǎn)，聚焦后可以任意放大倍數(shù)，而不需調(diào)整重新聚焦。六、細(xì)胞、細(xì)胞器、及細(xì)胞間質(zhì)的分離技術(shù)、 1、 細(xì)胞的分離 分離不同的細(xì)胞及亞細(xì)胞組分在現(xiàn)代生物學(xué)研究中起著重要的作用。如研究某種藥物治療白血病的機(jī)理，需要分離培養(yǎng)人或動(dòng)物的骨髓細(xì)胞，觀察藥物的細(xì)胞作用；研究與細(xì)胞生長(zhǎng)分化有關(guān)的生長(zhǎng)因子的作用，需將與此類(lèi)因子有關(guān)的細(xì)胞分離出來(lái)；分離細(xì)胞膜，線粒體等細(xì)胞的亞組分，對(duì)于研究信號(hào)傳遞，某些遺傳疾病，也都是必不可少的手段。 2、細(xì)胞膜的分離 細(xì)胞內(nèi)的膜系統(tǒng)與細(xì)胞質(zhì)膜統(tǒng)稱為生物膜（biomembrane）,他們都有共同結(jié)構(gòu)和特征。首先要分離出形狀完整的、具有生物活性的、高純度的細(xì)胞膜，用于研究細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，以利于觀察膜在細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行能量交換及信息傳遞的過(guò)程。3、細(xì)胞核的分離 細(xì)胞核作為一個(gè)功能單位，完整的保存遺傳物質(zhì)，幷指導(dǎo)RNA合成，后者為蛋白質(zhì)及其它細(xì)胞組分合成所必需。因此細(xì)胞核分離是研究基因表達(dá)及細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)的首要步驟。不同組織來(lái)源的細(xì)胞經(jīng)勻漿后，用分級(jí)離心或超聲波處理等方法進(jìn)行純化。4、溶酶體的分離 溶酶體是處理細(xì)胞吞噬物的細(xì)胞器，含有高濃度的各種水解酶類(lèi)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的消化過(guò)程。溶酶體的分離常用于研究因溶酶體功能缺陷而引起的多種疾病。5、線粒體的分離 線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場(chǎng)所，細(xì)胞活動(dòng)所需要的能量，主要由在線粒體內(nèi)進(jìn)行氧化所產(chǎn)生的能量供給。制備線粒體關(guān)鍵是保持其完整性及高純度。 6、細(xì)胞DNA、RNA分離與純化 核酸是遺傳信息及基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸的提取與純化關(guān)鍵是保持核酸的完整性，但較困難，主要因?yàn)椋阂皇羌?xì)胞內(nèi)有活性很高的核糖核酸酶；二是酸堿等化學(xué)因素；三是高溫機(jī)械損傷等物理因素，需嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。七、細(xì)胞凋亡研究方法 細(xì)胞凋亡(apoptosis),又稱為程序性死亡（programmed cell death,PCD）指的是有核細(xì)胞在一定條件下，通過(guò)激活其自身內(nèi)部機(jī)制，尤其是開(kāi)啟與關(guān)閉某些基因以及內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶活化，導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞自然性死亡的過(guò)程?？梢哉J(rèn)為細(xì)胞死亡的這種方式是一種生理性的自發(fā)過(guò)程。為此有人也稱其為細(xì)胞自殺。目前認(rèn)為程序性死亡幾乎和細(xì)胞的增殖同樣重要，如果沒(méi)有細(xì)胞凋亡，個(gè)體不能形成與存活，或者發(fā)生疾病。只有通過(guò)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使特定細(xì)胞群體在特定的時(shí)間和特定的部位死亡。從而使機(jī)體在總體上保障其細(xì)胞數(shù)量，以及形態(tài)與功能的平衡。近年來(lái)如何用藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡也成為細(xì)胞凋亡的熱點(diǎn)之一。透視電鏡觀察是研究細(xì)胞凋亡的首選方法。八、原位雜交 原位雜交技術(shù)是將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合，用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特異互補(bǔ)的DNA或RNA序列。它分為三類(lèi)：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已廣泛用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。原位DNA末端標(biāo)記可以用于細(xì)胞凋亡的定量研究。原位雜交技術(shù)和PCR技術(shù)結(jié)合用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒（HPV）九、單克隆抗體是1975年被描述的一種可產(chǎn)生無(wú)限量，并可預(yù)測(cè)其性質(zhì)的抗體制備技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵步驟在于淋巴細(xì)胞之間的融合，所以稱為“淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)”；由于雜交瘤經(jīng)過(guò)篩選可產(chǎn)生針對(duì)單一抗原決定簇抗體的細(xì)胞克隆，故稱為單克隆抗體技術(shù)。該技術(shù)的問(wèn)世使得免疫學(xué)研究與實(shí)踐發(fā)生了革命性的改觀，同時(shí)還為生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的許多領(lǐng)域提供了前所未有的研究工具。人們利用其可精確地識(shí)別出極為復(fù)雜的分子，測(cè)定出無(wú)法測(cè)定的物質(zhì)，識(shí)別出新的細(xì)胞群體，揭示了以往未曾了解的細(xì)胞分化途徑，為腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的診斷和治療創(chuàng)造出令人興奮的前景。十、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出某一種神經(jīng)組織，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下模擬在體生理環(huán)境，使之存活和生長(zhǎng)，幷保持其結(jié)構(gòu)和功能。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)按培養(yǎng)前切割程度分為器官培養(yǎng)、組織快培養(yǎng)和細(xì)胞分離培養(yǎng)。1、器官培養(yǎng) （organ culture ） 是切割最少型的培養(yǎng)。全器官或器官大片放在保溫的營(yíng)養(yǎng)液中可保存數(shù)日。這類(lèi)培養(yǎng)切斷了正常的血供，器官的營(yíng)養(yǎng)交換取決于簡(jiǎn)單的灌流。2、組織塊培養(yǎng) （explant culture） 是真正最小器官培養(yǎng)。組織塊通常厚度為0.51mm，一個(gè)或幾個(gè)組織塊放在一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)存活數(shù)周。實(shí)驗(yàn)在其組織塊周?chē)L(zhǎng)出的邊緣細(xì)胞上進(jìn)行。3、細(xì)胞分離培養(yǎng) （dissciated cell culture ）是由分散其原始組織至其組成的細(xì)胞。常用酶進(jìn)行消化。第三節(jié) 信息傳遞的研究方法與技術(shù)一、受體與配基結(jié)合試驗(yàn)技術(shù) 受體與配基結(jié)合試驗(yàn)是一種在體外直接觀察受體的實(shí)驗(yàn)手段。隨著各種高比活度的特異性受體配基的合成，此方法已成為藥理學(xué)的基本技術(shù)之一，幷廣泛用于生理、生化、細(xì)胞生物等許多相關(guān)學(xué)科。二、G蛋白的純化分離技術(shù) G蛋白是細(xì)胞膜上一類(lèi)結(jié)構(gòu)和功能都非常相似的蛋白質(zhì)。其主要功能是偶聯(lián)受體及其效應(yīng)器。受體與激動(dòng)劑結(jié)合并被激活時(shí)，先激活其相應(yīng)的G蛋白，然后G蛋白再與相應(yīng)的效應(yīng)器（酶離子通道等）發(fā)生反應(yīng)，改變效應(yīng)器的活性。與G蛋白偶聯(lián)的受體種類(lèi)繁多，受G蛋白調(diào)控的效應(yīng)器包括腺苷酸環(huán)化酶，磷脂酶C，cGMP磷酸二酯酶，離子通道等。因此，G蛋白的研究對(duì)闡明跨膜信息傳遞機(jī)理有非常重要的意義。三、環(huán)核苷酸測(cè)定技術(shù) 環(huán)核苷酸是重要的細(xì)胞內(nèi)信使物質(zhì)，參與調(diào)控各種激素、神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)所導(dǎo)致的各種細(xì)胞生命活動(dòng)。常用的測(cè)定方法有：cAMP蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法；cGMP放射免疫測(cè)定技術(shù)；腺苷酸環(huán)化酶測(cè)定技術(shù)等。四、花生四烯酸代謝產(chǎn)物測(cè)定技術(shù)細(xì)胞內(nèi)磷脂、甘油三酯及膽固醇經(jīng)?；饷傅淖饔冕尫懦龌ㄉ南┧幔╝rachidonic acid ,AA）。而AA通過(guò)環(huán)加氧酶和脂加氧酶途徑分別代謝轉(zhuǎn)化為一系列活性物質(zhì)，如前列腺素、前列環(huán)素、血栓素、白三烯等。這些物質(zhì)在體內(nèi)含量少，但有極強(qiáng)的生物活性。能調(diào)節(jié)多種系統(tǒng)（神經(jīng)、內(nèi)分泌、消化、呼吸、生殖、血液、心血管、腎等）,并在炎癥、免疫、過(guò)敏、凝血、腫瘤和心血管等一系列的病理過(guò)程中發(fā)揮作用而具有重要的臨床意義。常用的檢測(cè)方法：生物測(cè)定法、高效液相測(cè)定法、放射免疫分析法、酶免疫測(cè)定法、放免配基受體結(jié)合法。五、肌醇磷脂及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定技術(shù) 肌醇磷脂是細(xì)胞膜中的一種脂質(zhì)，能被磷脂酶C水解生成三種重要的細(xì)胞內(nèi)信使物質(zhì)，都已成為藥理學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科中研究的熱點(diǎn)。常用實(shí)驗(yàn)方法有：肌醇磷脂的測(cè)定、磷酸肌醇的分離及測(cè)定、甘油二酯的測(cè)定、同位素標(biāo)記測(cè)定肌醇磷脂等。六、蛋白激酶C的純化和測(cè)定 蛋白激酶C是一種普遍存在于生物體內(nèi)的磷脂依賴的激酶家族。在細(xì)胞的信息傳遞和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中起到重要作用。蛋白激酶C參與多種激素、神經(jīng)遞質(zhì)及生長(zhǎng)因子調(diào)控過(guò)程。測(cè)定蛋白激酶C活性及純化該酶成為跨膜信息傳遞研究的重要技術(shù)。七、離體器官受體生物測(cè)定 使用某些離體器官進(jìn)行受體激動(dòng)劑、拮抗劑的生物檢定，是一項(xiàng)目前仍在廣泛應(yīng)用的經(jīng)典的藥理學(xué)方法?？梢詼y(cè)定藥物對(duì)受體的親和力，對(duì)特定亞型的選擇，能決定藥物是激動(dòng)劑還是拮抗劑，并能分析藥物與受體的構(gòu)效關(guān)系，反映的是藥物在器官水平上的作用，因此，與細(xì)胞或分子水平上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以互相印證，有其不可替代的意義。第四節(jié) 鈣研究方法與技術(shù)簡(jiǎn)介鈣是人體內(nèi)極其重要的金屬離子，廣泛存在于細(xì)胞和體液中。它在細(xì)胞活動(dòng)乃至生命過(guò)程和疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，已成為化學(xué)、生物學(xué)、基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)及其它許多科學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。一、細(xì)胞內(nèi)游離鈣研究方法與技術(shù)（一）鈣指示劑鈣指示劑是近十多年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)離子指示劑，也稱離子探針或染料，已成為觀察細(xì)胞內(nèi)游離離子濃度及其動(dòng)態(tài)變化和空間分布極有價(jià)值的工具。目前常用鈣指示劑根據(jù)其物理特性一般可分為兩類(lèi)1、鈣熒光指示劑：是指在一定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，鈣指示劑復(fù)合物可發(fā)出熒光。屬于此類(lèi)的指示劑有Fura-2 、Quin-2、Fiuo-3、 Indo-1等。2、光吸收指示劑：是指它們與鈣離子結(jié)合后，其吸收光譜峰值隨Ca2+指示劑復(fù)合物濃度的不同而變化，據(jù)此便可觀察細(xì)胞內(nèi)游離鈣的動(dòng)態(tài)變化并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。屬于此類(lèi)指示劑的有Purpurate diacetic acid (PDAA)、Antipyrylazo等。光吸收指示劑一般屬于低鈣親和力指示劑。（二）雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)測(cè)定方法應(yīng)用雙波長(zhǎng)熒光分光光度法不僅可以檢測(cè)細(xì)胞懸液，單層培養(yǎng)細(xì)胞及單個(gè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的變化，也可以測(cè)定細(xì)胞內(nèi)瞬間平均鈣濃度的變化及亞細(xì)胞水平鈣離子的梯度分布等。各種細(xì)胞測(cè)定方法差異在于標(biāo)本的制備過(guò)程，其余步驟基本相同?；痉椒橹苽錁?biāo)本的細(xì)胞懸液，加入熒光指示劑，用雙光束熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光。測(cè)定條件：激發(fā)光光柵5nm，發(fā)射光光柵10nm，以300-420nm掃描激發(fā)光譜，然后固定激發(fā)波長(zhǎng)在高峰波長(zhǎng)，觀察不同實(shí)驗(yàn)條件下熒光強(qiáng)度的變化，由公式計(jì)算游離鈣濃度。二、鈣結(jié)合蛋白的研究方法鈣結(jié)合蛋白的研究方法包括鈣調(diào)素的純化及測(cè)定、鈣調(diào)素的表達(dá)與突變的研究方法、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白檢測(cè)方法及鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白的研究方法。三、細(xì)胞內(nèi)鈣釋放研究方法1、放射性標(biāo)記法測(cè)定鈣釋放：將分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體囊胞用放射性標(biāo)記的鈣離子負(fù)載，負(fù)載后的囊胞置于一濾器上，通過(guò)過(guò)濾與負(fù)載液分離。在濾器中加入各種促鈣釋放介質(zhì)后，定時(shí)測(cè)定濾器中殘留的放射活性即可推斷內(nèi)鈣釋放情況。2、三磷酸肌醇刺激內(nèi)鈣釋放的研究方法制備細(xì)胞或細(xì)胞器懸液，加入鈣離子熒光指示劑負(fù)載，再加入一定濃度的三磷酸肌醇（IP3）刺激內(nèi)鈣釋放，觀察熒光強(qiáng)度的變化即可反應(yīng)鈣釋放情況。四、鈣離子受體測(cè)定方法從?；蛉思谞钆韵偌?xì)胞的cDNA文庫(kù)中篩選出編碼鈣離子受體的cDNA，將其mRNA注入爪蟾卵細(xì)胞，使其表達(dá)，在細(xì)胞膜上形成具有天然活性的鈣離子受體。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中存在一定濃度的鈣或其它陽(yáng)離子時(shí)，激活鈣受體，使胞內(nèi)鈣離子濃度增加，打開(kāi)氯離子通道，測(cè)定氯離子通道電流的變化，便可用于篩選鈣離子受體激動(dòng)劑或拮抗劑。第五節(jié) 放射配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)一、基本概念1、受體（ receptor） 一類(lèi)介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能蛋白質(zhì)，可與周?chē)h(huán)境中微量化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，通過(guò)信息放大系統(tǒng)，觸發(fā)后續(xù)的生理或藥理效應(yīng)。2、配體（ligand） 能與受體特異結(jié)合的物質(zhì)，如神經(jīng)遞質(zhì)、藥物或激素等。3、判斷受體的標(biāo)準(zhǔn) 真正的受體必須具備：飽和性、特異性、可逆性、高親和性、結(jié)構(gòu)專一性、立體選擇性、區(qū)域分布性、亞細(xì)胞或分子特征、有內(nèi)源性配體等。4、受體的基本分類(lèi) 化學(xué)門(mén)控離子通道受體； G蛋白耦聯(lián)受體。5、受體調(diào)節(jié)的方式 1）共價(jià)調(diào)節(jié)（covalent modification） 尤其是蛋白磷酸化反應(yīng)在受體的脫敏過(guò)程中起了非常重要的調(diào)節(jié)作用。以乙酰膽堿受體為例，細(xì)胞內(nèi)cAMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰膽堿受體對(duì)乙酰膽堿的脫敏速度增加810倍。2）非共價(jià)調(diào)節(jié)（non-covalent modification）影響受體功能的非共價(jià)調(diào)節(jié)機(jī)制包括膜電位的變化；機(jī)械性改變受體的分布（斑片鉗技術(shù)）；受體和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配體（陰離子，陽(yáng)離子，核苷酸）之間的變構(gòu)影響；膜脂質(zhì)環(huán)境的改變等。3）協(xié)同性調(diào)節(jié)（coordinate regulation）已知不同受體可含有同源受體區(qū)如胰島素受體和上皮生長(zhǎng)因子-抗?jié)兯厥荏w中的酪氨酸激酶區(qū)。由此可推測(cè)一種受體被激活后可能通過(guò)一共同密碼（code）來(lái)調(diào)節(jié)同一細(xì)胞上的其他許多受體。4）鏈鎖反應(yīng)（receptor cascades） 另外一種可能的調(diào)控機(jī)制，即一個(gè)受體被激活之后，可能會(huì)釋放一種細(xì)胞外信使，激活第二個(gè)細(xì)胞表面受體。稱之為放大性的鏈鎖反應(yīng)。二、放射配體結(jié)合法的應(yīng)用領(lǐng)域1、闡明藥物作用機(jī)制；2、新藥設(shè)計(jì)和藥物篩選；3、探討疾病的病因、發(fā)病機(jī)理，提高臨床合理用藥和診斷水平；4、測(cè)定組織或血液中藥物濃度；5、探尋新的受體、受體亞型和內(nèi)源性配體。三、放射受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介1、放射配體的選擇 需要非常高的選擇性，并要求與靶受體有很高的親和性，解離常數(shù)最好小于10nmol/L，還要考慮配體的生物學(xué)以及生物化學(xué)特征。拮抗劑性配體必須能阻斷激動(dòng)劑與靶受體結(jié)合引起的生物學(xué)效應(yīng)。放射性受體結(jié)合試驗(yàn)中，最常用的放射性同位素是氚，3H配體的主要優(yōu)點(diǎn)是氚化過(guò)程不影響配體的生物活性，使用較安全，其信號(hào)必須用閃爍技術(shù)加以放大。放射配體的另一個(gè)重要特性是特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合的比率，理想的配體應(yīng)有不少于99%的特異性結(jié)合。2、組織的選擇和制備 用于放射受體結(jié)合試驗(yàn)的理想的組織應(yīng)含有高密度的靶受體和低密度的與配體非特異結(jié)合的受體。用于放射受體結(jié)合試驗(yàn)的組織可取自腦、外周組織、天然表達(dá)或移植受體的細(xì)胞株等。3、緩沖液 最常用的緩沖液是50mmol/L，PH為7.4的Tris-Cl的緩沖液；重碳酸鹽、磷酸鹽和HEPES緩沖液亦可用于結(jié)合試驗(yàn)。 4、非特異性結(jié)合的測(cè)定 非特異性結(jié)合的測(cè)定原理是加入大量的對(duì)靶受體具有藥理活性的并可使受體飽和的非放射性配體。特異性結(jié)合量是指配體與靶受體結(jié)合量，可由總結(jié)合量中減去非特異性結(jié)合量求出。5、孵育條件 結(jié)合實(shí)驗(yàn)應(yīng)該用能產(chǎn)生最大特異結(jié)合和適宜的孵育條件。需要經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)才可摸索出最佳的測(cè)定條件。6、放射配體-受體復(fù)合體與游離放射配體的分離最常用的最有效的分離方法是過(guò)濾，結(jié)合試驗(yàn)中最常用的濾紙是玻璃纖維濾紙。通常用25ml冷緩沖液沖洗23次就足夠了。過(guò)濾完成后，濾紙置于盛有閃爍液的閃爍瓶中進(jìn)行液閃測(cè)定。當(dāng)放射配體解離較快時(shí)，可用離心的方法將放射配體-受體復(fù)合物從游離配體中分離出來(lái)。其它方法還有：凝膠過(guò)濾色譜法、凝膠過(guò)濾透析術(shù)、免疫沉淀法等。第六節(jié) 免疫藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)簡(jiǎn)介免疫藥理學(xué)是介于免疫學(xué)和藥理學(xué)間的邊緣學(xué)科，主要研究藥物對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)和免疫功能的作用及其機(jī)制，為某些疾病藥物治療提供理論基礎(chǔ)。免疫藥理學(xué)方法一般是采用體外的試管內(nèi)研究和體內(nèi)的整體研究相結(jié)合，體外試驗(yàn)研究可澄清藥物對(duì)免疫應(yīng)答某一特定環(huán)節(jié)如T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子等產(chǎn)生的具體影響，而整體研究則可探討藥物對(duì)抗原介導(dǎo)的的免疫應(yīng)答、正常的體液免疫及細(xì)胞免疫功能、同種異體移植排斥反應(yīng)、異常免疫應(yīng)答如超敏反應(yīng)和自身免疫病以及初次及再次免疫應(yīng)答等的影響。在未來(lái)免疫藥理學(xué)的研究領(lǐng)域中，基因工程、基因治療、細(xì)胞因子治療以及其它各種生物治療的研究和應(yīng)用將是研究的熱點(diǎn)和前沿區(qū)域。一、免疫細(xì)胞的分離與純化 體內(nèi)外的免疫藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究都需要從動(dòng)物或人的血液或淋巴組織中分離免疫細(xì)胞，獲得高純度的免疫細(xì)胞是進(jìn)行本研究的最基本的前提條件。外周血中白細(xì)胞的分離常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）分離多采用密度梯度離心法。從淋巴組織中分離淋巴細(xì)胞懸液-制備脾細(xì)胞懸液、淋巴結(jié)細(xì)胞懸液、胸腺細(xì)胞懸液。淋巴細(xì)胞的分離純化包括：分離PMNC中的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 常用方法有玻璃粘附法、磁鐵吸引法、羰基鐵乳膠分層液法、補(bǔ)體溶解法及葡聚糖凝膠過(guò)濾法等。T細(xì)胞、B細(xì)胞及T細(xì)胞亞群的分離純化 常用技術(shù)：E花結(jié)分離法、Percoll非連續(xù)性密度梯度離心分離法、洗淘法（panning）、補(bǔ)體細(xì)胞毒法、尼龍毛分離法、磁性激活細(xì)胞分離器（magnetic activated cell sorter，MACS）分離技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）。二、藥物對(duì)免疫系統(tǒng)功能影響的實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介1、對(duì)免疫細(xì)胞表面抗原分子的影響 對(duì)細(xì)胞表面的CD（cluster of differentiation，分化簇）抗原的檢測(cè)與分析可通過(guò)細(xì)胞毒法、葡萄菌體蛋白A法、免疫細(xì)胞化學(xué)法和免疫熒光染色分析法等，借助流式細(xì)胞儀進(jìn)行的免疫熒光染色分析法使該項(xiàng)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化、定量化和自動(dòng)化水平大大提高，體內(nèi)外藥理試驗(yàn)均可采用之。2、對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響 常用：3H-TdR摻入試驗(yàn)、固相抗CD3單克隆抗體誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的檢測(cè)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、抗原刺激的T細(xì)胞增殖反應(yīng)、預(yù)激淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的增殖反應(yīng)等。3、淋巴細(xì)胞功能的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 小鼠接觸性超敏反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)（graft-versus-host disease，GVHD）、遲發(fā)性超敏反應(yīng)（delayed-type hypersensitivity，DTH）、體內(nèi)檢測(cè)TH細(xì)胞活性。4、對(duì)B細(xì)胞影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn) 血清中IgG、IgA、IgM的測(cè)定（單向免疫擴(kuò)散法、散射比濁法）；抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（溶血空斑試驗(yàn)、溶血分光光度法）。5、對(duì)單核巨噬細(xì)胞功能的影響實(shí)驗(yàn) 巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、白色念珠菌3H葡萄糖摻入實(shí)驗(yàn)、單核巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)測(cè)定、單核因子測(cè)定等。6、對(duì)超敏反應(yīng)影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn) 總IgE水平測(cè)定：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫單擴(kuò)散法（radioactive single radial diffusion，RSRD）、免疫斑點(diǎn)法（dot immunobinding assay，DIBA）、反向被動(dòng)血凝法（reversed passive hemagllutination assay，RPHA）、紙片放射免疫吸附試驗(yàn)（paper radio immunosorbent test，PRIST）。特異性IgE抗體測(cè)定：ELISA、放射過(guò)敏原吸附試驗(yàn)（radioallergosorbent test，RAST）、P-K試驗(yàn)、被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、皮內(nèi)試驗(yàn)（intradermal test）。人外周血單個(gè)核細(xì)胞體外合成IgE的測(cè)定：微量固相放射免疫測(cè)定法（microtiter solid-phase radioimmunoassay，MSPRIA）和ELISA法。參與I型超敏反應(yīng)介質(zhì)的測(cè)定：相應(yīng)介質(zhì)試劑盒測(cè)定，如LTs試劑盒。動(dòng)物模型：如過(guò)敏性哮喘模型等。三、影響免疫功能的藥物藥效學(xué)研究原則根據(jù)藥物對(duì)免疫功能的影響進(jìn)行分類(lèi)，可分為免疫增強(qiáng)劑、免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑。1、免疫增強(qiáng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑的免疫藥理學(xué)研究免疫增強(qiáng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑可分為兩大類(lèi)：生物類(lèi)和化學(xué)合成化合物類(lèi)。生物制品類(lèi)包括菌苗、細(xì)菌的某些成分如脂多糖、真菌產(chǎn)物、免疫細(xì)胞的產(chǎn)物如細(xì)胞因子和免疫球蛋白、免疫細(xì)菌如LAK細(xì)胞、自然化合物及中草藥及其單體成分等?；瘜W(xué)合成化合物類(lèi)包括含硫化合物、多聚核苷酸等。這些藥物的藥理作用因用藥方案不同，如給藥途徑、用藥劑量和用藥時(shí)間等，會(huì)導(dǎo)致不同的藥效；另外，藥物本身的純度和藥物受試對(duì)象的種系、年齡、疾病類(lèi)型與程度及遺傳背景亦會(huì)對(duì)藥效產(chǎn)生一定的影響，因此，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)要全面考慮這些因素。臨床上免疫增強(qiáng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑主要用于原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫病、腫瘤及慢性微生物感染的治療，故選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型時(shí)，應(yīng)考慮采用免疫缺陷模型動(dòng)物、荷瘤動(dòng)物、自身免疫病模型及相應(yīng)病原體感染動(dòng)物模型。2、免疫抑制劑的免疫藥理學(xué)研究免疫抑制劑的篩選程序一般是先進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)多采用實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎和淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎的病理模型和新西蘭NZB小鼠。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮動(dòng)物的品系、對(duì)免疫應(yīng)答所影響的環(huán)節(jié)、治療指數(shù)、給藥途徑、最佳治療方案等。在免疫藥理學(xué)研究之后，還應(yīng)進(jìn)行基礎(chǔ)藥理學(xué)研究、藥物的急性和慢性毒性研究、藥物的動(dòng)力學(xué)研究等。第七節(jié) 腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)方法無(wú)外乎體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩種。從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳峡?，又可以分成抗癌作用和抗癌作用機(jī)制研究?jī)煞N。一、抗癌作用研究（一）體外實(shí)驗(yàn)法：用培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行。1、噻唑藍(lán)（MTT）法 在培養(yǎng)的活細(xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶可將黃色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的藍(lán)紫色的甲替，將甲替用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，利用酶標(biāo)儀（試驗(yàn)波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)450nm）測(cè)定光密度值，按照公式 實(shí)驗(yàn)組光密度值腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1 - ）100% 對(duì)照組光密度值計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。用系列濃度的藥物可制作腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的量效曲線。2、染料排斥法 本方法是根據(jù)活細(xì)胞具有排斥某些染料的功能，而死細(xì)胞因胞膜破壞而易于被染料著色的原理，在培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液中加入伊紅、臺(tái)盼藍(lán)、或苯胺黑等染料，在室溫下放置5分鐘后，在15分鐘用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。根據(jù)公式未染細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞率（%）= 100% 細(xì)胞總數(shù)3、生長(zhǎng)曲線法 本方法是根據(jù)腫瘤的Gompertzian生長(zhǎng)曲線而設(shè)計(jì)。培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在初期為指數(shù)增殖期，隨著細(xì)胞密度的增加，因代謝產(chǎn)物的積聚和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，增殖趨于減緩乃至停止，進(jìn)入所謂的平臺(tái)期。在培養(yǎng)后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后取細(xì)胞對(duì)數(shù)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作圖可獲細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1）將生長(zhǎng)曲線外延至Y軸可獲得截距No，用公式計(jì)算藥物對(duì)增殖細(xì)胞的殺傷力（No是對(duì)照組的的截距）2）用Nt代表接種后t小時(shí)的細(xì)胞數(shù)， 用公式TD = 0.301t / logNt - LogNo 計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增增時(shí)間（TD）的影響。3）取平臺(tái)期每毫升的細(xì)胞均數(shù)，比較細(xì)胞生長(zhǎng)的飽合密度（Ns）。4、集落形成法 本方法利用分裂6代以上的克隆原單細(xì)胞子細(xì)胞可形成集落成簇（每簇細(xì)胞數(shù)50）的能力，比較藥物對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。本方法有貼壁法和半固體培養(yǎng)法兩種。1）貼壁法 需要選用貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞， 按500細(xì)胞/ml的濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)基，用瑞氏-姬姆薩染色后，在20解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集落。2）半固體軟瓊脂培養(yǎng)法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，用含小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成1000細(xì)胞/ml的懸液；溶化5%的瓊脂液，并按1：9的比例與含小牛血清的新鮮培養(yǎng)液混合，倒入35mm培養(yǎng)皿（1ml/皿），室溫下待瓊脂凝固，取0.94ml的細(xì)胞懸液，加0.04ml的5%瓊脂, 加到已制備的瓊脂平皿中，室溫下凝固。移入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在16解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75m的細(xì)胞集落。以集落形成抑制百分率對(duì)對(duì)數(shù)劑量作圖，可得“S”型曲線，從曲線上求取半數(shù)抑制濃度IC50；以集落的存活分?jǐn)?shù)與劑量作圖，可獲得克隆原細(xì)胞存活曲線，方程為S=1-(1-e-D/Do)n，S為存活分?jǐn)?shù)， D 為劑量， Do為存活分?jǐn)?shù)每下降1/e時(shí)所需的藥物劑量， n為外推值。Do越小， 藥物的殺傷力越大，N越大殺死細(xì)胞的藥物劑量越大。5、硫化若丹明B法（SRB）法 硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉紅色，溶于水，可與生物大分子的堿性氨基酸結(jié)合，這種結(jié)合物在波長(zhǎng)515nm時(shí)的讀數(shù)與細(xì)胞表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可用于細(xì)胞的定量。測(cè)試的細(xì)胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室溫下靜置， 然后去除未結(jié)合的SRB， 用非緩沖tris堿液溶解結(jié)合的SRB，在自動(dòng)化分光光度平板讀數(shù)儀（515nm波長(zhǎng)）測(cè)定OD值?？筛鶕?jù)下述公式計(jì)算: T - T0 生長(zhǎng)率（%）= 100% C - T0C、T和To分別為對(duì)照組細(xì)胞，為給藥組細(xì)胞，另外的對(duì)照平板加藥時(shí)的細(xì)胞的OD值。 T - T0殺傷率(%) = 100% T T - T050%生長(zhǎng)抑制所需的藥物濃度(GI50) = 100% C - T0 T - T0殺死50%細(xì)胞所需的藥物濃度(LC50)= 100% T0(二) 在體試驗(yàn)法1、小鼠白血病L1210 系用甲基膽蒽誘發(fā)DBA/2小鼠而得。取接種于DBA/2小鼠第67天之腹水，制成細(xì)胞懸液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接種活細(xì)胞1105，觀察體重變化，計(jì)算平均存活時(shí)間T/C（T-治療組存活時(shí)間，C-對(duì)照組存活時(shí)間）。T/C大于125%，并可重復(fù)，認(rèn)為有抗癌活性，T/C大于150%，并可重復(fù)，認(rèn)為具有顯著活性。2、大鼠Walker-256瘤 本瘤細(xì)胞接種在皮下或肌肉成為實(shí)體瘤，接種于腹腔則成為腹水瘤。取Walker-256瘤體制成瘤細(xì)胞懸液，按106個(gè)細(xì)胞接種于大鼠大腿肌肉。計(jì)算瘤重和T/C。重復(fù)實(shí)驗(yàn)T/C42%，認(rèn)為有活性。3、Lewis 肺癌 是一個(gè)在C57BL/6小鼠上發(fā)現(xiàn)的自發(fā)性肺內(nèi)未分化的上皮樣癌。該癌細(xì)胞惡性程度高，皮下、肌肉接種對(duì)藥物的敏感性低，但可向肺轉(zhuǎn)移，靜脈接種可在肺形成瘤集落。方法是取接種于C57BL/6小鼠肌肉或腋窩皮下的1315天的Lewis肺癌，制成細(xì)胞懸液接種2106個(gè)細(xì)胞于BDF1小鼠皮下或腹腔內(nèi)，12天后處死動(dòng)物，作皮下接種者直接摘取腫瘤稱重，作腹腔接種者，將雙側(cè)后肢從髖關(guān)節(jié)處剪下，荷瘤肢重減去正常肢重即為瘤重。重復(fù)實(shí)驗(yàn)T/C42%為有活性。二、抗癌作用機(jī)制研究（一）藥物作用周期特異性研究進(jìn)行藥物作用細(xì)胞周期性實(shí)驗(yàn)必須首先制備同步化的細(xì)胞，常用的體外培養(yǎng)細(xì)胞同步化的方法有機(jī)械振蕩法、雙胸苷同步法、含羞草氨酸俘獲法和離心洗脫法。1、機(jī)械振蕩法 機(jī)械振蕩法分離同步化細(xì)胞是基于單層貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂期時(shí), 胞形變圓，松散地附在支持物上，利用搖晃或拍擊培養(yǎng)瓶可以剝離出這些細(xì)胞，利用此方法可以得到較純的M 期細(xì)胞。雙胸苷同步法的原理是先以高濃度的TdR處理細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的轉(zhuǎn)變，DNA復(fù)制受阻，S期細(xì)胞停滯在S 期，其它期細(xì)胞積聚在G1/S邊界；撤TdR，讓原處于S期的細(xì)胞完全越過(guò)S期，再給予TdR，讓越過(guò)S期的細(xì)胞進(jìn)入G1/S邊界，然后撤去TdR，讓細(xì)胞重新生長(zhǎng)，同時(shí)進(jìn)入S期。因此，本方法可以得到較純的S期細(xì)胞。2、含羞草氨酸俘獲法 含羞草氨酸可將細(xì)胞集結(jié)于G1/S邊界，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。在撤除含羞草氨酸后，細(xì)胞可同步進(jìn)入S 期。3、離心洗脫法 離心洗脫法的原理是進(jìn)入細(xì)胞周期的的體積呈線性增加。G1期細(xì)胞體積最小，離出口最近而被最先洗出。G2/M細(xì)胞體積最大離進(jìn)氣口最近而被后洗出。在上述同步化處理尚需配合以同步化程度的檢測(cè)，檢查的方法有兩種：流式細(xì)胞光度技術(shù)和放射性同位素技術(shù)。前者通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來(lái)定量細(xì)胞的DNA量； 后者則利用測(cè)定摻入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脫氧尿苷（BrdU）的量來(lái)獲知處于S 期的細(xì)胞量。（二）藥物抗微管作用 利用微管蛋白在37聚合，在冰浴上解聚的特點(diǎn)，測(cè)定微管蛋白或微管液的OD值，分別獲得S型的聚合曲線和倒S型的解聚曲線， 比較藥物對(duì)曲線的影響， 用下式計(jì)算抑制率。 實(shí)驗(yàn)組光密度值抑制率（%）=（1 - ）100% 對(duì)照組光密度值（三）藥物與DNA結(jié)合能力檢查 吸收光譜移動(dòng)法 原理是DNA與藥物形成復(fù)合物后吸收光譜發(fā)生改變，吸收峰產(chǎn)生位移，位移波長(zhǎng)隨DNA/ 藥物復(fù)合物的量增加而增加。利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，可觀察到這些改變。熒光光譜移動(dòng)法 原理是在激發(fā)光的激發(fā)下，DNA-藥物復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜發(fā)生改變，譜峰向短波方向移動(dòng)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)激發(fā)光譜說(shuō)發(fā)生改變。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可觀察到這些變化。（四）藥物造成的DNA損傷彗星（Comet）微凝膠單細(xì)胞電泳法 正常的DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)， 在pH12.0時(shí)則完全解鏈。DNA受損后鏈斷裂, 成為一個(gè)松散的結(jié)構(gòu), 在電場(chǎng)的作用下,松散的DNA離開(kāi)細(xì)胞核向正極移動(dòng), 形成彗星似的拖尾,變換不同pH緩沖液可檢測(cè)斷裂的是雙鏈還是單鏈。堿洗脫法 收集細(xì)胞于濾膜上，用細(xì)胞溶解液裂解細(xì)胞并洗去RNA和蛋白質(zhì)，暴露DNA，用洗脫液進(jìn)行洗脫，若DNA發(fā)生鏈斷裂，則易于經(jīng)濾膜洗出。（五）藥物對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是調(diào)節(jié)DNA空間結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化的關(guān)鍵性核酶，分成拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I可以造成DNA的單鏈斷裂，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II，可造成雙鏈斷裂，進(jìn)而干擾DNA的復(fù)制、重組和基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)的原理是用從腫瘤細(xì)胞核提取的拓?fù)洚悩?gòu)酶II處理PBR322DNA，后者是一種質(zhì)粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口狀和線性DNA三種形式，瓊脂糖電泳上顯示出三條帶，在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下超螺旋DNA解旋、斷裂，電泳時(shí)超螺旋帶減弱或消失，相應(yīng)的缺口環(huán)狀或線性DNA增加。如果藥物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶具有抑制作用，則可見(jiàn)超螺旋帶保留。此方法亦可改進(jìn)為觀察藥物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶功能的促進(jìn)和抑制作用。方法是選定不能使一定量DNA完全斷裂量的拓?fù)洚悩?gòu)酶處理PBR322DNA后電泳可見(jiàn)超螺旋帶，同時(shí)加入不同濃度的藥物，如果藥物抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶，則超螺旋帶增強(qiáng)，若藥物增強(qiáng)拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，則見(jiàn)螺旋帶減弱或消失。（六）藥物對(duì)細(xì)胞核酸代謝的影響 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素標(biāo)記前體物如3H-TdR，3H-UR可分別摻入到細(xì)胞DNA 和RNA中去， 用液閃法測(cè)定其同位素活性則可知細(xì)胞DNA和RNA 的合成情況。（七）藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，細(xì)胞凋亡時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞體縮小，染色質(zhì)濃縮成大小不等的塊狀，并裂解為小片段。DNA斷裂長(zhǎng)度為核小體核苷酸長(zhǎng)度(180200堿基對(duì))的整倍數(shù)，提取后普通的瓊脂糖電泳表現(xiàn)為特殊的云梯狀，凋亡小體形成。檢查細(xì)胞凋亡的方法有：1、熒光顯微鏡的形態(tài)學(xué)檢查 該方法是利用凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，DNA廣泛裂解的特征和熒光化合物可嵌入DNA分子或以靜電相互作用與DNA分子結(jié)合的原理，建立DNA的熒光探針。常用的方法是用Hoechst33342和PI聯(lián)合染色，然后在熒光顯微下用紫外光激發(fā)。凋亡的細(xì)胞對(duì)Hoechst33342具有高攝取比，加之染色質(zhì)的高度濃縮，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光；正常細(xì)胞呈微弱熒光，壞死細(xì)胞則呈紅色熒光（被PI染色）。2、流式細(xì)胞光度術(shù) 該方法的原理是用DNA結(jié)合性的熒光染料標(biāo)記DNA， 因?yàn)榧?xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解、斷裂DNA，斷裂生成的小分子量DNA溢出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)DNA總量降低，利用流式細(xì)胞光度術(shù)可以檢測(cè)出DNA的這種結(jié)構(gòu)和量的變化。3、瓊脂糖電泳分析法 利用該方法可檢測(cè)出呈云梯狀的寡聚核小體。第八節(jié) 心腦血管藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)簡(jiǎn)介 心腦血管藥物實(shí)驗(yàn)方法很多，擇其要者簡(jiǎn)介如下：一、血壓測(cè)定及相關(guān)模型血壓測(cè)定法大體分為直接和間接測(cè)壓法。直接測(cè)壓可選用頸動(dòng)脈或股動(dòng)脈插管，通過(guò)壓力換能器記錄血壓變化，一般用麻醉動(dòng)物作急性實(shí)驗(yàn)。常用的間接測(cè)壓法主要有大鼠尾容積測(cè)壓及尾動(dòng)脈脈搏測(cè)壓法。實(shí)驗(yàn)性高血壓模型有：1、腎血管性高血壓模型（腎動(dòng)脈狹窄性高血壓模型），分為2腎1夾型（兩側(cè)腎完整，一側(cè)腎動(dòng)脈狹窄）、1腎1夾型（一側(cè)腎切除，另一側(cè)腎動(dòng)脈狹窄）和2腎2夾型（兩側(cè)腎完整，兩側(cè)腎動(dòng)脈狹窄），常用動(dòng)物是狗和大鼠。2、內(nèi)分泌性高血壓模型 常用大鼠，包括DOC鹽性高血壓模型、腎上腺再生性高血壓模型。3、神經(jīng)原性高血壓模型。4、遺傳性高血壓模型， 根據(jù)采用的遺傳學(xué)方法進(jìn)行分類(lèi)：選擇性近親繁殖高血壓模型（如自發(fā)性高血壓大鼠SHR、Dahl鹽敏感大鼠DS、米蘭種高血壓大鼠 MHS、遺傳性高血壓大鼠 GH、以色列種高血壓大鼠 SBH、里昂種高血壓大鼠 LH）基因工程高血壓模型 高血壓轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animals of hypertension）、高血壓基因敲除動(dòng)物（geneknockout animals of hypertension）。研究降壓藥作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)方法包括:中樞降壓(毀髓貓或大鼠模型、減弱神經(jīng)反射性調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)等)；外周降壓（神經(jīng)節(jié)阻斷、對(duì)傳出神經(jīng)遞質(zhì)及受體的影響、對(duì)在體血管阻力或離體血管平滑肌作用實(shí)驗(yàn)等）。二、心臟與血管實(shí)驗(yàn)法簡(jiǎn)介 心臟實(shí)驗(yàn)可用在位心臟和離體心臟進(jìn)行。離體心臟實(shí)驗(yàn)最常用的方法是Straub法、八木-Hartung法與Langendorff法。前兩種方法主要觀察藥物直接對(duì)心臟收縮力、傳導(dǎo)與心輸出量的影響，適用于兩棲類(lèi)動(dòng)物如青蛙、蟾蜍等離體心臟；后者適用于哺乳類(lèi)動(dòng)物兔、豚鼠、大鼠等，不僅可觀察藥物對(duì)心肌的直接作用，還可觀察藥物對(duì)冠脈流量的影響。本法雖然排除了神經(jīng)體液的調(diào)控作用，但不能同時(shí)控制前、后負(fù)荷和心率，故又建立了離體工作心臟實(shí)驗(yàn)法。在位心臟實(shí)驗(yàn)法有Blbring法、家兔不破壞胸膜記錄心收縮力法、狗心肺裝置實(shí)驗(yàn)法等。 冠脈血管及冠脈血流量實(shí)驗(yàn)法 離體實(shí)驗(yàn)主要有冠狀動(dòng)脈條實(shí)驗(yàn)、Langendorff離體心臟測(cè)定冠脈灌流量法；在位心臟測(cè)定冠脈血流量及心肌耗氧量、測(cè)定區(qū)域性心肌血流量、86Rb測(cè)定心肌營(yíng)養(yǎng)血流量法。 心血管藥理實(shí)驗(yàn)方法中的技術(shù)手段還有：清醒大鼠心功能及血流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物心電圖、心導(dǎo)管技術(shù)等。三、抗心肌缺血與再灌注損傷藥物實(shí)驗(yàn)法簡(jiǎn)介首先介紹心肌缺血與再灌注損傷模型的制備：整體動(dòng)物結(jié)扎冠脈后再灌注模型（常用犬、兔、大鼠進(jìn)行）；離體心臟缺氧造成全心缺氧和其后的在給氧損傷，亦可結(jié)扎離體心臟的冠脈，然后松結(jié)產(chǎn)生局部心肌再灌注損傷；體外心肌培養(yǎng)缺糖缺氧與再給糖給氧產(chǎn)生再灌注損傷。心肌缺血與梗塞范圍測(cè)定：組織學(xué)檢查；NBT