DB21T1749.3-2009黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程.doc

DB21/T 16782008遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2009-11-23實(shí)施2009-10-23發(fā)布黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程DB21/T 1749.32009DB21遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS備案號(hào)：1DB21/T 1749.32009前 言本標(biāo)準(zhǔn)附錄A、附錄B、附錄C、附錄D、附錄E為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省農(nóng)村經(jīng)濟(jì)委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省植物保護(hù)站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蔡 明、宋雅坤、吳元華、李明福、江 冬、李 眷、李維根。I黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）的檢驗(yàn)檢測(cè)與鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于全省各地開(kāi)展黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢驗(yàn)檢測(cè)工作。2 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。2.1檢驗(yàn) inspection對(duì)植物、植物產(chǎn)品或其他限定物進(jìn)行官方的直觀檢查以確定是否存在有害生物和/或是否符合植物檢疫法規(guī)。2.2 檢測(cè) detection為確定是否存在有害生物或?yàn)殍b定有害生物而進(jìn)行的除肉眼檢查以外的官方檢查。2.3 鑒定 identification對(duì)可疑的有害生物是否與已知物種同一的鑒別過(guò)程。2.4發(fā)生 happen官方報(bào)道在一個(gè)地區(qū)存在著土生或傳入的有害生物，和/或官方未報(bào)道在一個(gè)地區(qū)存在的有害生物已經(jīng)被根除。3 原理黃瓜綠斑駁花葉病毒屬煙草花葉病毒屬。其病原形態(tài)特征見(jiàn)附錄A，其寄主范圍、地理分布、生物學(xué)特性、危害癥狀和傳播途徑見(jiàn)附錄B，其血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法技術(shù)（ELISA）測(cè)定和分子生物學(xué)（PCR）測(cè)定，具體檢測(cè)方法見(jiàn)附錄C、附錄D。4 材料、儀器、用具及藥品4.1 材料葫蘆科作物種子、葉片和果實(shí)。4.2 儀器、用具電子顯微鏡、臺(tái)式離心機(jī)、分光光度計(jì)、RT-PCR儀、冰箱、酶聯(lián)板、酶聯(lián)讀數(shù)儀、微量加樣器、洗瓶、載玻片、玻棒、研缽、微量離心管、培養(yǎng)皿、打孔器、滴管、吸管、量筒、三角瓶、水浴鍋、毛細(xì)管、針頭、電泳儀、水平電泳槽、膠手套、剪刀、鑷子、自封袋、油性筆、標(biāo)簽、記錄本等。4.3 藥品 ?；钥贵w免疫球蛋白1gG(濃度約為1mg/mL)、酶標(biāo)記羊抗兔抗體球蛋白1gG(市售)、碳酸鈉(無(wú)水)、碳酸氫鈉、疊氮化鈉、磷酸氫二鈉(無(wú)水)、磷酸二氫鉀(無(wú)水)、氯化鈉、氯化鉀、Tween-20、雞蛋清粉、聚乙烯吡咯烷酮、亞硫酸鈉(無(wú)水)、牛血清白蛋白、二乙醇胺、氯化鎂等。5 現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)鑒定5.1 種子檢查在11月翌年2月份對(duì)市場(chǎng)銷售的葫蘆科作物種子和砧木種子進(jìn)行扦樣，每份樣品取100粒，送指定的有關(guān)部門進(jìn)行檢測(cè)。重點(diǎn)檢查用做砧木的種子。5.2 田間調(diào)查3月10月份在黃瓜綠斑駁花葉病毒的發(fā)生期，選擇有代表性地塊，檢查葉片、果梗、果實(shí)，看葉片上是否出現(xiàn)黃綠相間斑駁、隆起、皺縮、蕨葉，果梗是否有褐色條斑，果實(shí)表面是否有斑駁、凸起，果實(shí)內(nèi)部是否有空洞、黃絲、果肉暗紅倒瓤等。5.3 癥狀檢驗(yàn)從植株上摘取病葉或果實(shí)，與附錄B記述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的為害癥狀進(jìn)行比較，符合附錄B記述的黃瓜綠斑駁病毒為害癥狀的為疑似病株?；蛟谡{(diào)查現(xiàn)場(chǎng)將病葉取下，用快速診斷試紙條或診斷試劑盒（附錄E）進(jìn)行初步診斷。5.4 病害發(fā)生分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(以株為單位)0級(jí)：無(wú)任何癥狀；1級(jí)：心葉明脈，輕微花葉，發(fā)病面積占整個(gè)植株面積的5%以下；3級(jí)：心葉及少數(shù)葉片花葉，發(fā)病面積占整個(gè)植株面積的615%；5級(jí)：多數(shù)葉片花葉，少數(shù)葉片皺縮、畸形，植株輕微矮化，發(fā)病面積占整個(gè)植株面積的16%30%；7級(jí)：多數(shù)葉片嚴(yán)重花葉，多數(shù)葉片皺縮、畸形，植株矮化，或葉柄有褐色壞死斑點(diǎn)，發(fā)病面積占整個(gè)植株面積的31%50%；9級(jí)：嚴(yán)重發(fā)病，葉片嚴(yán)重畸形，植株嚴(yán)重矮化，莖部有褐色條斑，發(fā)病面積占整個(gè)植株面積的51%。以上。5.5 病情指數(shù)按下式計(jì)算。（1）式中：病情指數(shù)；各級(jí)病株數(shù)；該病級(jí)數(shù)；調(diào)查總株數(shù)；最高級(jí)數(shù)。6 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)檢測(cè)，不能確定為黃瓜綠斑駁花葉病毒的，取樣帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)鑒定。6.1 取樣方法在發(fā)病植株上，隨機(jī)選取發(fā)病葉片或果實(shí)（其數(shù)量以滿足檢測(cè)鑒定所需為限），裝入聚乙烯塑料袋中密封，貼好標(biāo)簽帶回。標(biāo)簽應(yīng)注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、采集人等信息。對(duì)所采集的樣本，應(yīng)放入低溫（4）密閉保存，要盡早進(jìn)行鑒定。6.2 病毒鑒定將所采集的樣本進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)（ELISA）或分子生物學(xué)技術(shù)（PCR）測(cè)定，將檢測(cè)結(jié)果與附錄A記述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的病原特征進(jìn)行比較，符合附錄A記述的黃瓜綠斑駁花葉病毒病原特征的，確定為黃瓜綠斑駁花葉病毒。7 標(biāo)本保存7.1 應(yīng)配有田間調(diào)查的植株、葉片、花、果實(shí)等資料，癥狀照片;當(dāng)?shù)貙＜业某醪借b定或識(shí)別結(jié)果。7.2 樣品采集應(yīng)以幼嫩葉片為主，特殊材料可以根據(jù)具體情況靈活掌握，樣品數(shù)量不少于200g/份，每個(gè)標(biāo)樣2份，提倡凍干樣品（冷凍樣品），送指定的專家鑒定。7.3 當(dāng)?shù)卦O(shè)法保存活體樣品，以備應(yīng)急使用。7.4 適合壓制的葉片標(biāo)本，應(yīng)隨采隨壓于標(biāo)本夾中。7.5 記載寄主名稱、發(fā)病情況、環(huán)境條件、采集地點(diǎn)、采集日期、采集人姓名等。附錄A （資料性附錄）黃瓜綠斑駁花葉病毒分類命名和病原特征A.1 分類和命名A.1.1學(xué)名 Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）A.1.2分類地位 煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)A.1.3病毒異名 Tobacco mosaic virus watermelon strain,Cucumber virus 3,Cucumber virus 4, Cucumid virus 2A.2 病原特征A.2.1 病毒粒子直棒狀病毒，長(zhǎng)300nm，寬15nm 。沉淀系數(shù)185S。等電點(diǎn)pH4.98；A260/2801.38。A.2.2 核酸核酸含量5，單鏈RNA，分子量2106。G:A:C:U=23.2:24.6:20.6:31.6。A.2.3蛋白蛋白含量95，分子量17261。氨基酸160，其組成為Ala21、Arg8、Asp20、Cys0、Glu10、Gly9、His1、Ile7、Leu18、Lys4、Met0、Phe9、Pro6、Ser24、Thr10、Trp2、Tyr4、Val7。A.2.4 病毒株系根據(jù)不同分離物的血清學(xué)反應(yīng)及其對(duì)莧色藜和蔓陀羅的癥狀反應(yīng)，將其分為以下株系。主要有英國(guó)和歐洲報(bào)道的典型株系（Ainsworth, 1935），日本報(bào)道的黃瓜株系（cucumber strain）、西瓜株系（Watermelon strain）和Yodo株系（Yodo strain），以及印度 C 株系(Hollings et al.，1975)。附錄B(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒的寄主范圍、地理分布、生物學(xué)特性、為害癥狀、傳播途徑及鑒別寄主B.1 寄主范圍B.1.1 自然寄主西瓜、南瓜、甜瓜、黃瓜、葫蘆、西葫蘆、瓠瓜。B.1.2寄主范圍莧色藜、蔓陀羅、甜瓜、筍瓜、西葫蘆、葫蘆、絲瓜、煙草。B.2 地理分布目前，CGMMV 在世界已廣泛分布，歐洲的英國(guó)、愛(ài)爾蘭、德國(guó)、荷蘭、丹麥、俄羅斯、希臘、奧地利、捷克、斯洛伐克、芬蘭、南斯拉夫、羅馬尼亞、摩爾多瓦、波蘭、烏克蘭、拉托維亞、保加利亞、捷克、匈牙利、西班牙、瑞典；南美洲的巴西；亞洲的日本( Yodo、Ibaraki、松山、德島、北海道、千葉)、印度(Uttar-Pradesh、Delhi)、韓國(guó)、巴基斯坦(西北部邊境省份)、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、朝鮮及我國(guó)的遼寧、河北、山東、廣東、湖北等省發(fā)生。B.3 生物學(xué)特性B.3.1 致死溫度黃瓜綠斑駁花葉病毒的致死溫度為90 100B.3.2 稀釋限點(diǎn)黃瓜綠斑駁花葉病毒的稀釋限點(diǎn)為10-6 10-7 mL/LB.3.3 體外存活期體外存活期較長(zhǎng)，達(dá)119d以上。在 0可保持?jǐn)?shù)年，20病毒仍能存活。病毒在種子內(nèi)可存活240d540d，病殘?bào)w在土壤內(nèi)深埋420d，病毒仍有侵染活性。B.3.4 病毒粒體形態(tài)電鏡觀察病毒粒體為棒狀，長(zhǎng)約300nm，寬15nm。B.4 為害癥狀B.4.1 西瓜染病癥狀幼葉出現(xiàn)淡黃色花葉，其后出現(xiàn)斑駁、花葉、葉脈綠帶狀、濃綠凹凸斑等，隨葉片老化癥狀減輕。有時(shí)也呈葉脈綠帶狀。果實(shí)表面濃綠圓斑，果蒂處有時(shí)壞死，種子周圍的果肉呈赤紫色水漬狀，成熟時(shí)變?yōu)榘岛稚霈F(xiàn)空洞，并且呈絲狀纖維化，腐爛變味，不能食用。B.4.2 甜瓜染病癥狀感病后莖端新葉出現(xiàn)黃斑，但隨新葉老化癥狀減輕。成株側(cè)枝葉出現(xiàn)不整形或星狀黃花葉，生育后期頂部葉片有時(shí)再現(xiàn)大型黃色輪斑。果實(shí)有兩類癥狀，一種在果實(shí)表面出現(xiàn)綠色斑。另一種在綠色部的中心出現(xiàn)灰白色部分。B.4.3 黃瓜染病癥狀感病初期新葉出現(xiàn)黃色小斑點(diǎn)，以后黃色部分?jǐn)U展成花葉，并發(fā)生濃綠瘤狀突起，出現(xiàn)葉脈綠帶。發(fā)病輕時(shí)果實(shí)只出現(xiàn)淡黃色圓形小斑點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)濃綠色瘤狀突起變成畸形。B.5 傳播途徑B.5.1 傳播方法CGMMV有多種傳播方式：1.種子傳播；2.接觸傳染（包括植物間接觸、農(nóng)事操作、汁液）；3.介體傳毒（如菟絲子、黃瓜葉甲）；4.花粉傳毒；5.病殘?bào)w6.其他（嚙齒動(dòng)物的糞便、栽培營(yíng)養(yǎng)液、河水、灌溉水、被污染的包裝容器、用作肥料的牛糞）。其中帶毒種子是遠(yuǎn)距離傳播主要途徑。接觸性傳染是近距離傳播主要途徑。B.5.2.2侵染循環(huán)該病毒在種子、病株殘?bào)w、土壤中均可越冬，成為第二年的初侵染來(lái)源。帶毒種子是主要初侵染源。在田間， CGMMV 能很容易地通過(guò)病株的汁液接觸傳播，人工嫁接和授粉等方式易再傳染。因此，田間農(nóng)事操作如整枝、上架、摘心、授粉、嫁接、摘果均可導(dǎo)致該病毒的再次傳播。B.5.3流行與環(huán)境發(fā)病受溫度影響，在16時(shí)侵染至發(fā)病需23周，顯病較輕；在2835下接種1周即可發(fā)病，癥狀重。CGMMV適生性和抗逆性極強(qiáng)，所有株系都是極端穩(wěn)定的，其致死溫度 90 100，稀釋限點(diǎn)10-6 10-7，常溫下病毒侵染力可保持?jǐn)?shù)月，在 0可保持?jǐn)?shù)年，20病毒仍能存活，一旦條件適宜還能繼續(xù)傳播蔓延。田間一旦發(fā)病，如未進(jìn)行特殊的殺滅處理，病株殘?bào)w中的病毒可存活多年，即便將病根埋在土壤內(nèi) 365d以上，病毒仍保持侵染能力。B.6 鑒別寄主B.6.1 黃瓜 新葉出現(xiàn)黃色小斑點(diǎn)，后呈花葉并帶有濃綠色突起，葉脈間褪色呈葉脈綠帶狀。B.6.2 西瓜 莖端幼葉出現(xiàn)淡黃色花葉，其后出現(xiàn)濃綠凸凹斑，隨葉片老化癥狀減輕。果實(shí)表面濃綠圓斑，中央有壞死點(diǎn)，種子周圍的果肉呈赤紫色水漬狀，成熟時(shí)變?yōu)榘岛稚霈F(xiàn)空洞。B.6.3 甜瓜 新葉出現(xiàn)黃斑，但隨葉片老化呈葉脈綠帶狀。B.6.4 瓠瓜 葉片出現(xiàn)花葉，有綠色突起，脈間黃化呈葉脈綠帶狀。B6.5葫蘆幼葉出現(xiàn)淡黃色花葉，其后出現(xiàn)濃綠凹凸斑，隨葉片老化癥狀減輕。B.6.5 莧色藜 經(jīng)西瓜株系、Yodo株系和印度C株系侵染后出現(xiàn)細(xì)小局部壞死斑，而歐洲黃瓜株系不出現(xiàn)這種癥狀；無(wú)系統(tǒng)侵染。B.6.6 蔓陀羅 Yodo株系和日本的黃瓜株系在接種后7d產(chǎn)生能擴(kuò)散的局部褪綠斑；無(wú)系統(tǒng)侵染。附錄C(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Double antibody sandwich ELISA）標(biāo)準(zhǔn)C.1儀器和用具C.1.1儀器設(shè)備離心機(jī)、電子天平（1/10 000g）、酶標(biāo)儀等。C.1.2 用具可調(diào)移液器（20L200L、200L1000L）及相關(guān)吸頭、研缽、離心管（1.5mL、10mL）、量筒、燒杯等。C.2 試劑C.2.1包被緩沖液無(wú)水碳酸鈉 1.59g，碳酸氫鈉 2.93g，疊氮化鈉 0.2g，蒸餾水定容至1000mL，調(diào)整pH至9.6，4貯存。C.2 2洗滌緩沖液（PBST）磷酸氫二鈉（無(wú)水） 1.15g或磷酸氫二鈉（十二水） 2.9g，磷酸二氫鉀（無(wú)水） 0.2g，氯化鈉 8.0g，氯化鉀 0.2g，吐溫-20 0.5g 蒸餾水定容至1000mL，調(diào)整pH至7.4，室溫貯存。C.2.3 提取緩沖液雞蛋清粉 2.0g，PVP （分子量 24-40,000）20.0g，無(wú)水亞硫酸鈉 1.3g，疊氮化鈉 0.2g，吐溫-2020.0g溶解于1000mL 1X PBST中，調(diào)整pH至7.4，4貯存。C.2.4 酶標(biāo)抗體緩沖液牛血清蛋白 2.0g，PVP（分子量 24-40,000） 10.0g，疊氮化鈉 0.2g，溶解于1000mL 1X PBST中，調(diào)整pH至7.4，4貯存。C.2.5 底物緩沖液二乙醇胺97.0mL，氯化鎂0.1g，疊氮化鈉0.2g，蒸餾水定容至800mL，調(diào)整pH至9.8，4貯存。C.3 取樣方法C.3.1種子取若干粒種子，去皮，加入樣品提取緩沖液（W/V=1：8）研磨勻漿，離心后4 保存待用。C.3.2葉片取葉片加入提取緩沖液（W/V=1：8）研磨勻漿。離心后4 保存待用。C.4 DAS-ELISA檢測(cè)程序C.4.1包被 將CGMMV的包被抗體按照試劑盒指定稀釋比例用包被抗體緩沖液稀釋，混勻，加入酶聯(lián)板中，每孔內(nèi)加入100 L，放入保濕盒內(nèi)，4 冰箱過(guò)夜。C.4.2洗滌 孵育結(jié)束后，將反應(yīng)孔中的試劑倒出，用PBST洗滌液沖洗3次4次，每次15s，然后將微孔板倒扣在吸水紙上以控干孔中殘留液體。C.4.3加入抗原（待測(cè)樣品）在酶聯(lián)板中加入抗原(待測(cè)樣品)，同時(shí)加入陽(yáng)性指控物和空白對(duì)照（即樣品提取緩沖液），陽(yáng)性指控物、空白對(duì)照和待測(cè)樣品每孔內(nèi)加入100 L，待測(cè)樣品重復(fù)3次，恒溫箱中或室溫（2025 ）孵育2 h。C.4.4 洗滌按本規(guī)程4.2執(zhí)行。C.4.5 加入酶標(biāo)抗體將CGMMV的酶標(biāo)抗體按照試劑盒指定稀釋比例用酶標(biāo)抗體緩沖液稀釋，混勻，加入酶聯(lián)板中，混合均勻，于每個(gè)反應(yīng)孔中加入100L，放入保濕盒內(nèi)，室溫（2025 ）孵育2 h。C.4.6 洗滌按本規(guī)程4.2執(zhí)行。C.4.7 加入底物試劑孵育結(jié)束前的15 min制備PNP底物溶液，加入PNP顯色劑，混合均勻，加入酶聯(lián)板，每孔100 L。放入保濕盒內(nèi)，室溫（2025 ）避光3060 min。C.4.8 終止反應(yīng)于每孔中加入50 L終止液，終止反應(yīng)。C.4.9 測(cè)定用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)量結(jié)果，讀取各孔溶液的光密度值（OD值）。C.5結(jié)果評(píng)定根據(jù)試劑盒提供的方法和標(biāo)準(zhǔn)。在陽(yáng)性對(duì)照光密度值符合試劑盒設(shè)定值的前提下，以微孔中陰性對(duì)照的2倍為標(biāo)準(zhǔn)，大于這個(gè)數(shù)值的樣品為陽(yáng)性結(jié)果，小于這個(gè)數(shù)值為陰性結(jié)果。另外各參照孔（包括底物孔、緩沖液孔、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照）測(cè)定值要符合試劑盒設(shè)定的目標(biāo)值；重復(fù)樣品孔的光密度值一致。C.6樣品保存對(duì)于檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性的樣品，必須對(duì)樣品進(jìn)行保存。種子樣品應(yīng)保存在4冰箱內(nèi)，葉片和果實(shí)樣品應(yīng)保存在20冰箱內(nèi)。C.7結(jié)果記錄與資料保存完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括：樣品的來(lái)源、種類、接收時(shí)間，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果等，并要有經(jīng)手人和實(shí)驗(yàn)人員的簽字。附錄D(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-PCR擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定(Polymerase Chain Reaction，PCR)標(biāo)準(zhǔn)D.1儀器和用具D.1.1 儀器設(shè)備PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析儀、冷凍離心機(jī)、電子天平（1/10 000g）、pH計(jì)、水浴鍋、振蕩器等。D.1.2用具可調(diào)移液器（0L20L、20L200L、200L1000L）及相關(guān)吸頭、eppendorf管、研缽、離心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2 mL）、量筒、燒杯、鑷子等.D.2 試劑Trizol為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒為TaKaRa RNA PCR Kit （AMV） Ver 3.0 （TaKaRa Code.DRR019A）。其他試劑：液氮、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、溴化乙錠。D.3 檢疫程序D.3.1 器皿前處理為防止RNA酶降解RNA，器皿在試驗(yàn)前都要用DEPC水（V：V=1：1000）進(jìn)行處理。將研缽、槍頭、離心管等放于DEPC水中37，浸泡24 h，取出后121滅菌30min ，烘干備用。D.3.2 總RNA的提取取顯癥的葉片液態(tài)氮中充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中，加入1 mL Trizol試劑，室溫下靜置5 min后加入200 L氯仿渦輪震蕩15 s，室溫下放置5 min。12000 r/min，4離心15 min，轉(zhuǎn)移上清于一個(gè)新離心管中，加600 L異丙醇混勻后于室溫下靜置10 min，12000 r/min，4 離心15 min，倒掉上清液，在沉淀物中加1 mL 75%的乙醇清洗1次，吸掉上清后室溫干燥3min5 min，加入30 L DEPC ddH2O溶解總RNA。D.3.3 RT-PCR反應(yīng)體系D.3.3.1 引物序列(CGMMV-西瓜株系) 上游引物（Primer F）：5-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3； 下游引物（Primer R）：5-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGC-3。D.3.3.2 RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟D.3.3.2.1 cDNA合成 按下列組分制備RT反應(yīng)體系10mL，反應(yīng)以加入不含RNase 的dH2O為陰性對(duì)照，反應(yīng)條件為42 1 h；99 5 min；5 5 min擴(kuò)增cDNA。反應(yīng)體系見(jiàn)表D.1。D.3.3.2.2 PCR擴(kuò)增在冰浴上依次將下列組分加入PCR反應(yīng)管中，反應(yīng)采用50 L體系。反應(yīng)條件為：94預(yù)變性3 min；94變性30 s，53退火45s，72延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72延伸 10 min。反應(yīng)體系見(jiàn)表D.2。D3.3.2.3 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè) 取5 L 擴(kuò)增產(chǎn)物用6loading buffer溶解，點(diǎn)樣。電泳檢測(cè)，用溴化乙錠（EB）溶液進(jìn)行染色30 min。在Image Master紫外成相系統(tǒng)（Pharmacia Biotech）上觀察結(jié)果并攝像。表 D.1 RT反應(yīng)體系反應(yīng)組成體積（L）Primer R（10M）0.5MgCl2210RT Buffer1RNase free dH2O3.75dNTP Mixture（各10mM）1RNase Inhibitor （40 U/L）0.25AMV Reverse Transcriptase0.5RNA1Total10表 D.2 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)組成體積（L）5PCR buffer10ddH2O29.25TaKaRa ETaqHS0.25Primer F（10M）0.5RT產(chǎn)物（cDNA）10Total50D.4 結(jié)果評(píng)定觀察電泳結(jié)果，PCR產(chǎn)物在500bp處有條帶出現(xiàn)，判斷樣品攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒，否則為陰性。D.5 樣品保存對(duì)于檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性的樣品，必須對(duì)樣品進(jìn)行保存?zhèn)洳?。種子樣品應(yīng)保存在4冰箱內(nèi)，葉片和果實(shí)樣品應(yīng)保存在-20冰箱內(nèi)。D.6 結(jié)果記錄與資料保存完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括：樣品的來(lái)源、種類、接收時(shí)間，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果