不同力電刺激對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶基因表達(dá)的影響

單位代碼 10006 學(xué) 號(hào) 10101025 1分類號(hào) R318.0 畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)不同力電刺激對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶基因表達(dá)的影響 學(xué)院名稱生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 專業(yè)名稱生物工程 學(xué)生姓名薛 飛 指導(dǎo)教師李 萍 2014年 5月 不同力電刺激對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶基因表達(dá)的影響 薛飛 北京航空航天大學(xué)京航空航天大學(xué) 北京航空航天大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題目：不同力電刺激對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶基因表達(dá)的影響 、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：原始數(shù)據(jù)來(lái)源：RT-PCR檢測(cè)不同大小及加載時(shí)間的力/電刺激對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）基因表達(dá)量的影響。 設(shè)計(jì)技術(shù)要求：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)合理力電刺激方式細(xì)胞ALP mRNA的提取技術(shù)RT-PCR技術(shù)后期數(shù)據(jù)處理。 、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）工作內(nèi)容： 1月13日-3月02日 文獻(xiàn)調(diào)研，完成開題報(bào)告 3月03日-3月17日 MC3T3-E1細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng) 3月18日-4月15日 力/電刺激處理細(xì)胞 4月16日-5月06日 ALP mRNA的提取與檢測(cè) 5月06日-5月26日 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫畢業(yè)設(shè)計(jì)論文，準(zhǔn)備答辯 、主要參考資料：1Matsugaki A, Fujiwara N, Nakano T. Continuous cyclic stretch induces osteoblast alignment and formation of anisotropic collagen fiber matrixJ. Acta biomaterialia, 2013, 9(7): 7227-7235.2LozuponeE, FafiaA, GrimaldiA. Effects of intermittent mechanical force on bone tissue in vitro: preliminary results J. J Bone MinerRes. 1992 (7):407-409.3Kang K S, Lee S J, Lee H, et al. Effects of combined mechanical stimulation on the proliferation and differentiation of pre-osteoblastsJ. Experimental & molecular medicine, 2011, 43(6): 367-373. 4Wiesmann H P, Hartig M, Stratmann U, et al. Electrical stimulation influences mineral formation of osteoblast-like cells in vitroJ. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 2001, 1538(1): 28-37. 生物與醫(yī)學(xué)工程 院（系） 生物工程 專業(yè)類 101011 班學(xué)生 薛飛 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）時(shí)間： 自2014年03月01日至2014年06月10日答辯時(shí)間： 年 月 日 成績(jī) 指導(dǎo)教師： 兼職教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分）： 教研室主任 注：任務(wù)書應(yīng)該附在已完成的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的首頁(yè)。 北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文) 第 V 頁(yè) 本人聲明我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，在完成論文時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。 作者：薛飛簽字：時(shí)間：2014年 6 月不同力電刺激對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)的影響學(xué) 生：薛 飛 指導(dǎo)教師：李 萍 摘 要成骨細(xì)胞在體內(nèi)受到多種因素的影響，如力學(xué)環(huán)境、電場(chǎng)、磁場(chǎng)以及生化因素等，骨組織的形成過(guò)程中前成骨細(xì)胞的骨向分化是重要的生理過(guò)程，而骨向分化過(guò)程伴隨著各種物理化學(xué)信號(hào)對(duì)細(xì)胞的刺激，其中牽張刺激和電刺激對(duì)前成骨細(xì)胞的增殖與分化分別具有一定的作用。同時(shí)加載牽張電刺激能夠更加真實(shí)地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，有利于促進(jìn)成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)以及骨組織的體外培育。本實(shí)驗(yàn)建立在這兩種不同刺激的效應(yīng)之上，通過(guò)使用自行設(shè)計(jì)的牽張、電刺激加載裝置，比較分別加載牽張、電刺激以及同時(shí)加載兩種刺激對(duì)于前成骨細(xì)胞MC3T3-E1分化的影響。牽張力和電刺激以及力電同時(shí)刺激實(shí)驗(yàn)均通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）基因表達(dá)情況。結(jié)果表明牽張力刺激會(huì)抑制成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）基因的表達(dá)，即抑制成骨細(xì)胞的分化；電刺激對(duì)成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶基因的表達(dá)沒(méi)有顯著性作用。 力電刺激方式為體外細(xì)胞培養(yǎng)、生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、骨疾病的治療及組織培育提供了新的思路，對(duì)組織工程的進(jìn)一步發(fā)展具有重要的研究意義。關(guān)鍵詞：成骨細(xì)胞，牽張力刺激，電刺激，ALP基因表達(dá)，分化Effects of electrical and mechanical stimulation on ALP gene expression in MC3T3-E1AbstractThe growth of osteoblasts are affected by many factors such as mechanical environment, electrical field, magnetic field and biochemical factors, which are very important for the in vitro cultivation of osteoblasts. Many researches showed that single electrical or mechanical stimulation could increase the proliferation and differentiation of osteoblasts. The application of combined mechanical and electrical stimulation would provide a more realistic stimulation of in vivo microenvironment, which may improve in vitro cultivation of osteoblasts and bone tissue. Our work was built on the effects of these two different stimulations using self-designed stretch, electrical stimulation combined loading device, comparing stretch, electrical stimulation and simultaneous stimulation of them for the osteoblast differentiation in MC3T3-E1. In the combined stretch and electrical stimulation experiment, the ALP genes were tested by RT-PCR. It is showed that the single stretch stimulation can suppress the expression of ALP gene, while the single electrical stimulation has little influence on the expression of ALP gene. The combined mechanical and electrical stimulation would provide new way to promote the in vitro cultivation of cells and tissues, which will be very significant in the development of tissue engineering.Key words: Osteoblast, Stretch stimulation, Electrical stimulation, Expression of ALP gene, Differentiation目 錄1緒論11.1研究背景11.1.1力刺激對(duì)成骨細(xì)胞的影響21.1.2電刺激對(duì)成骨細(xì)胞的影響31.1.3電刺激形式31.1.4電刺激對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)41.1.5電刺激促進(jìn)成骨的作用機(jī)制51.1.6電刺激在骨組織工程中的應(yīng)用61.2課題研究意義72實(shí)驗(yàn)?zāi)康?2.1研究?jī)?nèi)容93實(shí)驗(yàn)材料103.1主要設(shè)備103.2主要試劑113.3主要試劑配制114實(shí)驗(yàn)方法124.1細(xì)胞培養(yǎng)124.1.1細(xì)胞復(fù)蘇124.1.2細(xì)胞傳代124.2牽張力與電刺激加載124.2.1牽張刺激加載實(shí)驗(yàn)124.2.2電刺激加載實(shí)驗(yàn)134.2.3牽張電聯(lián)合刺激加載實(shí)驗(yàn)134.3RT-PCR方法檢測(cè)堿性磷酸酶mRNA的表達(dá)134.3.1提取胞內(nèi)總RNA134.3.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）144.3.3凝膠配置方法155數(shù)據(jù)處理165.1RT-PCR圖片處理166結(jié)果及分析186.1結(jié)果186.2討論196.2.1牽張力刺激實(shí)驗(yàn)196.2.2脈沖電刺激實(shí)驗(yàn)206.2.3與其他研究的區(qū)別20結(jié)論22致謝23參考文獻(xiàn)24 北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文) 第 29 頁(yè) 1 緒論1.1 研究背景骨缺損是臨床常見(jiàn)疾病，每年有大量患者在術(shù)中需要進(jìn)行骨移植材料植入修復(fù)骨缺損。臨床常用修復(fù)方式主要包括自體骨移植、異體骨移植和生物活性材料移植。成骨細(xì)胞的增殖分化是治療中骨組織發(fā)生適應(yīng)性改建和骨再生重建的源泉1。同時(shí)骨質(zhì)疏松癥也是臨床常見(jiàn)疾病，長(zhǎng)期臥床患者和航天員由于應(yīng)力缺失會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松現(xiàn)象的發(fā)生，甚至造成骨折2。而成骨細(xì)胞功能減弱是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的重要原因之一3。成骨細(xì)胞是骨組織修復(fù)過(guò)程中的主要功能細(xì)胞，其增殖活性和功能狀態(tài)的改變直接反映了骨組織生長(zhǎng)重建的狀態(tài)4。因此實(shí)現(xiàn)骨材料中成骨細(xì)胞的大量增殖和分化是骨科研究的熱門5，針對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的研究具有重要的意義。早在1892年，沃爾夫提出了關(guān)于骨變化的規(guī)律，即Wolff定律，證明了骨的生長(zhǎng)、吸收、重建都與骨的受力狀態(tài)有關(guān)。體內(nèi)成骨細(xì)胞所處的力學(xué)環(huán)境極為復(fù)雜，目前研究力學(xué)刺激對(duì)成骨細(xì)胞的作用的系統(tǒng)通常分為壓應(yīng)力系統(tǒng)、張應(yīng)力系統(tǒng)、流體剪切應(yīng)力系統(tǒng)和離心力培養(yǎng)系統(tǒng)。應(yīng)力加載作用于骨，會(huì)導(dǎo)致一系列的成骨效應(yīng)，比如最典型的新骨形成和骨的重塑6。實(shí)驗(yàn)表明，力學(xué)因素對(duì)成骨組織的生長(zhǎng)起著十分重要的作用，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖及分化都有明顯的促進(jìn)作用7。Xu Zhang等人通過(guò)原子力顯微鏡證實(shí)通過(guò)加載一定頻率的機(jī)械刺激，成骨細(xì)胞的表面楊氏模量顯著增加，并且這種增加隨著刺激靜息間隔的增長(zhǎng)而減弱8。體外研究證實(shí)在低應(yīng)變下牽張后成骨細(xì)胞的增殖、膠原蛋白合成和堿性磷酸酶的活性都一致增加；相反，高應(yīng)變下牽張刺激不利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和合成代謝9。趙紅斌等10證實(shí)拉伸應(yīng)變作用于成骨細(xì)胞3 d和7 d 后，ALP mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)；相反非應(yīng)變組細(xì)胞ALP mRNA 的表達(dá)在14 d 后才顯著升高, 顯示拉伸應(yīng)變能促進(jìn)ALP 的表達(dá)。秦鵬等人證實(shí)隨著對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞正向牽張的增大，力生長(zhǎng)因子和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)均有明顯的增加11?；铙w骨總處在重建過(guò)程中，以適應(yīng)身體載荷的變化，骨受到應(yīng)力變形時(shí)，骨內(nèi)會(huì)產(chǎn)生電位，此電位稱為骨應(yīng)力產(chǎn)生電位。骨內(nèi)的骨應(yīng)力產(chǎn)生電位會(huì)產(chǎn)生壓電效應(yīng)12, 13和動(dòng)電現(xiàn)象。電刺激在骨延遲愈合或骨不連的病人治療中，有明顯的促進(jìn)骨痂生長(zhǎng)的作用。微量直流電作用于成骨細(xì)胞體系后，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分裂增殖速度14。早在1971年就有研究人員利用電刺激的方法促進(jìn)斷裂的踝骨愈合，這是現(xiàn)代最早的用電刺激的方法促進(jìn)愈合15。文獻(xiàn)表明，成骨細(xì)胞在電流刺激下細(xì)胞遷移、增殖和分化發(fā)生顯著改變。Batur Ercan等人分別通過(guò)1 V、5 V、10 V和15 V的脈沖電流（頻率20Hz，寬度0.4ms)對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖狀況有了顯著的提升16。通過(guò)進(jìn)一步研究，Batur Ercan證明了雙相電刺激和陽(yáng)極氧化納米管鈦表面均能改善成骨細(xì)胞的增殖和長(zhǎng)期功能（ALP合成，I型膠原的合成和鈣沉積）。并且在兩個(gè)條件聯(lián)合作用下，成骨細(xì)胞的長(zhǎng)期功能改善最為明顯17。同時(shí)Shijun Shao證實(shí)了電刺激能夠顯著增大成骨細(xì)胞在納米材料的延伸率，對(duì)骨再生和骨折治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值18。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。機(jī)體中骨組織不斷地進(jìn)行著重建，骨重建過(guò)程包括破骨細(xì)胞貼附在舊骨區(qū)域，分泌酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，分泌蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成骨吸收陷窩；其后，成骨細(xì)胞移行至被吸收部位，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化而形成新骨。要維持正常骨量的關(guān)鍵就是保證破骨與成骨過(guò)程的平衡。近年來(lái)，骨組織工程研究取得巨大進(jìn)展。骨組織工程的基本思想從傳統(tǒng)的“爬行替代”方式轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢T導(dǎo)成骨”方式實(shí)現(xiàn)骨修復(fù)與再生。利用組織工程的原理與技術(shù)促進(jìn)骨細(xì)胞增殖與分化，形成活體骨組織用于骨缺損的修復(fù)和再生，有望解決臨床修復(fù)大范圍骨缺損的難題。細(xì)胞培養(yǎng)是組織工程研究的主要方面，在保持細(xì)胞正常生理功能的前提下，如何經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、高密度地獲得大量細(xì)胞，成為組織工程研究的重點(diǎn)之一。成骨細(xì)胞在體內(nèi)受到多種因素的影響，如應(yīng)力，微電流，生長(zhǎng)因子等，這些條件對(duì)骨細(xì)胞的生長(zhǎng)有著重要的影響。在培養(yǎng)過(guò)程中模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)微環(huán)境是骨組織工程的發(fā)展的方向。電學(xué)環(huán)境和牽張力是骨生長(zhǎng)的重要微環(huán)境，對(duì)其中一個(gè)因素給細(xì)胞生長(zhǎng)造成的影響的研究已經(jīng)做了很多。單一的力學(xué)或電學(xué)刺激體外培養(yǎng)可以研究并控制單因素所造成的影響，但不能全面模擬體內(nèi)的環(huán)境影響。同時(shí)加載這兩個(gè)物理?xiàng)l件，能更加真實(shí)地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。下面對(duì)牽張力和電刺激對(duì)成骨細(xì)胞的影響做一下簡(jiǎn)要概述。1.1.1 力刺激對(duì)成骨細(xì)胞的影響在生理狀態(tài)下，骨組織為適應(yīng)機(jī)體活動(dòng)所需的物理支持而在不斷地改建和塑形，以滿足不同個(gè)體對(duì)動(dòng)作或姿勢(shì)的特殊要求，即使在骨骺閉合后，如果長(zhǎng)期暴露于某一特定的力學(xué)環(huán)境，仍可以出現(xiàn)骨骼的重塑形，使負(fù)重部位骨量增多。同樣，當(dāng)骨組織長(zhǎng)期失去正常的力學(xué)刺激，已礦化的骨骼也可以出現(xiàn)明顯的脫鈣、疏松，臨床上長(zhǎng)期臥床或制動(dòng)都可以導(dǎo)致相應(yīng)的部位出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。所以力學(xué)環(huán)境對(duì)骨組織相當(dāng)重要。體內(nèi)成骨細(xì)胞所處的力學(xué)環(huán)境極為復(fù)雜的，目前研究力學(xué)刺激對(duì)成骨細(xì)胞的作用的系統(tǒng)通常分為壓應(yīng)力系統(tǒng)、張應(yīng)力系統(tǒng)、流體剪切應(yīng)力系統(tǒng)和離心力培養(yǎng)系統(tǒng)。應(yīng)力加載作用于骨，會(huì)導(dǎo)致一系列的成骨效應(yīng)，比如最典型的新骨形成和骨的重塑19。1.1.2 電刺激對(duì)成骨細(xì)胞的影響活體骨總處在重建過(guò)程中，以適應(yīng)身體載荷的變化，骨受到應(yīng)力變形時(shí)，骨內(nèi)會(huì)產(chǎn)生電位，此電位稱為骨應(yīng)力產(chǎn)生電位。骨內(nèi)的骨應(yīng)力產(chǎn)生電位會(huì)產(chǎn)生壓電效應(yīng)和動(dòng)電現(xiàn)象。1、 壓電效應(yīng)日本學(xué)者Yasuda在20世紀(jì)50年代，提出了壓電效應(yīng)20，即骨在受力后，在相對(duì)兩個(gè)外表面上出現(xiàn)數(shù)量相等、符號(hào)相反的電荷，受壓的凹面出現(xiàn)負(fù)電位，產(chǎn)生新骨，張力的凸面呈正電位，出現(xiàn)骨質(zhì)吸收。20世紀(jì)60年代，Bassertt21等在測(cè)量濕骨的機(jī)電效應(yīng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在骨懸臂梁試驗(yàn)中，梁的壓縮側(cè)和拉身側(cè)分別為負(fù)電位和正負(fù)電位，這也說(shuō)明了骨的應(yīng)力和電位變化的密切關(guān)系。2、 動(dòng)電現(xiàn)象固體與液體處同一體系，固-液界面產(chǎn)生雙電層。液體流動(dòng)時(shí)，其中離子也同時(shí)流動(dòng)，從而在流動(dòng)方向的兩端產(chǎn)生電位差，稱為流動(dòng)電位。骨內(nèi)存在微管系統(tǒng)，骨和液體之間形成雙電層。骨受力形變，微管中體積縮小區(qū)域壓力增高，體積增加區(qū)域壓力降低，致使液體在微管中流動(dòng)，產(chǎn)生流動(dòng)電位。由于壓電效應(yīng)和動(dòng)電現(xiàn)象，對(duì)電、磁技術(shù)逐漸被應(yīng)用于骨科治療方面的研究越來(lái)越多。相應(yīng)的電刺激對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究也越來(lái)越多。1.1.3 電刺激形式目前，電刺激形式主要有三種：恒定直流電、脈沖直流電和脈沖電磁場(chǎng)，其它還有周圍神經(jīng)功能電刺激、旋磁場(chǎng)、駐極體等22。按裝置放置來(lái)分，可分為非侵入，半侵入和全侵入三種。侵入和非侵入都是針對(duì)治療部位而言的。1、 恒定直流電（Constant direct current） 此方法是根據(jù)壓電效應(yīng)的原理進(jìn)行的研究。王前等取兔脊髓基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，給予電流密度為100 A/cm2的直流電刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直流電刺激不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及分泌功能，還對(duì)成骨細(xì)胞的排列方向有一定的影響。研究認(rèn)為直流電刺激可通過(guò)引起細(xì)胞膜電位改變，鈣離子通透性增加，誘使細(xì)胞變形產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)。Fredericks23等建立了兔的L4-5缺失模型，用自體骨移植，同時(shí)附以直流電刺激。分別在實(shí)驗(yàn)的3、7、14、21、28 d處死兔，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，4，6，7，與對(duì)照組相比較，都有顯著升高。2、 脈沖電刺激（Pulse direct current）1972年，Trecharne經(jīng)體外試驗(yàn)認(rèn)為恒定直流電比脈沖直流電效果好。Brighton認(rèn)為只有當(dāng)脈沖電流有效值接近恒定直流電流，才能產(chǎn)生類似成骨能力。然王貴潤(rùn)31等采用微創(chuàng)小切口組合式外固定器手術(shù)后，利用脈沖電流刺激治療骨折，術(shù)后X線片顯示大部分2-3個(gè)月骨折線模糊，骨痂形成；5-6個(gè)月骨折達(dá)到骨性愈合，并得出結(jié)論：指出脈沖電流在骨斷端產(chǎn)生的電刺激能導(dǎo)致細(xì)胞再分化，使膠原纖維定向排列，刺激骨的愈合。3、 脈沖電磁場(chǎng)（Pulse electro-magnetic fields ）該法通過(guò)電感偶聯(lián)和電容偶聯(lián)產(chǎn)生脈沖電磁場(chǎng)，穿過(guò)肢體，在骨折部位又發(fā)電位。Li等24利用體外成骨細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)低頻脈沖電磁場(chǎng)能刺激成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1的釋放，此外，還可增加堿性磷酸酶活性。Adams25應(yīng)用脈沖電磁場(chǎng)治療舟骨骨折的總成功率為69%。Chang26等用15 Hz，0.1 mT ，20 V/m2的脈沖電磁場(chǎng)作用于鼠顱蓋骨細(xì)胞，分別在3，5，7，14 d檢測(cè)其增殖、分化、礦化和基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其增殖活性在3，5，7 d比對(duì)照組高分別為34%，11.5%，13.3%，礦化不受影響，堿性磷酸酶活性降低。1.1.11.1.21.1.31.1.4 電刺激對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)大量實(shí)驗(yàn)證明，微量電刺激可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖分化。鄒守平27等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脈沖電磁場(chǎng)作用后，成骨細(xì)胞DNA合成有明顯增加，細(xì)胞分裂加速，同時(shí)細(xì)胞凋亡比率下降，最后表現(xiàn)出細(xì)胞群體的快速增殖。Supronoxicz28將成骨細(xì)胞培養(yǎng)于導(dǎo)電聚合材料表面，施加10 A，10 Hz，6 h/d的電流刺激。2 d后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖數(shù)目比對(duì)照組多46% ，21 d后細(xì)胞外鈣離子濃度較對(duì)照組高307% ，培養(yǎng)過(guò)程中型膠原mRNA受體表達(dá)持續(xù)增高。任戰(zhàn)平等29將表面電極置于家兔雙側(cè)牙槽骨缺損處，采用20 A脈沖直流電進(jìn)行治療，表明微量電刺激可提高成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，使新生骨小梁出現(xiàn)早，連接情況好，骨缺損愈合加快。微電刺激還能增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)材料的黏附。王前30取兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，給予電流密度為100 A/cm2的直流電刺激，表明微量直流電刺激具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞黏附特性的作用；物質(zhì)表面帶陽(yáng)電荷時(shí)，可促進(jìn)成骨細(xì)胞與基質(zhì)材料間黏附。研究認(rèn)為直流電刺激可通過(guò)引起細(xì)胞膜電位改變，鈣離子通透性增加，誘使細(xì)胞變形產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)。Ferrier31記錄到成骨細(xì)胞在直接電流場(chǎng)中向陰極游動(dòng)，其長(zhǎng)軸于電流方向趨于一致，移動(dòng)速度約為320m/h。電刺激促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)因子合成和分泌。骨代謝和骨愈合是受多種因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，骨局部因子的調(diào)節(jié)作用是內(nèi)在因素之一。Witkowski32等發(fā)現(xiàn)電磁場(chǎng)可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞釋放胰島素樣生長(zhǎng)因子II（IGF-II）到培養(yǎng)基，而且可以增加細(xì)胞膜IGF-II受體的數(shù)目，兩者共同促進(jìn)細(xì)胞增殖。還有研究表明33，適當(dāng)強(qiáng)度及作用時(shí)間的電磁場(chǎng)刺激，能夠明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)。電刺激還能夠誘導(dǎo)其他細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在不同條件下可被誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞等34。I型膠原是成骨細(xì)胞表型和基質(zhì)鈣化的基礎(chǔ)，對(duì)培養(yǎng)的前成骨細(xì)胞施加電刺激可以促進(jìn)I型膠原的合成，從而介導(dǎo)廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)的合成，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化。還有實(shí)驗(yàn)表明低能量、低頻率的電場(chǎng)在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的同時(shí)，成骨細(xì)胞標(biāo)記物堿性磷酸酶活性增加，細(xì)胞外基質(zhì)成分合成分泌增加。電刺激還促進(jìn)了細(xì)胞向成骨分化，鈣結(jié)節(jié)的形成和成熟35。1.1.5 電刺激促進(jìn)成骨的作用機(jī)制應(yīng)用電刺激治療骨折延遲愈合和骨不連最早可追溯到19世紀(jì)，這說(shuō)明電刺激促進(jìn)成骨具有悠久的歷史。雖然已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)和臨床病例表明，適宜的不同形式的電刺激能夠誘導(dǎo)骨的生成，但是電刺激促進(jìn)成骨的機(jī)制目前尚不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。R.Koenstein36等發(fā)現(xiàn)電刺激能夠促進(jìn)骨細(xì)胞DNA的合成；也有研究表明，電刺激促進(jìn)組織與細(xì)胞的增殖，膠原的合成增加，cAMP聚集，使細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生某些特殊的改變。電刺激促進(jìn)成骨可能的作用機(jī)制有：（1）激活環(huán)腺苷酸(cAMP)37-38；（2）引起鈣離子內(nèi)流39；（3）改變生化微環(huán)境40；（4）改善局部血供41-42。目前，微量電刺激能促進(jìn)骨痂形成的觀點(diǎn)已被大量實(shí)驗(yàn)及臨床病例所證實(shí)，但尚缺乏定量研究以確定最佳的電流強(qiáng)度、密度和作用時(shí)間，具體機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。1.1.11.1.21.1.31.1.41.1.51.1.6 電刺激在骨組織工程中的應(yīng)用電刺激用于骨組織工程必將產(chǎn)生積極的作用。因?yàn)?，大量?shí)驗(yàn)證實(shí)電刺激對(duì)體外培養(yǎng)的成骨系細(xì)胞有促進(jìn)增殖，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，增加細(xì)胞與基質(zhì)材料的黏附性等作用;電刺激在治療骨不連，骨折延遲愈合方面的效果提示，電刺激可以啟動(dòng)骨的重建，加速骨的發(fā)育。電刺激在骨組織工程中可能的應(yīng)用有：1、 促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖大量的細(xì)胞是構(gòu)建組織工程骨的前提條件。目前，種子細(xì)胞的體外擴(kuò)增需要3周左右時(shí)間，如何使種子細(xì)胞大量、快速、優(yōu)質(zhì)擴(kuò)增是面臨的緊要問(wèn)題。在骨組織，電刺激可促進(jìn)成骨系細(xì)胞的生長(zhǎng)，激發(fā)DNA的合成，使大量的細(xì)胞從G1、G2期轉(zhuǎn)入S期，出現(xiàn)有絲分裂和細(xì)胞增殖。近年來(lái)采用旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(RCCS)模擬微重力環(huán)境能大規(guī)模體外擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，1周后細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量均比靜置培養(yǎng)的號(hào)，其原因是模擬了微重力環(huán)境。電學(xué)環(huán)境是骨生長(zhǎng)的重要微環(huán)境之一，如將微環(huán)境刺激應(yīng)用于新型生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和制造，在細(xì)胞體外培養(yǎng)模擬體內(nèi)的電學(xué)微環(huán)境，有可能促進(jìn)種子細(xì)胞快速、優(yōu)質(zhì)擴(kuò)增。2、 誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化組織工程骨的基本組成要素包括信號(hào)分子、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)43。型膠原是成骨細(xì)胞表型和基質(zhì)鈣化的基礎(chǔ)，對(duì)培養(yǎng)的前成骨細(xì)胞施加電刺激可以促進(jìn)型膠原的合成，從而介導(dǎo)廣泛細(xì)胞外基質(zhì)的合成，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 具有多向分化潛能，在不同條件下可被誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞等44，是骨組織工程常用的種子細(xì)胞。目前多采用化學(xué)試劑或生長(zhǎng)因子的方法誘導(dǎo)分化，而電刺激可以在促進(jìn)種子增殖的同時(shí)誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，為細(xì)胞的誘導(dǎo)分化提供新的思路和簡(jiǎn)潔有效的物理方法。實(shí)驗(yàn)表明，低能量、低頻率的電場(chǎng)不僅能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，還能夠就促進(jìn)標(biāo)記物堿性磷酸酶活性增加，鈣結(jié)節(jié)的形成和成熟45。3、 促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)材料的黏附細(xì)胞與骨基質(zhì)材料間的相互作用是骨組織工程研究的熱點(diǎn)之一，體外培養(yǎng)的細(xì)胞必須與支架材料黏附才能繼續(xù)增殖分化進(jìn)而成骨。直流電促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附的實(shí)驗(yàn)證明，在電場(chǎng)作用下，表面帶負(fù)電荷的成骨細(xì)胞向陽(yáng)極材料遷移，從而促進(jìn)早期黏附46。利用直流電刺激有望解決目前骨組織工程中細(xì)胞與支架材料黏附率不滿意這一難題。4、 促進(jìn)組織工程骨成熟電刺激作用于成骨細(xì)胞的不同時(shí)期可以產(chǎn)生不同的效應(yīng)，在成骨細(xì)胞的早期能促進(jìn)骨樣組織的形成，后期能加速礦化。Wiesmann47給予成骨細(xì)胞電場(chǎng)刺激，第7天開始礦化，第10天有小的、零星的礦化小結(jié)形成，第14天礦化區(qū)域占培養(yǎng)面積的10%50% ，第21天礦化區(qū)域超過(guò)50%。由此可見(jiàn)，電刺激應(yīng)用于組織工程骨培養(yǎng)的適當(dāng)階段可以促進(jìn)組織工程骨成熟。微電刺激在成骨應(yīng)用中取得了滿意的療效，對(duì)成骨系細(xì)胞的增殖，分化，黏附有明顯促進(jìn)作用，有利于種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)，能促進(jìn)骨樣組織的形成和成熟。1.2 課題研究意義體外組織構(gòu)建是組織工程學(xué)的核心，也是形成組織工程產(chǎn)業(yè)的必要的科學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)。而體外組織構(gòu)建的關(guān)鍵因素是盡可能模擬組織的體內(nèi)微環(huán)境以利于細(xì)胞、組織的三維培養(yǎng)和功能化。體內(nèi)微環(huán)境中除了各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞間相互作用、局部酸堿平衡以及神經(jīng)調(diào)節(jié)等生化影響因素外，應(yīng)力、電刺激等物理學(xué)刺激也是細(xì)胞生長(zhǎng)的重要影響因素。調(diào)控細(xì)胞、組織的功能化培養(yǎng)的特定物理因素的相關(guān)研究在近年來(lái)一直非常活躍。體內(nèi)各種組織和器官所處環(huán)境各異，所處微環(huán)境的物理影響因素主要包括應(yīng)力場(chǎng)、電場(chǎng)和磁場(chǎng)等。闡明這些因素的影響及作用機(jī)制，精確模擬體內(nèi)生理環(huán)境，從而優(yōu)化組織構(gòu)建技術(shù)，是組織工程研究面臨的挑戰(zhàn)，也是組織工程的發(fā)展方向之一。在用力學(xué)或電學(xué)刺激影響細(xì)胞生長(zhǎng)方面人們做了許多研究，這兩個(gè)因素在細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)中都起著非常重要的作用。而在體內(nèi)真實(shí)環(huán)境中，成骨細(xì)胞既受到力學(xué)又受到電學(xué)刺激，單研究其中一個(gè)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響還不夠完整。力學(xué)或電學(xué)刺激體外培養(yǎng)可以研究并控制單因素所造成的影響，但不能全面模擬體內(nèi)的環(huán)境影響。同時(shí)加載這兩個(gè)物理?xiàng)l件，能更加真實(shí)地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。因此，本課題將通過(guò)力電聯(lián)合刺激模擬體內(nèi)生理環(huán)境，研究力、電兩種刺激共同作用對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的影響，從而促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)及組織構(gòu)建技術(shù)。力電聯(lián)合刺激的新型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可為將來(lái)在生物反應(yīng)器中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考，為組織工程學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展提供新的思路，具有重要的研究意義。本課題擬以C57BL6乳鼠源性的前成骨細(xì)胞MC3T3-E1為研究對(duì)象，在體外培養(yǎng)過(guò)程中，同時(shí)加載力學(xué)刺激和電學(xué)刺激，研究剪切應(yīng)力和電刺激聯(lián)合作用對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。期待同時(shí)加載這兩個(gè)物理?xiàng)l件，能更加真實(shí)地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)自行設(shè)計(jì)的牽張、電聯(lián)合刺激裝置對(duì)MC3T3-E1進(jìn)行刺激，比較牽張或（和）電刺激對(duì)于細(xì)胞分化的影響，探究聯(lián)合刺激對(duì)于細(xì)胞的分化是否具有進(jìn)一步的促進(jìn)作用。2.1 研究?jī)?nèi)容1、 牽張刺激加載實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及牽張刺激加載：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)在-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，同步化生長(zhǎng)后，調(diào)整濃度為2105/mL，接種至硅膠膜上，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下以10FBS的-MEM培養(yǎng)液孵育3h后，加載牽張刺激（5%、10%、15%，根據(jù)硅膠膜長(zhǎng)度確定拉伸值分別為0.375cm、0.750cm、0.800cm），加載12h后收取細(xì)胞樣品。2、 電刺激加載實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及電刺激加載：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)在-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，同步化生長(zhǎng)后以2105/mL接種至硅膠膜3h之后加載電刺激，各組加載不同大小的電壓（50 mV、100 mV），脈沖寬度0.4ms，頻率為20Hz，每小組處理12h后收取細(xì)胞樣品。3、 牽張、電聯(lián)合刺激加載實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及聯(lián)合刺激加載：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)在-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，同步化生長(zhǎng)后分別2105/mL濃度接種于硅膠膜上，培養(yǎng)3h后，進(jìn)行牽張刺激和電刺激的聯(lián)合刺激加載。實(shí)驗(yàn)刺激參數(shù)取上述實(shí)驗(yàn)中能使ALP mRNA達(dá)到最大表達(dá)量的參數(shù)值。4、 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶（ALP）mRNA的檢測(cè)1 2 3 實(shí)驗(yàn)材料3.1 主要設(shè)備電刺激牽張刺激圖1. 1 牽張與電聯(lián)合刺激裝置潔凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司恒溫水浴箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo公司-80超低溫冰箱美國(guó)Thermo公司冰箱青島海爾集團(tuán)高壓滅菌器日本ALP公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司低速離心機(jī)德國(guó)Hermle公司低溫高速離心機(jī)德國(guó)eppendorf公司PCR儀德國(guó)eppendorf公司電泳儀北京市六一儀器廠電泳槽北京市六一儀器廠凝膠成像儀上海Tanon公司信號(hào)發(fā)生器美國(guó)Tektronix公司硅膠膜2mm厚度硅膠材料裁剪3.2 主要試劑-MEM培養(yǎng)基Hyclone公司小牛血清天津康源生物技術(shù)有限公司胰酶干粉美國(guó)Amresco公司Trizol試劑Life Technologies公司氯仿北京化工廠異丙醇北京化工廠乙醇北京化工廠dNTP MixTaKaRa公司Random PrimerTaKaRa公司M-MulvTaKaRa公司DNA MakerTaKaRa公司瓊脂糖粉末Biowest公司3.3 主要試劑配制1、 0.01mol/L PBS平衡鹽溶液：1000ml超純水中溶解0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀、2.9g磷酸氫二鈉和8.0g氯化鈉，充分混勻后分裝，高壓下蒸汽滅菌20min，4保存。2、 0.25%胰酶：100ml雙蒸水中溶解0.25g胰酶粉和0.1gEDTA，用無(wú)菌除菌濾器將培養(yǎng)液的溶液抽入瓶中并分裝（0.22m濾膜過(guò)濾除菌)，-20保存。3、 50TAE：稱量Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g 于1L燒杯中，加入57.1ml的冰乙酸，再定容到1L，室溫保存即可，用時(shí)稀釋50倍。4、 胎牛血清的滅活：胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）已滅菌，用前需要熱滅活，水浴56 30min，分裝成20mL/瓶，-20儲(chǔ)存?zhèn)溆谩? 2 3 4 實(shí)驗(yàn)方法4.1 細(xì)胞培養(yǎng)4.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇首先準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材（包括實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)的紫外消毒，實(shí)驗(yàn)器材的高壓滅菌等）后，將凍存的細(xì)胞從液氮中取出，在37水浴鍋中使其迅速融化；然后將含有細(xì)胞的凍存液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，加入2-3倍體積的新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基800rpm離心5min；棄去上清液，用新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸離心得到的細(xì)胞；將重懸液加入到事先已經(jīng)加入4-5mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.1.14.1.2 細(xì)胞傳代細(xì)胞的傳代應(yīng)選對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞。準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)器材后，取出恒溫培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞一次；加入0.25%胰酶消化直至貼壁細(xì)胞變圓，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化后輕輕吹打，使貼壁細(xì)胞從壁上脫落，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基吸出轉(zhuǎn)移至15mL離心管1000rpm離心3min收集細(xì)胞；棄去上清后加入1mL新鮮培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，計(jì)算傳代所用細(xì)胞懸液體積，用移液器取出相應(yīng)體積細(xì)胞懸液后將其加入到事先已經(jīng)加入4-5mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.14.2 牽張力與電刺激加載小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1培養(yǎng)于-MEM培養(yǎng)基，置于含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。經(jīng)過(guò)復(fù)蘇、換液、傳代培養(yǎng)將MC3T3-E1狀態(tài)調(diào)制最佳，實(shí)驗(yàn)備用。4.2.1 牽張刺激加載實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及牽張刺激加載：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)在-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，同步化生長(zhǎng)后，調(diào)整濃度為2105/mL，接種至硅膠膜上，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下以10FBS的-MEM培養(yǎng)液孵育3h后，加載牽張刺激（5%、10%、15%，根據(jù)硅膠膜長(zhǎng)度確定拉伸值分別為0.375cm、0.750cm、0.800cm），加載12h后收取細(xì)胞樣品。4.2.14.2.2 電刺激加載實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及電刺激加載：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)在-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，同步化生長(zhǎng)后以2105/mL接種至硅膠膜3h之后加載電刺激，各組加載不同大小的電壓（50 mV、100 mV），脈沖寬度0.4ms，頻率為20Hz，每小組處理12h后收取細(xì)胞樣品。4.2.3 牽張電聯(lián)合刺激加載實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及聯(lián)合刺激加載：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)在-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，同步化生長(zhǎng)后分別2105/mL濃度接種于硅膠膜上，培養(yǎng)3h后，進(jìn)行牽張刺激和電刺激的聯(lián)合刺激加載。實(shí)驗(yàn)刺激參數(shù)取上述實(shí)驗(yàn)中能使ALP mRNA達(dá)到最大表達(dá)量的參數(shù)值。4.14.24.3 RT-PCR方法檢測(cè)堿性磷酸酶mRNA的表達(dá)4.3.1 提取胞內(nèi)總RNAMC3T3-E1細(xì)胞在不同刺激條件下培養(yǎng)結(jié)束后，去掉培養(yǎng)液，PBS潤(rùn)洗三次，加入1 ml濃度為0.25%胰蛋白酶室溫消化貼壁細(xì)胞2分鐘，800 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，去除上清液，TRIzol法提取胞內(nèi)總RNA，具體操作步驟如下：(1) 1106個(gè)MC3T3細(xì)胞加入1 ml TRIzol，用200l移液器槍頭對(duì)細(xì)胞反復(fù)吹打，勻漿處理；(2) 勻漿樣品顛倒混勻10次，在室溫（1530）放置5分鐘；(3) 加入1/5體積氯仿（即200l），顛倒混勻15 s，在室溫（1530）放置5分鐘；(4) 4 ，12000 rpm離心15分鐘，取上層水相（大約400600l）轉(zhuǎn)移至去RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇；(5) 樣品顛倒混勻，在室溫（1530 ）放置10分鐘；(6) 4 ，12000 rpm離心10分鐘，棄上清；(7) 加入1 ml濃度為75%（v/v，DEPC水配制，冰預(yù)冷）的乙醇洗滌RNA沉淀；(8) 4 ，7500 rpm離心5分鐘，棄上清。在空氣中干燥5分鐘，加入20 l DEPC水（60 預(yù)熱）溶解RNA，測(cè)定所得RNA濃度。4.3.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）(1) 用Oligo d(T)和Super Script II進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在0.2 ml去RNA酶離心管中按表4.1配制模板RNA/引物混合物；(2) 70保溫10分鐘后迅速在冰上急冷2 min以上，離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物的變性溶液聚集于離心管底部，在上述離心管中按表4.2配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；(3) 配完后在42保溫1 h，70 oC保溫15 min后迅速在冰上冷卻，得到cDNA溶液用于PCR擴(kuò)增；(4) 以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，按表4.3組成配制PCR反應(yīng)液，全量30 l，以GAPDH為內(nèi)參。PCR時(shí)所用引物序列，退火溫度及目的基因片段長(zhǎng)度如表4.4所示。對(duì)特定基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測(cè)，步驟如下：(1) 94，5 min；(2) 共進(jìn)行35個(gè)熱循環(huán)，每循環(huán)為94 30s，58 30s，72 30s；(3) 最后72 10 min，4保存。 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠影像分析系統(tǒng)觀察電泳條帶并拍照，用BandScan軟件對(duì)電泳結(jié)果的條帶灰度進(jìn)行分析。對(duì)同一塊瓊脂糖凝膠上的電泳條帶，用同樣面積的選框選定，分析所選區(qū)域的直方圖并求出平均灰度值，將各基因條帶的平均灰度值與相應(yīng)的GAPDH條帶灰度值做比，獲得各基因表達(dá)水平的變化。表4. 1反轉(zhuǎn)錄模板RNA/引物混合物的配制試劑名稱使用量Total RNA1g（5g）Oligo d(T)18 PrimersdNTP Mix(10mM each)0.5g (1l)1lRNase free H2OlTotal Volume12l表4. 2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的配制試劑名稱使用量上述模板RNA/引物變性溶液12l5First Strand Buffer4l0.1M DTT2lRnaseOUT(40units/l)1lSuperScript RT 1l(200 units)Total Volume20l表4. 3 PCR反應(yīng)液的配置試劑名稱使用量Distilled water10PCR Buffer(10mM)dNTP Mixturetemplate (cDNA溶液)l3l0.6l2l (0.1-0.5g)Forward primer(10M)2l (1 or 2l)Reverse primer(10M)2l (1 or 2l)Taq DNA Polymerase(5U/l)0.4lTotal Volume30l(可根據(jù)需要變動(dòng))表4. 4 PCR引物，退火溫度及目的基因片度長(zhǎng)度目的基因引物序列擴(kuò)增長(zhǎng)度退火溫度ALPSense: 5- TGT CTG GAA CCG CAC TGA ACT -3Anti-sense: 5- CCG ATT CAA TTC ATA CTG CAT GTC -3100bp50-55GAPDHSense: 5- CGT GCC GCC TGG AGA AAC CTG -3Anti-sense: 5- AGA GTG GGA GTT GCT GTT GAA GTC G -3140bp55-604.3.3 凝膠配置方法40 mL 1TAE + 0.6 g 瓊脂置于100 mL燒瓶中，保鮮膜或者錫紙封口，開小孔，微波爐中火，2 min；冷卻至60攝氏度，加EB（溴化乙錠）2 L，振蕩混勻；倒入干凈的電泳槽中，40 min 后加樣，開始電泳。3 4 5 數(shù)據(jù)處理5.1 RT-PCR圖片處理對(duì)照組 5% 10% 15%GAPDHALP(1) 利用ACDsee從原始圖片中截取含有DNA條帶的片段。圖 5. 1 凝膠電泳圖(1) (2) 利用BandScan軟件分別提取ALP條帶和GAPDH條帶的灰度值。圖 5. 2 使用BandScan提取灰度(3) 利用Excel表格計(jì)算兩個(gè)條帶灰度值的比值。(4) 利用Excel做單因素方差分析，觀察顯著性水平（其中n=3，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義由*P0.05，*P0.01來(lái)指定）。(5) 利用作Execel對(duì)所有的比值數(shù)據(jù)作圖，并在圖中標(biāo)記好顯著性水平。圖 5. 3 不同程度力刺激對(duì)ALP基因表達(dá)的影響1 2 3 4 5 6 結(jié)果及分析MC3T3-E1細(xì)胞在不同刺激條件下培養(yǎng)12 h后，消化并離心收集細(xì)胞，TRIzol法提取胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用ALP的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)源性參照基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳，BandScan 軟件分析電泳條帶的灰度值，考察不同刺激培養(yǎng)后ALP mRN