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基于片斷的藥物設(shè)計(jì) Fragment-based drug discovery,郭宗儒 2009-10-16,From Leach AR, Hann MM, Burrows JN et al. Fragment screening: an introduction. Mol. BioSyst., 2006, 2: 429-446,對(duì)靶標(biāo)認(rèn)識(shí)水平不同的藥物分子設(shè)計(jì),苗頭和先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)途徑,天然活性物質(zhì) 基于結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì) 隨機(jī)篩選 虛擬篩選,問題的出現(xiàn),以靶標(biāo)為核心的新藥研發(fā)，切入點(diǎn)是用體外方法評(píng)價(jià)活性活性。 苗頭化合物(hit)多以活性強(qiáng)度為衡量標(biāo)準(zhǔn)。 hit-to-lead和先導(dǎo)物優(yōu)化，大都加入或變換基團(tuán)，以增加與靶標(biāo)結(jié)合的機(jī)會(huì)和強(qiáng)度。 一般“不敢”去除基團(tuán)或片斷，以免丟失參與結(jié)合的原子或基團(tuán)(即藥效團(tuán))。 高通量篩選的化合物過于“成熟”，留給后續(xù)的結(jié)構(gòu)變換的余地小，導(dǎo)致投入-產(chǎn)出比低。,高通量篩選的不足,發(fā)現(xiàn)苗頭的概率很低。理論計(jì)算，含有30個(gè)C、N、O、S原子的化合物有1060種，而高通量篩選的化合物數(shù)即使以百萬計(jì)(106)，篩選也只占很少部分。 化合物分子量比較大，親脂性強(qiáng)，優(yōu)化成藥的難度大。組合化學(xué)庫尤甚。 分子量160的含上述院子化合物數(shù)為107，篩選的分子為103104 個(gè)。發(fā)現(xiàn)苗頭的幾率高。 公司之間的化合物的結(jié)構(gòu)類型相似，篩選靶標(biāo)相同，易有知識(shí)產(chǎn)權(quán)之糾葛。,片 斷 及 其 特 征,片斷是比類藥分子小的化合物，分子量或非氫原子數(shù)低于類藥性化合物。 化學(xué)結(jié)構(gòu)比類藥分子簡(jiǎn)單。 片斷應(yīng)易溶于水，因需要高濃度試液方呈現(xiàn)與靶標(biāo)的結(jié)合信號(hào)。 結(jié)構(gòu)上有可以延伸的位置、原子或基團(tuán)。 沒有化學(xué)活潑的反應(yīng)基團(tuán)。,Congreve M et al. Drug Discov Today. 2003, 8: 876。,由苗頭物發(fā)展成先導(dǎo)物的性質(zhì)變化,參數(shù) 苗頭物均值 先導(dǎo)物均值 增量 分子量 174.1 382.8 207.7 氫鍵給體 1.7 1.7 0 氫鍵接受體 2.9 5.6 2.7 非氫原子數(shù) 12.8 28.5 15.7,增量大,由先導(dǎo)物發(fā)展成藥物的性質(zhì)變化,參數(shù) 先導(dǎo)物均值 成藥后均值 增量 分子量 272.0 314.0 42.0 氫鍵給體 0.8 0.8 0 氫鍵接受體 2.2 2.5 0.3 Clog P 1.9 2.4 0.5 非氫原子數(shù) 19 22 3,增量小,FBDD的背景1,Andrews分析了200個(gè)藥物和抑制劑的結(jié)合常數(shù)與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，得出了10 個(gè)常見功能基和原子對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)均值。,帶電荷的基團(tuán)與受體結(jié)合的貢獻(xiàn)強(qiáng)于極性基團(tuán)，極性基團(tuán)又強(qiáng)于非極性基團(tuán)。,Andrews P et al. Med. Chem.1984, 27, 1648,* kcal/mol,FBDD的背景2,Kuntz等分析了150個(gè)含有167個(gè)原子構(gòu)成的離子或化合物與受體的結(jié)合常數(shù)，按照下式計(jì)算了結(jié)合常數(shù)與系統(tǒng)自由能變化的關(guān)系，進(jìn)而推定出每個(gè)原子對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)。 G結(jié)合 = G復(fù)合物 G參比態(tài) = RTlnK 當(dāng)非氫原子數(shù)在15個(gè)以內(nèi)，結(jié)合能隨原子數(shù)的增加而線性增高，平均每個(gè)原子的貢獻(xiàn)為1.5 kcal/mol；超過15個(gè)原子后結(jié)合能的變化趨于不變，成為非線性變化，這種現(xiàn)象歸因?yàn)榉菬崃W(xué)因素。 Andrews和Kuntz的研究為配體效率概念奠定了基礎(chǔ)。,配體效率(ligand efficiency, LE),分子大小影響物化和藥代性質(zhì)。 減少苗頭、先導(dǎo)物中冗余原子的必要性。 配體效率是衡量苗頭物或先導(dǎo)物以及優(yōu)化的化合物的質(zhì)量的參數(shù)，表征化合物的活性效率。 系指配體(苗頭、先導(dǎo)物、優(yōu)化物等)中每個(gè)原子對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)，在選取先導(dǎo)物和優(yōu)化過程中是個(gè)有用的指標(biāo)。 計(jì)算方法：首先是將復(fù)合物結(jié)合常數(shù)Kd轉(zhuǎn)換為在溫度300K的結(jié)合的自由能(G) 。 G -RT.lnKd = 1.37 pKd G除以非氫原子數(shù)，得出每個(gè)原子的自由能貢獻(xiàn)即配體效率，用下式表示： LE = G/N非氫原子,配體親脂性效率,配體效率是將化合物的活性在分子大小的尺度上加以表征，是優(yōu)化過程中監(jiān)測(cè)化合物的活性、物化性質(zhì)和成藥性程度的一個(gè)指標(biāo)。 還可用配體-親脂性效率指數(shù)(ligand-lipophilicity efficiency, LLE)表征先導(dǎo)物和優(yōu)化的質(zhì)量。LLE 的定義是 pIC50 (或pKi) - cLogP (或 LogD) Congreve M et al. J Med Chem, 2008, 51: 3661,契 合 質(zhì) 量,在結(jié)構(gòu)優(yōu)化中，當(dāng)分子量的加大，即使活性增大，配體效率卻變化不大，甚至減小。以致不能反映和揭示優(yōu)化過程的實(shí)際狀態(tài)。 Reynolds等提出了配體的契合質(zhì)量的概念(fit quality, FQ)，以消除因分子量加大，LE的變化被掩飾和拉平的效應(yīng)。 計(jì)算方法是將化合物的非氫原子數(shù)歸一和標(biāo)度化，得到相應(yīng)的LE-Scale，分子中不同原子數(shù)，LE-Scale值不同，按如下定義： LE-Scale 0.064 + 0.873e(-0.026HA) 或?qū)缡秸归_：LE-Scale 0.0715 + (7.5382/HA) + (25.7079/HA2) + (361.4722/HA3) 配體的契合質(zhì)量FQ按照如下計(jì)算： FQ = LE/LE-Scale FQ將上述的非線性標(biāo)準(zhǔn)化，使配體之間的結(jié)合效率有可比性。 Bembenek SD et al. Drug Discov Today. 2009, 14: 278,當(dāng)非氫原子低于20時(shí)，最大親和力與原子數(shù)成線性關(guān)系；超過20后活性趨于不變或下降。,若以非氫原子數(shù)與配體效率作圖，原子數(shù)在1025的化合物配體效率呈線性變化。,契 合 質(zhì) 量,Reynolds CH, BMCL. 2007, 17: 4258,非氫原子數(shù) LE scale 相鄰差值 10 0.7204 11 0.6972 0.0232 12 0.6685 0.0287 13 0.6367 0.0318 14 0.6091 0.0276 15 0.5809 0.0282 16 0.5545 0.0264 17 0.5300 0.0245 18 0.5072 0.0228 19 0.4877 0.0195 20 0.4672 0.0205 21 0.4494 0.0178 22 0.4331 0.0167 23 0.4179 0.0152 24 0.4039 0.0149 25 0.3908 0.0131 26 0.3787 0.0121 27 0.3674 0.0113 28 0.3568 0.0106 29 0.3471 0.0097 30 0.3378 0.0093,片斷化合物庫,體外篩選評(píng)價(jià),達(dá)到規(guī)定活性,復(fù)合物單晶結(jié)構(gòu),是,否,計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì),藥物化學(xué)合成,確定先導(dǎo)物,達(dá)到規(guī)定活性,是,否,片斷化合物庫(約1000-2000個(gè)化合物) 體外活性篩選 結(jié)構(gòu)生物學(xué)：復(fù)合物X-線晶體學(xué)或 NMR或MS 計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)輔助 藥物設(shè)計(jì)和化學(xué)合成 活性評(píng)價(jià) 結(jié)構(gòu)生物學(xué)或分子對(duì)接 構(gòu)效分析 確定先導(dǎo)物,基于片斷的藥物設(shè)計(jì)：方法的整合性,片斷化合物舉例,片斷分子,受體結(jié)合部位,片斷連接,片斷分子分別篩選與組合庫比較,6 X 6片斷組合庫,FBDD需要有靈敏的檢測(cè)手段,NMR方法： Skinner AL, and Laurence JS. J Pharm Sci. 2008, 97: 4670 X-ray方法：Jhoti H et al. Curr Opin Chem Biol. 2007, 11: 48 SPR方法： Neumann T et al. Curr Top Med Chem.2007, 7: 1630 MS方法： Annis DA et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, 11: 51,0,100,200,300,400,500,600,700,1 mM,100 M 1M 10 nM 1 nM,藥物,HTS苗頭物,藥物候選物,片斷化合物,藥效強(qiáng)度,相對(duì)分子質(zhì)量,Rees et al., Nature Rev. Drug Disc. 2004,上市的口服藥物平均分子量為340。 處于 I 期臨床試驗(yàn)的候選藥物，分子 量小于400的成功率為50%，分子量加大，成功率降低。 Wenlock et al, J Med Chem 2003,配 體 效 率 (LE),Fragment Rule of 3 MW 300 # H-Bond Donor = 3 # H-Bond Acceptors = 3 cLogP = 3 # Rotatable bonds = 3,片斷只結(jié)合于受體的部分結(jié)合位點(diǎn),片斷演化成先導(dǎo)物的三種模式,片斷的生長(zhǎng) 片斷的連接 片斷的融合,與受體結(jié)合的相鄰的兩個(gè)片斷經(jīng)連接基連接成活性強(qiáng)的較大分子,與受體結(jié)合的相互交蓋或甚近的兩個(gè)片斷合并成活性強(qiáng)的較大分子,以受體結(jié)合的第一個(gè)片斷為核心，經(jīng)理性設(shè)計(jì)，在鄰近處逐漸生長(zhǎng)成活性強(qiáng)的較大分子,IC50(M) 80 12 3.0 0.51 0.20 0.031 0.018 No HA 10 15 15 20 23 21 24 LE(kcal/mol) 0.47 0.48 0.61 0.43 0.40 0.49 0.44 FQ 0.70 0.83 1.05 0.92 0.96 1.09 1.09 .,片斷生長(zhǎng)：蛋白激酶B(PKB)抑制劑先導(dǎo)物,優(yōu)化結(jié)構(gòu)要求化合物的配體效率保持在0.30 以上。 基于PKB與苗頭物的三維結(jié)合特征，發(fā)現(xiàn)在苯環(huán)對(duì)位的結(jié)合部位有負(fù)性基團(tuán)和較大的腔穴。 合成了含有堿性基團(tuán)的化合物，活性提高，雖分子量增大，仍保持了LE值。 加入新的苯環(huán)，仍維持了相同的配體效率。 最后在新的苯環(huán)上引入鹵素，得到高活性。,(Saxty G et al. J Med Chem 2007, 50: 2293),S-isomer, (0.28M),R-isomer, (31 nM),片斷生長(zhǎng): 周期蛋白依賴的激酶抑制劑,周期蛋白依賴的激酶(CDK)活性取決于周期蛋白的存在,其表達(dá)水平與細(xì)胞周期相關(guān)。抑制CDK可抑制腫瘤生長(zhǎng)。,兩個(gè)氫鍵和芳環(huán)疏水作用,MW=316 IC50=0.66M LE=0.38,MW=316 IC50=0.66M LE=0.38 LQ=0.85,Leu81羰基形成氫鍵, Ile10 and Leu134與苯環(huán)的疏水作用,MW=118 IC50=185M LE=0.57 LQ=0.76,MW=187 IC50=97M LE=0.39 FQ=0.64,另一思路是去除苯并環(huán),活性減弱, 但LE未降,MW=258 IC50=0.85M LE=0.44 FQ=0.90,簡(jiǎn)化后的吡唑4位可向外生長(zhǎng), 氫鍵給體有利于結(jié)合.活性明顯提高,LE大增,23,33,MW=337 IC50=0.14M LE=0.39 FQ=0.97,MW=373 IC50=0.003M LE=0.45 FQ=1.19,苯甲酰胺的活性略增, LE降低. 苯環(huán)離開羰基明面51, 說明不穩(wěn)定,苯環(huán)2,6位雙取代穩(wěn)定了構(gòu)象,活性提升, 但進(jìn)入細(xì)胞能力弱, ClogP過大,分子內(nèi)氫鍵所致,.,MW=395 IC50=0.047M LE=0.42 FQ=1.06,二氯取代, 對(duì)酶和細(xì)胞活性均明顯增高,MW=362 IC50=0.14M LE=0.31 FQ=0.79,AT7519 于10M 對(duì) P450 1A2, 2D6, 3A4, 2C9, 2C19的抑制作用30% 水溶性(HCl鹽)：25mg/ml 進(jìn)入臨床研究,苯環(huán)換成哌啶, 酶活水平性降低, 但對(duì)細(xì)胞作用增強(qiáng),Wyatt PG, Woodhead AJ, Berdini V et al. Identification of N-(4-Piperidinyl)-4-(2,6-dichlorobenzoylamino)-1H-pyrazole-3-carboxamide(AT7519), a Novel Cyclin Dependent Kinase Inhibitor Using Fragment-Based X-Ray Crystallography and Structure Based Drug Design. J Med Chem, 2008, 51, 49864999,Hajduk等研究紅霉素耐藥菌甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 ，用NMR方法篩選片斷分子，發(fā)現(xiàn)氨基均三嗪的Ki=1 mM，均三嗪骨架適于平行合成，將甲硫基替換成各種胺基，得到先導(dǎo)化合物，Ki = 8 M.,Hajduk PJ, Dinges J, Schkeryantz JM et al. Novel inhibitors of Erm methyltransferases from NMR and parallel synthesis. J. Med. Chem. 1999, 42, 3852-3859.,片斷生長(zhǎng) + 平行合成：甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,片斷生長(zhǎng)：極光激酶抑制劑,極光激酶(Aurora kinase)調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂起關(guān)鍵作用，是抗癌藥物的靶標(biāo)。 用蛋白浸泡技術(shù)發(fā)現(xiàn)吡唑基苯并咪唑可結(jié)合極光激酶A， X-線晶體學(xué)研究表明，該化合物結(jié)合于在激酶深部的ATP結(jié)合位點(diǎn)。 進(jìn)而發(fā)現(xiàn)苯甲酰氨基化合物活性增強(qiáng)，因?yàn)檎紦?jù)了一個(gè)疏水腔。 為了同時(shí)提高對(duì)于Aurora B的抑制作用，在苯并咪唑的5位引入嗎啉環(huán)，提高了對(duì)Aurora A和B的抑制活性。 該化合物的小鼠藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)為：Cl =43 (mL/min)/kg, F= 26%，而血漿蛋白結(jié)合率過高(99.5%)。為了全面優(yōu)化藥效和藥代性質(zhì)，分析該化合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)氟代苯基并未完全適配于結(jié)合腔內(nèi)，在不增加分子量和ClogP的原則下，保持分子骨架和藥效團(tuán)不變，將苯甲酰胺基變換成環(huán)丙脲基AT9283 ，藥效和藥代性質(zhì)均明顯優(yōu)化。,IC50(M) 0.091 0.070 0.010 0.003 LE 0.50 0.49 0.35 0.42 FQ 1.09 1.18 1.07 1.17,尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化抑制劑,尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPA)與其受體(uPAR)結(jié)合，可催化裂解纖維蛋白酶原的Arg/Val酰氨鍵生成纖維蛋白酶，后者負(fù)責(zé)許多蛋白的水解過程，降解胞內(nèi)基質(zhì)的多種成份，引發(fā)細(xì)胞的遷移，所以，uPA介導(dǎo)了許多病理過程如主動(dòng)脈瘤、多發(fā)性硬化癥和癌轉(zhuǎn)移等。 抑制uPA的作用可望治療這些疾病。篩選小分子弱堿性藥物美西律(mexiletine)對(duì)uPA的抑制作用IC501 mM，且只有R構(gòu)型與酶結(jié)合， 晶體衍射表明，伯氨基與Asp189的羧基、Ser190的羰基以及Gly219形成氫鍵，苯基與亞乙基與S1疏水強(qiáng)結(jié)合。美西律雖配體效率只有0.32，但水溶性很好，且口服生物利用度F=90%，pKa=9.2，堿性不象既有的uPA抑制劑過強(qiáng)，故是良好的起始物。 根據(jù)萘脒具有活性說明苯環(huán)的對(duì)位有空間，可引入酸性基團(tuán)，去掉側(cè)鏈甲基以消除手性原子，將2,6-二甲基換成二氯，IC5040 M，在晶體結(jié)構(gòu)的引導(dǎo)下，酰苯胺的 IC50=5.2 M，IC50=720 nM，最后經(jīng)SAR設(shè)計(jì)化合物活性提高10倍，IC50=72 nM。對(duì)大鼠具有良好藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，半衰期t1/2=7.5 h，F(xiàn) =60%,IC50 1 mM 40 M 5.2 M 720 nM LE 0.32 0.40 0.29 0.29 FQ 0.57 0.76 0.74 0.84,IC50 =72 nM LE = 0.32 FQ = 0.97,片斷連接：FKBP抑制劑,用核磁共振研究FKBP抑制劑，稱作SAR by NMR。用15N 標(biāo)記的FKBP篩選片斷庫的結(jié)合作用，觀察和確定酰胺鍵的15N- 和1H化學(xué)位移的變化。 篩選兩種分子1和2有弱結(jié)合作用。連接成3為強(qiáng)抑制劑。,1 2 3 Kd 2 M 100 M 49 nM 非氫原子數(shù) 26 17 45 LE(kcal/mol) 0.30 0.32 0.22 FQ 0.79 0.64 1.06,Shuker SB et al. Science, 1996, 274:1531,片斷連接：他克林形成攣藥,膽堿酯酶有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：深部窄口處的催化部位和暴露于水相的外部位點(diǎn)。 將適宜長(zhǎng)度的碳鏈連接他克林，提高了活性。,Ki=0.018M(小鼠) IC50=0.59M(大鼠腦) HA No=15 LE=0.57 FQ=0.98,IC50=0.0004M(大鼠腦) HA No=37 LE=0.35 FQ=1.25,Pang YP, Quiram P, Jelacic T et al. Highly potent, selective, and low cost bis-tetrahydroaminacrine inhibitors of acetylcholinesterase. Steps toward novel drugs for treating Alzheimers disease. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23646-23649.,3,Lewis WG, Green LG, Grynszpan, F et al.Click chemistry in situ: Acetylcholinesterase as a reaction vessel for the selective assembly of a femtomolar inhibitor from an array of building blocks. Angew. Chem., Int. Ed. 2002,