Western-blot實(shí)驗(yàn)方法步驟.ppt

Western-blot 試驗(yàn),概論,它結(jié)合了凝膠分辨力高和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種優(yōu)點(diǎn)，與免疫沉淀法比較，這種方法無(wú)需對(duì)靶蛋白進(jìn)行同位素標(biāo)記。幾乎總在變性條件下進(jìn)行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白與外來(lái)蛋白的共沉淀等諸多問(wèn)題。 具有從混雜抗原中檢測(cè)出特定抗原，或從多克隆抗體中檢測(cè)出單克隆抗體的優(yōu)越性，還可以對(duì)轉(zhuǎn)移到固相膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行連續(xù)分析，具有蛋白質(zhì)反應(yīng)均一性，固相膜保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。 被廣泛地用于蛋白質(zhì)研究，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。,溶解蛋白策略,1 使用劇烈的條件以確保細(xì)胞蛋白能全部裂解下來(lái)，但這可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)性的丟失。 2 采用溫和的條件以助于保持蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)，但這造成蛋白質(zhì)從細(xì)胞上的脫落效果欠佳。 機(jī)械破碎細(xì)胞，可釋放出蛋白酶從而使靶蛋白降解。細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白通常比細(xì)胞內(nèi)蛋白具有更好的抵抗力，變性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根據(jù)靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性質(zhì)來(lái)調(diào)整提取的條件。 為盡可能減少可能出現(xiàn)的問(wèn)題，可設(shè)法采用多克隆抗血清或多種單克隆抗體的混合物，因?yàn)樗麄兛膳c某一蛋白的多種形式起反應(yīng)。,溶解方法,溶解方法取決于細(xì)胞的型別和待測(cè)抗原的性質(zhì)： 1 表達(dá)靶蛋白的細(xì)菌一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解。 2 酵母先用玻璃珠振蕩法或酶法裂解細(xì)胞，然后制備提取液。 3 哺乳動(dòng)物組織通?？梢詸C(jī)械分散并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液。 4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞可用去污劑溫和裂解。如果靶抗原耐受相應(yīng)抽提過(guò)程，也可在SDS凝膠加樣緩沖液裂解。,細(xì)胞準(zhǔn)備,用PBS洗兩次細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用橡膠刮子刮下細(xì)胞，由于染色體DNA的釋放，溶液變得很粘稠。吸入1.5ml離心管。 超聲打碎染色體DNA,直至溶液不粘為止。 4度，13000rpm，30分鐘離心。分成三層：上層為油脂，中層為蛋白質(zhì)，下層為沉淀。 有必要時(shí)重復(fù)上一步驟。 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可將上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf -80C保存,注意事項(xiàng),細(xì)胞裂解液的量 超聲的頻率，時(shí)間，次數(shù)。插得深不起泡沫。 檢測(cè)蛋白的敏感性15ng,0.75mm厚的SDSPAGE的一個(gè)孔大約上100ug的總蛋白。 只要被檢測(cè)蛋白占總蛋白的1/100000,即可被檢測(cè)。 未知蛋白應(yīng)同時(shí)作陽(yáng)性對(duì)照。,主要試劑,RIPA（華舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（華舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 雙丙烯酰胺（Amresco公司） 麗春紅染料（華舜公司） Tween 20（Amresco公司） 過(guò)硫酸銨（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纖維素膜（Amersham公司） 考馬斯亮蘭（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗體（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）,儀器與設(shè)備,低溫超速離心機(jī)（Eppendorf公司） 分光光度計(jì)（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 電泳儀（Bio-Rad 公司） 垂直式電泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）,配制試劑,10電泳Buffer 稱取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去離子水，定容至1000ml SDS 10克 1.5M Tris.HCl PH 8.8 稱取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，調(diào)PH至8.8，定容100ml 0.5M Tris.HCl PH6.8 稱取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，調(diào)PH至6.8，定容100ml 轉(zhuǎn)膜緩沖液 稱取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，臨用前加200ml甲醇 10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml。,配制試劑,30Acry-Bis 29克丙烯酰胺1克雙丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4保存 10過(guò)硫酸胺，新鮮配制，1week 0.1克過(guò)硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4保存 封閉試劑 10TBS （應(yīng)用液：1TBS） 10TBS：取24.2克TrisBase 80克氯化鈉 用800mlddH2O溶解后，用HCl調(diào)PH至7.6，定容至1000ml 1TBS：取10TBS 50ml，稀釋至500ml，臨用前加0.1Tween 20，500ul。,配制試劑,4SDS Sample Buffer 2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中，調(diào)pH6.8 8克SDS 0.4克溴酚蘭 定容至100ml 40ml甘油 10ml DTT貯存液 1mol/L DTT貯存液：0.01mol/L 乙酸鈉 20ml 3.09克DTT過(guò)濾除菌后-20保存，分裝成1ml。 考馬斯亮蘭染液： 45ml 甲醇 45ml 水 用Whatman濾紙過(guò)濾，去除顆粒狀物質(zhì) 10ml 冰乙酸 0.25克 考馬斯亮蘭R250,抗體選擇,一種免疫球蛋白可優(yōu)先識(shí)別其靶表位的某一特定構(gòu)象（例如變性構(gòu)象或天然構(gòu)象）。并非所有的單克隆抗體都適合作為探針用于WETERN-BLOT，因?yàn)檫@一實(shí)驗(yàn)中靶蛋白是徹底變性的。 多克隆抗血清是由單一免疫球蛋白組成的不確定混合物，通常對(duì)其特異性、親和力以及濃度都一無(wú)所知。因而不可能預(yù)言用特定多克隆抗血清來(lái)測(cè)定某一固定化變性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。 設(shè)置對(duì)照： 1不與靶蛋白反應(yīng)的抗體（即免疫前血清或非相關(guān)單克隆抗體） 2 樣品對(duì)照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品 選用抗變性蛋白的高滴度多克隆抗血清或單克隆抗體混合物為佳。,實(shí)驗(yàn)步驟,配膠 制膠 先用1ml槍頭小心鋪10%分離膠，上加少許異丙醇，待分離膠干凝后，倒去異丙醇，用水洗去多余未聚合的膠，濾紙吸干。再鋪4%積層膠，注意不要產(chǎn)生氣泡，斜插上梳子，待膠干后備用，拔去梳子。 上樣，所有上樣孔均加樣，沒(méi)有樣本，用上樣緩沖液代替。 100V，溴酚蘭走到分離膠底部后，1.5h后電泳結(jié)束。,實(shí)驗(yàn)步驟,轉(zhuǎn)膜 小心取下凝膠，把預(yù)先在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡過(guò)的Whatman濾紙及硝酸纖維素膜切成與凝膠同樣大小，按次序疊放在一起，在4度100V電壓轉(zhuǎn)膜1H,取出硝酸纖維素膜，右上角切去以作標(biāo)記，麗春紅染色，可見(jiàn)多條粉紅色條帶，再用TBST漂洗至膜發(fā)白。 封閉 稱取脫脂奶粉1克，用1TBS溶解到20ml，使脫脂奶粉濃度為5。將硝酸膜浸在20ml封閉液中，室溫?fù)u2h后。,實(shí)驗(yàn)步驟,一抗雜交孵育 將一抗用含5%脫脂奶粉的1TBST溶液稀釋，使抗體濃度為1:1000；將封閉過(guò)的膜放在一抗稀釋液中，4度過(guò)夜；而后吸棄一抗稀釋液，用1TBST洗3次，每次5min。二抗孵育 二抗雜交孵育：將辣根過(guò)氧化物酶連接的二抗用含5%脫脂奶粉的1TBST溶液稀釋，使?jié)舛葹?:2000，并加入辣根過(guò)氧化物酶連接的抗生物素抗體（濃度為1:1000），將膜置于二抗稀釋液中，室溫振蕩孵育1h；而后吸棄二抗稀釋液，用1TBST洗3次，每次5min。,實(shí)驗(yàn)步驟,顯影：將膜置入10ml LumiGLO溶液中（10ml LumiGLO溶液配方為：0.5ml 20LumiGLO、0.5ml 20Peroxide、9.0ml Milli-Q water），室溫輕搖1分鐘，注意避光操作；在暗室中剪下與膜同樣大小的膠片，壓在暗盒中，約1min；將膠片放在顯影液中洗1-5min；水沖洗；定影液中洗2-5min；水沖洗，可在相應(yīng)位置見(jiàn)到目的條帶。,疑難雜證,沒(méi)有注明可以用來(lái)做western blot的一抗，可以用來(lái)做western blot嗎？ 不一定,因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位的，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于western blotting，因?yàn)樵趙estern blotting中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞。,疑難雜證,做western每次只加一種一抗，請(qǐng)教有人同時(shí)加兩種或者多種一抗的嗎？ 最好還是不要同時(shí)加兩種一抗。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號(hào)的話，就說(shuō)不清楚了。做Western在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對(duì)照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。 曾經(jīng)做過(guò)Western在同一張膜上檢測(cè)兩種蛋白。因?yàn)檫@兩種目的蛋白的分子量相差較遠(yuǎn)，轉(zhuǎn)完膜后，一邊給Marker染色，一邊封閉。在上一抗之前，根據(jù)Marker的條帶把膜水平剪開(kāi)，分子量小的目的蛋白在下面半張，大的在上面半張。然后分別上一抗、二抗，檢測(cè)。,疑難雜證,western blot 使用的膜哪種最好啊，PVDF好還是NC膜，能介紹一下膜的選擇嗎？ PVDF膜價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。 NC膜價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 都可以用麗春紅染色。 具體使用還要參考相關(guān)文獻(xiàn),疑難雜證,做western，在分子量很低的位置總是出現(xiàn)一條很強(qiáng)的帶（通常比我要的帶強(qiáng)），不知道為什么？是蛋白降解了嗎？ 有降解的可能，但如果用的是多抗出現(xiàn)非特異也是可能的，關(guān)鍵是你要的位置出現(xiàn)了嗎？ 減少非特異可以延長(zhǎng)封閉時(shí)間，對(duì)付降解要視具體情況了。,疑難雜證,請(qǐng)問(wèn)分子量為41KD和57KD作WESTERN時(shí),可以分開(kāi)切膠嗎?分別用多大電流轉(zhuǎn)膜?轉(zhuǎn)多長(zhǎng)時(shí)間? 理論上分的開(kāi)！蛋白Marker分子量分別為97kd 66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白時(shí)，分離的效果都比較好！分子量為41KD和57KD的蛋白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd，蛋白分子量相差15KD，分離效果很明顯。應(yīng)該可以分開(kāi)切膠！,疑難雜證,分別用多大電流轉(zhuǎn)膜? 一、一般跟你的分離膠的濃度有關(guān)。 二、與你的轉(zhuǎn)印系統(tǒng)型號(hào)有關(guān). 三、與目的蛋白的分子量有關(guān). 一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；,疑難雜證,WESTERN為什么出現(xiàn)了多條帶,每個(gè)加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶，而且好象都很有規(guī)律,為什么?是封閉時(shí)間不夠嗎,請(qǐng)指教 .做WESTERN必須要內(nèi)參嗎？ 1、一抗、或二抗抗體濃度太高 2、多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng) 3、抗體的特異性不強(qiáng) 4、目的蛋白經(jīng)過(guò)處理后發(fā)生變化,而內(nèi)參的條帶基本均勻一致.這樣才有說(shuō)服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認(rèn)為的造成目的條帶濃度的變化.所以嚴(yán)格意義上說(shuō),內(nèi)參是必須做的。,疑難雜證,western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些？購(gòu)買一抗時(shí)發(fā)現(xiàn)單抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？ 作為western來(lái)講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價(jià)格偏高，所以一般來(lái)說(shuō)多抗足夠了。用于western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來(lái)說(shuō)用于western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)來(lái)確定。 做免疫印跡時(shí)選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個(gè)問(wèn)題，一是所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。,疑難雜證,以下是關(guān)于合適抗體選擇的優(yōu)缺點(diǎn)比較，帖子上表格排不齊，只好以圖片形式抓了下來(lái)。,疑難雜證,為什么細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白？ 答：原因有很多，1 細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；2 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；3 抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說(shuō)明，看是否有問(wèn)題。 細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？ 答：1 有沉淀可能是因?yàn)榈鞍讻](méi)有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)，2 也不排除抗原濃度過(guò)高，這時(shí)再加入適量sample buffer即可。,疑難雜證,蛋白質(zhì)分子量很?。?0KD），請(qǐng)問(wèn)怎么做WB？ 答：可以選擇PSQ膜,同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間.也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟可 目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？ 答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。 膠片背景很臟，有什么解決方法？ 答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時(shí)間，牛奶濃度提高。,疑難雜證,目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？ 答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周圍底物催化完，形成了空白。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。 我的膠片是一片空白，是怎么回事？ 如果能能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。1 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；2 ECL底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；3 ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；4 二抗失活。 問(wèn)我顯影液顯影1分鐘,和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢? 1可能是紅燈造成的,可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善. 膠片本來(lái)就被曝光了2顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng).,疑難雜證,DAB好還是ECL好？ DAB(二氨基聯(lián)苯胺) 有毒,但是比較靈敏,是HRP最敏感的底物；ECL結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。 抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？ 抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開(kāi)二聚體。在上層膠中加入尿素至8M也可以打開(kāi)。 半干轉(zhuǎn)是否要求膜，濾紙，膠同樣大?。恳?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn)，那樣會(huì)不會(huì)短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？ 一般參照 膜= 濾紙 膠, 就行，你轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。,疑難雜證,電泳時(shí)Marker 按說(shuō)明加5ul，但電泳中看不見(jiàn)，是失活了嗎？ 加入20ul即可。 蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有