子學(xué)習(xí)情境氫化可的松發(fā)酵.ppt

子學(xué)習(xí)情境2.2 氫化可的松發(fā)酵,發(fā) 酵 制 藥,任務(wù)一 甾類藥物,激素：是由內(nèi)分泌腺體及具有內(nèi)分泌機(jī)能的細(xì)胞或組織所分泌的物質(zhì)（甲狀腺、腎上腺、卵巢、睪丸、胰腺等），是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)部自然生成和存在的。,甾類激素藥物的分類： 1、腎上腺皮質(zhì)激素 2、性激素與促性腺激素 3、蛋白同化激素,一、腎上腺皮質(zhì)激素,腎上腺皮質(zhì)分泌多種激素。 根據(jù)生理功能，腎上腺皮質(zhì)激素 (簡(jiǎn)稱為皮質(zhì)激素)被分為三類: 1、糖皮質(zhì)激素類 2、鹽皮質(zhì)激素類 3、氮皮質(zhì)素類,1、糖皮質(zhì)激素類。 為腎上腺皮質(zhì)的束狀帶細(xì)胞合成、分泌。 （1）在生理水平對(duì)糖代謝的作用強(qiáng)，對(duì)鈉、鉀等礦物質(zhì)代謝的作用較弱。 （2）在藥理治療劑量下，表現(xiàn)出良好的抗炎、抗過(guò)敏、抗毒素、抗休克等作用。,2、鹽皮質(zhì)素類。 為腎上腺皮質(zhì)的球狀帶細(xì)胞分泌。 在生理水平對(duì)礦物質(zhì)代謝，特別是對(duì)鈉潴留和鉀排泄的作用很強(qiáng)。 在藥理治療劑量下，僅用作腎上腺皮質(zhì)功能不全的替代療法，在獸醫(yī)臨床上實(shí)用價(jià)值不大。 3、氮皮質(zhì)素類。 由腎上腺皮質(zhì)的網(wǎng)狀帶分泌，包括雄激素和雌激素。,二、性激素,性激素重要生理功能： 刺激副性器官的發(fā)育和成熟，激發(fā)副性特征的出現(xiàn)，增進(jìn)兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合和孕育能力，還有調(diào)節(jié)代謝的作用。 分類：（按其生理功能可分為） 雄性激素 雌性激素,雄性激素： 雄性激素屬于C19類固醇，主要由睪丸和腎上腺皮質(zhì)所產(chǎn)生，卵巢也有少量合成。睪丸分泌的雄激素主要有3種：睪酮、脫氫異雄酮和雄烯二酮。,雌性激素： 包括雌激素和孕激素兩類，主要由卵巢合成和分泌，腎上腺皮質(zhì)和睪丸也能少量合成。雌激素，真正由腺體分泌，有活性的只有3種：17-雌二醇、雌酮和雌三醇。三種激素生理活性相差很大，其相對(duì)比活為100 : 10 : 3。孕激素屬于C21類固醇，體內(nèi)真正存在的是孕酮。,三、蛋白同化激素,蛋白同化激素是一類從睪丸酮衍生物中分化出來(lái)的藥物。 特點(diǎn)是性激素的作用大為減弱，蛋白質(zhì)同化作用仍然保留甚至增強(qiáng)，臨床使用比較安全，較少引起男性化癥狀等不良反應(yīng)。如17-甲基去氫睪丸素（17-methyldehydro-testosterone，商品名為大力補(bǔ)）。,蛋白同化激素主要作用： 促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制蛋白質(zhì)異化； 加速骨組織鈣化和生長(zhǎng)； 刺激骨髓造血功能，增加紅血球量； 促進(jìn)組織新生和肉芽形成； 降低血膽甾醇。,三、甾體藥物的來(lái)源,1、化學(xué)合成（早期）：成本高，收率低 2、微生物轉(zhuǎn)：收率提高，省去這多步化學(xué)反應(yīng) 3、天然提取,微生物轉(zhuǎn)化工藝的特點(diǎn), 可減少化學(xué)合成步驟，簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程，縮短生產(chǎn)路線。 如由黃體酮生產(chǎn)炔諾酮，利用微生物轉(zhuǎn)化，可以減少6步工序。, 能提高產(chǎn)物的收率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。不同的菌種都會(huì)影響到產(chǎn)品的收率和成本，菌種越優(yōu)良，反應(yīng)越向有利的方向進(jìn)行。采用生物轉(zhuǎn)化，減少了生產(chǎn)步驟，從而也降低了過(guò)程損失。 如19-羥基-4-雄烯-3，17-二酮轉(zhuǎn)化為雌酮 采用化學(xué)法合成需要3步才能完成，產(chǎn)品得率只有15%20%， 采用微生物轉(zhuǎn)化法，得率可達(dá)到80%以上。,化學(xué)合成過(guò)程中的化學(xué)物質(zhì)常對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量也有影響如：生產(chǎn)去氫可的松和去氫化可的松，過(guò)程中要加入SeO2，在產(chǎn)品中常含有少量的Se有毒物質(zhì) 可進(jìn)行化學(xué)法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)。如甾類化合物C-11上的加氧（即羥化）等反應(yīng)，化學(xué)法難以實(shí)現(xiàn)，常采用微生物法處理。,微生物轉(zhuǎn)化可供選擇的酶的種類較多，為生產(chǎn)過(guò)程提供了可能。 微生物轉(zhuǎn)化避免和減少了強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或化學(xué)有毒物質(zhì)，改善了生產(chǎn)環(huán)境。 目前一般采用化學(xué)合成和微生物轉(zhuǎn)化兩種方法相結(jié)合的生產(chǎn)工藝。,任務(wù)二 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)原理,微生物對(duì)甾體所轉(zhuǎn)化部位：幾乎每個(gè)位置都能進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 甾體激素藥物合成比較重要的轉(zhuǎn)化反應(yīng)： 一、氧化反應(yīng) 二、還原反應(yīng) 三、水解反應(yīng)等,一、羥化反應(yīng),甾體上羥化對(duì)化學(xué)合成而言是非常困難的，除了C17位上通過(guò)化學(xué)方法能導(dǎo)入羥基外，其它位置很難導(dǎo)入。 通過(guò)微生物羥化酶能非常專一地選擇某個(gè)碳位置上將某空間位置上的氫取代氧化成原來(lái)空間構(gòu)型的羥基。,1C9羥化 C9羥化在甾體藥物合成中是一個(gè)關(guān)鍵中間步驟，涉及到甾體邊鏈的選擇性降解，并且是皮質(zhì)激素合成中一個(gè)關(guān)鍵中間體。由于C9位上導(dǎo)入羥基后，容易在C9C10之間引入雙鍵，然后進(jìn)一步形成C11羥基或?qū)敕印?甾體合成中重要中間體9-羥基-4-雄甾烯-3，17雙酮。,9-羥基-3氧化娠烷-4，17雙烯-20羧酸的制取,C11羥化,微生物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)甾體C11羥化，不僅解決藥物合成，更重要意義是增加皮質(zhì)激素類化合物活力，使其具有高度抑制炎癥效應(yīng)。 C11位羥化為通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化來(lái)尋找更有效新藥開(kāi)創(chuàng)了新途徑。,如孕酮的轉(zhuǎn)化中，利用黑根霉在溫度不超過(guò)320C時(shí)成功地實(shí)現(xiàn)了C11羥基化反應(yīng)。,新月彎孢霉（Curvularoa lunata）能將Reichstein S化合物（簡(jiǎn)稱化合物S，Compound S）一步轉(zhuǎn)化成氫化可的松,二、環(huán)氧化反應(yīng),用微生物轉(zhuǎn)化法在甾體母核上引入環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)與微生物羥基化有關(guān)。 能產(chǎn)生11-羥基化的新月彎孢霉或布氏小克漢銀霉都可將17，21-二羥基-4，9（11）-孕甾二烯-3，20-二酮轉(zhuǎn)化成9，11環(huán)氧化合物。,三、脫氫反應(yīng),當(dāng)抗炎甾體激素等藥物的母核C1，C2位置導(dǎo)入雙鍵后，其抗炎作用會(huì)成倍增加。 醋酸可的松C1，C2位上導(dǎo)入雙鍵成醋酸脫氫可的松后抗炎作用增強(qiáng)34倍。,R1 = 9F或H； R2 = H，6CH3，6F； R3 = H，16CH3，16OH，16OH,化學(xué)法脫C1，C2氫是采用二氧化硒法，由于硒在生產(chǎn)中難以除盡會(huì)使產(chǎn)品中帶有少量對(duì)人體有害的物質(zhì) 采用微生物轉(zhuǎn)化脫氫是甾體抗炎激素藥物合成中不可缺少的一步 微生物對(duì)甾體羥化與脫氫能力是相反的，細(xì)菌的脫氫能力比真菌大，特別是棒狀桿菌和分枝桿菌活力最大。,四、甾核及邊鏈的選擇性降解機(jī)理,具有生理活性甾體類藥物的基本母核目前都是從高等動(dòng)植物中獲得 首先必須有選擇性地對(duì)其邊鏈進(jìn)行降解?；瘜W(xué)法選擇性差，產(chǎn)率低。目前，多采用微生物轉(zhuǎn)化法。,甾體藥物的天然資源,薯蕷皂苷元（約占60%） 是豆甾醇（約占15%） 膽甾醇 -谷甾醇,甾核邊鏈的選擇性降解的應(yīng)用,工業(yè)上通過(guò)生物技術(shù)來(lái)控制微生物選擇性地降解甾體邊鏈以獲得： 雄甾-4-烯-3，17-雙酮，簡(jiǎn)稱4AD； 1，4-二烯-雄甾-3，17雙酮，簡(jiǎn)稱ADD； 3-氧聯(lián)降膽甾-1，4-二烯-22-酸，簡(jiǎn)稱BDA等。,生物技術(shù)控制途徑, 通過(guò)底物-甾體結(jié)構(gòu)的修飾； 在微生物降解過(guò)程中加酶抑制劑； 通過(guò)誘變技術(shù)獲得生化阻斷突變菌株。,任務(wù)三 甾體激素 的生產(chǎn)工藝過(guò)程,甾體的微生物轉(zhuǎn)化和一般的氨基酸、抗生素的生產(chǎn)不同 發(fā)酵的產(chǎn)物不是目的產(chǎn)物，而只是利用微生物的酶對(duì)甾體底物的某一部位進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)來(lái)獲得一定的產(chǎn)物。,生產(chǎn)過(guò)程,微生物生長(zhǎng)和甾體的轉(zhuǎn)化完全可以分開(kāi)： 一般先進(jìn)行菌的培養(yǎng)，在菌生長(zhǎng)過(guò)程中累積甾體轉(zhuǎn)化所需要的酶 然后利用這些酶來(lái)改造分子的某一部位。,一、甾體的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程,甾體微生物轉(zhuǎn)化的兩個(gè)階段,第一階段：微生物生長(zhǎng)階段 第二階段：底物轉(zhuǎn)化階段,第一階段：微生物生長(zhǎng)階段,它是將菌種接入斜面培養(yǎng)基或小米培養(yǎng)基培養(yǎng)35d將成熟的菌種細(xì)胞或孢子接入搖瓶或種子罐，給予合適的溫度、溶氧濃度、pH值等條件培養(yǎng)，使其充分繁殖與生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短隨菌種和環(huán)境而異，細(xì)菌的生長(zhǎng)期1224h，真菌為2472h。,第二階段：底物轉(zhuǎn)化階段,一般是在微生物生長(zhǎng)的終點(diǎn)，逐漸將甾體的粉末或適當(dāng)?shù)模ㄓ袡C(jī)）溶液加到培養(yǎng)物中，或把成熟細(xì)胞分離洗滌，然后懸浮于水或緩沖液中，再將底物加入。,說(shuō)明： 大多數(shù)甾體化合物難溶于水，所以常用的方法是先把底物溶于有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺（飽和溶解度達(dá)10%20%），濃度在2%對(duì)微生物無(wú)毒性。,微生物轉(zhuǎn)化 生產(chǎn)甾體藥物的工藝,一般采用二級(jí)培養(yǎng) 工藝流程如下：,二、甾體微生物轉(zhuǎn)化方式,1、由生長(zhǎng)菌體培養(yǎng)物進(jìn)行的反應(yīng)是在培養(yǎng)菌體的適當(dāng)時(shí)間（中期或后期），添加基質(zhì)，一邊繼續(xù)培養(yǎng)，一邊進(jìn)行反應(yīng)。 2、由靜態(tài)菌體懸液進(jìn)行的反應(yīng)是在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，使菌體充分生長(zhǎng)發(fā)育后，用過(guò)濾或離心法進(jìn)行分離，將收集到的菌體懸浮在水或適當(dāng)?shù)木彌_液中，再將甾類化合物加入進(jìn)去，使其反應(yīng)。,3、混合培養(yǎng)進(jìn)行反應(yīng)是將具有1，2脫氫能力和11-羥化能力的微生物并用進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 （如果兩種微生物單獨(dú)培養(yǎng)，則必須將各過(guò)程中的抽提產(chǎn)物轉(zhuǎn)送到下面的工序，人力物力消耗較大。如采用混合培養(yǎng)法，則可省略抽提操作。）,三、影響轉(zhuǎn)化的一般因素,生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵： 選擇專屬性高的微生物 控制適宜的發(fā)酵條件,適宜的發(fā)酵條件主要包括,（1）攪拌 攪拌可增加傳質(zhì)和傳熱，可以增加培養(yǎng)基的氧氣供給，使氧氣均勻分散而提高轉(zhuǎn)化率。 （2）通氣 可直接增加氧氣的供給。有研究表明，溶解氧量對(duì)誘導(dǎo)酶產(chǎn)生非常重要。 （3）前體半連續(xù)的加入 可以降低由于一次大量加入所引起的毒性，也可減少由于發(fā)泡所引起前體的損失。,（4）培養(yǎng)基組成 氮源規(guī)格影響不太大，水解蛋白比蛋白胨好；糖類和脂肪對(duì)11羥化有影響；有些酶反應(yīng)需要金屬離子，例如缺鋅不能進(jìn)行6-羥化，而有些金屬離子使酶失活。,（5）溫度：微生物的培養(yǎng)都有適宜的溫度，若溫度太低，微生物生長(zhǎng)不良，不能產(chǎn)生足夠的酶；若溫度過(guò)高，又會(huì)因酶蛋白變性而使轉(zhuǎn)化反應(yīng)受阻。,四、產(chǎn)物的分析與分離方法,產(chǎn)物的分析與分離均需要用適當(dāng)?shù)呐c水不混溶的溶劑將甾體從培養(yǎng)基中提取出來(lái)，最常用的如：氯仿、二氯乙烷、醋酸乙酯和甲基異丁基酮等。 溶劑的用量需根據(jù)產(chǎn)物在培養(yǎng)基和溶劑中的分配系數(shù)而定，提取時(shí)要防止乳化。產(chǎn)物的提取液經(jīng)適當(dāng)?shù)臐饪s，用柱層析或直接用分步結(jié)晶的辦法可以得到產(chǎn)物。,五、氫化可的松的制備,氫化可的松（Hydrocortisone）又稱為皮質(zhì)醇，化學(xué)名稱為11，17，21-三羥基孕甾-4-烯-1，20-二酮。其結(jié)構(gòu)式為,氫化可的松的性狀,為白色或幾乎白色的結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，初無(wú)味，隨后有持續(xù)的苦味，遇光逐漸變質(zhì)，略溶于乙醇或丙酮，微溶于氯仿，在乙醚中幾乎不溶，不溶于水。熔點(diǎn)為212222比旋光度為+1621690（1%乙醇）。,氫化可的松的工業(yè)生產(chǎn),甾體藥物的合成基本上是用半合成方法合成的，僅有及少數(shù)用全合成制備（如甲基炔諾酮）， 原因是全合成的工藝路線過(guò)長(zhǎng)（如可的松需三十余步反應(yīng)），反應(yīng)特殊，工藝過(guò)程過(guò)于繁雜；總收率低，無(wú)工業(yè)生產(chǎn)的價(jià)值。,目前國(guó)內(nèi)外大都采用半合成的工藝路線，即從天然藥物中取得含有甾體基本骨架的化合物為原料通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制取甾體藥物。 氫化可的松采用半合成法生產(chǎn)。 七步合成制得醋酸化合物S，然后經(jīng)生物轉(zhuǎn)化制得氫化可的松。,1、反應(yīng)原理,生物氧化與水解,這一步反應(yīng)是利用梨頭霉菌，引入11-羥基。在產(chǎn)物中，除了氫化可的松（簡(jiǎn)稱體）（）外，還產(chǎn)生11-羥基化合物即表氫可的松（又稱為體）（）、少量的其它位置的羥基化合物和未轉(zhuǎn)化的化合物S（）。所以在產(chǎn)品的分離純化時(shí)，以上各種物質(zhì)必須分離出去。,工藝流程圖,2、工藝過(guò)程,種子培養(yǎng)：將梨頭霉菌接種到土豆斜面培養(yǎng)基，28培養(yǎng)79d，成熟孢子用無(wú)菌生理鹽水制成孢子懸液后。 種子培養(yǎng)的條件：培養(yǎng)基為葡萄糖、玉米漿、硫酸銨等配制，pH為5.86.3，接入孢子懸液后，在通氣攪拌下28培養(yǎng)2832h。待培養(yǎng)液菌濃度達(dá)到35%以上，無(wú)雜菌污染，即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。,發(fā)酵：將玉米漿、酵母膏、硫酸銨、葡萄糖及水投入發(fā)酵罐中攪拌，用氫氧化鈉溶液調(diào)整物料pH值到5.76.3，加入0.03%豆油，滅菌溫度120，通入無(wú)菌空氣，降溫至2728，接入犁頭霉孢子懸浮液，維持罐壓0.6kg/cm2，控制排氣量，通氣攪拌發(fā)酵2832小時(shí)。用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值到5.56.0,投入底物氧化：發(fā)酵液體積0.15%的萊氏化合物S，氧化48小時(shí)后，取樣作比色試驗(yàn)檢查反應(yīng)終點(diǎn)。 提?。旱竭_(dá)終點(diǎn)后濾除菌絲，濾液用樹(shù)脂吸附，然后用乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮至適量，冷卻到010，過(guò)濾、干燥得到粗品，熔點(diǎn)195，收率46%左右 或用醋酸丁酯多次提取，合并提取液，減壓濃縮之適量，冷至010，過(guò)濾、干燥得粗品，熔點(diǎn)為195，收率為46%左右,由于生物氧化所用的菌種梨頭酶菌的專屬性不夠理想，成品中除氫化可的松（簡(jiǎn)稱體）外，還生產(chǎn)11-羥基化合物及表氫可的松（簡(jiǎn)稱體），以及少量其它位置的羥基化合物和未轉(zhuǎn)化的化合物S 所以在霉菌氧化反應(yīng)后，用醋酸丁酯提取到它的粗品中，就有以上各種副產(chǎn)物，必須分離提純。,分離原理：采用混合溶劑法進(jìn)行分離，利用它們?cè)诩状?氯乙烷混和溶劑中溶解度的不同（體溶解度較大，體較小）而達(dá)到分離目的。 分離方法：粗品中主要為體，并混有部分