專題2.2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)(安中).ppt

安縣中學(xué),一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?CO(NH2),脲酶,+ CO2,NH3,+ H2O,3、常見(jiàn)的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。,4、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,.設(shè)置對(duì)照,（一）篩選菌株,水生耐熱細(xì)菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高溫的Taq DNA聚合酶 美國(guó)微生物學(xué)科布魯克（T.Brock) 1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細(xì)菌,篩選菌株 1.自然界篩選：根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。 2.實(shí)驗(yàn)室篩選：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。 選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。目的是從眾多微生物中分離所需要的微生物。,土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,測(cè)定微生物數(shù)量的方法： 1、直接計(jì)數(shù)法：最常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)。 先將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)（血球計(jì)數(shù)板）。 根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。 優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、能觀察微生物的形態(tài)特征。 缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌和活菌；不適于運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌計(jì)數(shù) 難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌。 應(yīng)用：一般用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。,（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,注意事項(xiàng) 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。 涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。,說(shuō)明設(shè)置重復(fù)組的重要性。第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒(méi)有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說(shuō)服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問(wèn)題，涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來(lái)求平均值。這個(gè)實(shí)例啟示學(xué)生，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。,（三）設(shè)置對(duì)照,1、對(duì)照實(shí)驗(yàn)：指除了被測(cè)試條件以外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)，作用是比照實(shí)驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實(shí)是所測(cè)試條件引起的相應(yīng)結(jié)果。,2、對(duì)照實(shí)驗(yàn)的目的：排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個(gè)原因，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種方案是可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。,（小結(jié)）操作：設(shè)置重復(fù)組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力和準(zhǔn)確性。將待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)一系列的稀釋，然后選擇三個(gè)稀釋度的菌液均勻涂布在平板上，然后培養(yǎng)。 （注意）：為了結(jié)果接近真實(shí)值，可將同一稀釋度菌液涂布到3個(gè)或3個(gè)以上的平板上，經(jīng)培養(yǎng)，計(jì)算出菌落的平均數(shù)。 對(duì)照原則：判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染，將未接種的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。 判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用，對(duì)照培養(yǎng)基接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。 計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)=（C/V）*M,（1）原理：尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，只有當(dāng)土壤中 的 細(xì)菌將尿素分解成氨之后，才能 被植物利用。尿素細(xì)菌能合成脲酶，在脲酶的作用下尿素被分解成氨。 CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)方案、材料用具、實(shí)施步驟和時(shí)間安排等。 （3）實(shí)驗(yàn)流程： 土壤取樣 樣品系列稀釋 涂布平板與培養(yǎng) 觀察并記錄結(jié)果,菌落計(jì)數(shù),二.實(shí)驗(yàn)的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。 .制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板,三樣品的稀釋,為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。 結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,.取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,一無(wú)菌操作 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好標(biāo)記 注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。 三規(guī)劃時(shí)間,1、結(jié)合對(duì)照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。 2、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在30300的平板。在這稀釋度下，是否至少有兩個(gè)平板的菌落數(shù)相近？ 3、你統(tǒng)計(jì)的每克土壤中含有能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？,五.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。,測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過(guò)記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無(wú)金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征,（一）空氣中微生物總數(shù)的檢測(cè) （二）水中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè) （三）牛奶中細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) （四）土壤中真菌（或放線菌）的分離與計(jì)數(shù),1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接種一種細(xì)菌 C.接種一個(gè)細(xì)菌 D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,實(shí)踐訓(xùn)練,A,C,D,4.下列說(shuō)法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。 5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（ ） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B,C,例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時(shí)代的意義。 青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型是 ，青霉素是青霉菌的 代謝產(chǎn)物。 在生產(chǎn)和科研中，常選用處于 期的青霉菌作為菌種或研究材料，因?yàn)榇藭r(shí)的青霉菌代謝旺盛， 和 比較穩(wěn)定。 對(duì)青霉菌菌體生長(zhǎng)情況的測(cè)定：取一定體積的發(fā)酵液，經(jīng)離心分離、反復(fù)洗滌后， ，再計(jì)算發(fā)酵罐中菌體的總重量。,異養(yǎng)需氧型,次級(jí),對(duì)數(shù),個(gè)