沉淀反應(yīng)課件

沉淀反應(yīng)（precipitationreaction)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗可溶性抗原+相應(yīng)抗體

肉眼可見的沉淀

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)液（毒素）與相應(yīng)抗血清混合出現(xiàn)沉淀1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其中，發(fā)現(xiàn)沉淀反應(yīng)可在凝膠中進行1946年Oudin報告了試管免疫擴散技術(shù)1965年Mancini提出單向免疫擴散技術(shù)，使定性免疫試驗向定量化發(fā)展免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉淀反應(yīng)達到快速、微量、自動化的新階段。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

根據(jù)沉淀反應(yīng)的介質(zhì)和檢測方法的不同,沉淀反應(yīng)可分為:

液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)凝膠內(nèi)的沉淀反應(yīng)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第一節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗根據(jù)沉淀現(xiàn)象的不同，液體內(nèi)沉淀又可分為三類：絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗一、絮狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗是一項經(jīng)典實驗技術(shù)。曾用于測定梅毒抗體的Kahn試驗是絮狀沉淀的代表試驗，現(xiàn)今已被更簡便而敏感的USR或RPR方法替代。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(一)原理抗原溶液與相應(yīng)抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。絮狀沉淀易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測定的基本方法。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗2.抗體稀釋法

本法采用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應(yīng)，出現(xiàn)沉淀物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結(jié)合，可一次完成抗原和抗體的滴定并找出抗原、抗體的最適比。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(三)方法評價

絮狀沉淀試驗方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測定抗原抗體反應(yīng)的最適比。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗二、環(huán)狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀(ringprecipitation)試驗是由Ascoli于1902年建立的一種經(jīng)典的血清學(xué)定性試驗。用非常簡便的技術(shù)了解待測血清內(nèi)是否存在某種抗原或抗體。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗體溶液的細試管液面上。當對應(yīng)的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環(huán)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(二)操作步驟1.用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管(內(nèi)徑約1.5~2mm)底部，避免產(chǎn)生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。

3.置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(三)方法評價

該試驗是經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)之一，簡便、快速、實用。故用于鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗)。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對含有多個抗原抗體對的反應(yīng)系統(tǒng)缺乏分辨力。方法難以推廣。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

三、免疫濁度試驗經(jīng)典的免疫沉淀試驗是抗原和相應(yīng)抗體在反應(yīng)終點時判定結(jié)果，方法有耗時、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動化等缺點。70年代以來，根據(jù)抗原和抗體所在液相內(nèi)快速結(jié)合并產(chǎn)生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術(shù)，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動化分析儀器來完成。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復(fù)合物(IC)，當光線透過反應(yīng)溶液時，由于溶液內(nèi)復(fù)合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復(fù)合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復(fù)合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線，可測出待檢抗原含量。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗2.操作步驟(1)用稀釋緩沖液將待檢樣品和標準品按規(guī)定稀釋，取一定量加至測定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預(yù)先滴定)的抗體，孵育一定時間，測定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標準曲線。從標準曲線可得待檢抗原量。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗3.方法評價

敏感度高于單相瓊脂擴散試驗5~10倍，批內(nèi)、批間重復(fù)性較好，變異系數(shù)<10%，操作簡便快速，1h可報告結(jié)果。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(二)散射比濁法散射光系指一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復(fù)合物，光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，這種偏轉(zhuǎn)的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強度與復(fù)合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成復(fù)合物越多，散射光強度越強。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點散射比濁法(endpointnephelometry)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定法。所謂速率是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)過程中，在單位時間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率法是測定最大反應(yīng)速率，即在抗原抗體反應(yīng)達最高峰時，通常為數(shù)十秒鐘，測定其復(fù)合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關(guān)。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標準品加至試管內(nèi)，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標準品含量為橫坐標，RU值為縱坐標，于普通坐標紙上繪制標準曲線。根據(jù)待測抗原RU值，查出相應(yīng)抗原含量。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(3)方法評價：

檢測不必等到抗原抗體反應(yīng)達到平衡，大大節(jié)約反應(yīng)時間，每小時可檢測數(shù)十份標本；敏感度高，最小檢出量達μg/L水平。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗2.終點散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時間，使其反應(yīng)達到平衡后，測定其復(fù)合物的量。復(fù)合物的濁度不再受時間的影響，但反應(yīng)復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前(大約反應(yīng)數(shù)十分鐘)進行濁度測定。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標準品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標準品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時間，比濁。3)以抗原標準品量為橫坐標，濁度值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(3)方法評價：

敏感度達mg/L水平，可自動化，但反應(yīng)時間較長

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應(yīng)抗原時，則發(fā)生凝集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗2.操作步驟1)用稀釋液將待測抗原和抗原標準品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測抗原、不同濃度的抗原標準品反應(yīng)一段時間，測吸光度值。3)以抗原標準品量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，查出待測抗原量。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗3.方法評價

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應(yīng)液中無PEC沉淀劑的影響，個體IC對結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(gelphaseprecipitation)主要是指瓊脂糖擴散或稱凝膠擴散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。根據(jù)實驗?zāi)康呐c方法不同，可將固相內(nèi)沉淀驗分為3類：①雙相瓊脂擴散試驗(doublegeldiffusiontest)，②單相瓊脂擴散試驗(singlegeldiffusiontest)，③凝膠免疫電泳(gelimmunoelec-trophoresis)。這是一項凝膠內(nèi)電泳加擴散技術(shù)，專門一章介紹。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗一、單相瓊脂擴散試驗(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質(zhì)在凝膠中自由擴散，與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(二)操作步驟1.將抗體和0.9%瓊脂糖50~56℃混合，即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔，孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標準品溶液。3.置37℃，讓其向四周自由擴散，24~48h后可見其孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗單向免疫擴散試驗示意圖

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

沉淀環(huán)的直徑與待檢標本內(nèi)含量不是直線關(guān)系，有兩種計算方法：(1)Mancini曲線：適用于大分子抗原，擴散時間>48h，使用普通坐標紙作圖，擴散環(huán)直徑平方和濃度呈線性關(guān)系。(2)Fehcy曲線：適用于分子抗原，擴散時間較短，使用半對數(shù)坐標紙作圖，抗原量的對數(shù)和擴散圈直徑之間呈線性關(guān)系。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

雙免疫擴散試驗（doubleimmunodiffusion）

雙向免疫擴散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗雙向免疫擴散試驗示意圖

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第三節(jié)免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點，一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細微的分析。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗免疫電泳包括:

免疫電泳對流免疫電泳火箭電泳免疫印跡等

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗一）、免疫電泳

免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙向擴散的結(jié)合。方法是先將樣品加入瓊脂中利用區(qū)帶電泳技術(shù)將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，于槽內(nèi)加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應(yīng)抗體進行雙向免疫擴散，可形成多條弧形沉淀線。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

常用此法進行血清的蛋白種類分析。對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗二）、對流免疫電泳

對流免疫電泳實質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴散技術(shù)，其基本原理是：將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復(fù)合物的沉淀線。只需1小時左右即可觀察結(jié)果。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗對流電泳示意圖

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗三）、火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實質(zhì)上是加速度的單向擴散。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

方法：在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標本后，將抗原置陰極端，用橫距2～3mA/cm的電流強度進行電泳?？乖鞠蜿枠O，在抗原抗體比例恰當處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭?？贵w濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標本中的抗原含量。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

火箭電泳圖①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗四）免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western-blot

應(yīng)用舉例：用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第一步：經(jīng)電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第二步：將已分離的抗原經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現(xiàn)第二抗體

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗下次課內(nèi)容:

凝集反應(yīng)時間:2002/3

教員:毛旭虎

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗?zāi)磻?yīng)（agglutination)毛旭虎醫(yī)學(xué)檢驗系臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室二OO二年三月

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖?，當與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原與抗體結(jié)合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(yīng)（agglutination）。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗1896年，Widal就利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集的現(xiàn)象，有效地診斷傷寒病。

1900年，Landsteriner在特異性血凝現(xiàn)象的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了人ABO血型，并于1930年獲得了諾貝爾獎。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗?zāi)磻?yīng)可分為：

直接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗一）直接凝集反應(yīng)

細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒抗原，在適當電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)（directagglutination）。凝集反應(yīng)中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗全稱為凝集素（agglutinin）。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗玻片法：

ABO血型的鑒定試管法：肥達試驗（Widaltest）---傷寒

外斐試驗（Weil-Felixtest）---立克次體

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗二）間接凝集反應(yīng)

將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小的顆粒性載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜