RNA干擾SATB1基因：解鎖乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的分子奧秘

RNA干擾SATB1基因：解鎖乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的分子奧秘一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌作為全球女性發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康與生活質(zhì)量。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在我國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位，且呈逐年上升趨勢(shì)，2014年中國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率為21.62/10萬(wàn)，死亡率為4.75/10萬(wàn)。而在全球范圍內(nèi)，每分鐘就有4名女性被確診患有乳腺癌、1名女性因該疾病去世，形勢(shì)不容樂(lè)觀。盡管目前乳腺癌的治療手段眾多，包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是乳腺癌治療面臨的主要難題。一旦乳腺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率將顯著降低，嚴(yán)重影響其預(yù)后。乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源在于乳腺癌干細(xì)胞的存在。乳腺癌干細(xì)胞是乳腺癌腫瘤中一小部分具有自我更新和再分化能力的癌細(xì)胞，它們與乳腺癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及對(duì)化療和放療的抵抗性密切相關(guān)。乳腺癌干細(xì)胞能夠在治療過(guò)程中存活下來(lái)，并重新啟動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)，導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)和惡化。深入研究乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性和相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)于揭示乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效的治療策略具有重要意義。Wnt信號(hào)通路在乳腺癌干細(xì)胞的維持、增殖和分化等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該信號(hào)通路的異常激活與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥性密切相關(guān)。當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，最終調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。在乳腺癌干細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路的持續(xù)激活能夠維持其干細(xì)胞特性，促進(jìn)其自我更新和增殖，同時(shí)抑制其分化，使得乳腺癌干細(xì)胞能夠逃避常規(guī)治療，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。對(duì)Wnt信號(hào)通路的研究，有望為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。富含AT序列的特異結(jié)合蛋白1（SATB1）是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)序列特異性結(jié)合蛋白，參與染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和組織特異性基因的表達(dá)調(diào)控，在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，SATB1在乳腺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與乳腺癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。SATB1可以通過(guò)調(diào)控一系列基因的表達(dá)，影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為。然而，SATB1對(duì)乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響及其分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默SATB1基因，探討其對(duì)乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響，揭示SATB1在乳腺癌干細(xì)胞中的作用機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。研究成果有望為開(kāi)發(fā)針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的靶向治療策略提供重要的參考，為改善乳腺癌患者的預(yù)后帶來(lái)新的希望。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乳腺癌干細(xì)胞的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列重要成果。國(guó)外研究團(tuán)隊(duì)如[具體團(tuán)隊(duì)1]通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，深入分析了乳腺癌干細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與干細(xì)胞特性相關(guān)的關(guān)鍵基因，為乳腺癌干細(xì)胞的鑒定和靶向治療提供了新的分子標(biāo)志物。[具體團(tuán)隊(duì)2]則利用小鼠模型，研究了乳腺癌干細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制，揭示了乳腺癌干細(xì)胞通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在國(guó)內(nèi)，[具體團(tuán)隊(duì)3]通過(guò)建立乳腺癌患者來(lái)源的類器官模型，成功地富集和培養(yǎng)了乳腺癌干細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了詳細(xì)研究，為乳腺癌干細(xì)胞的研究提供了更接近臨床實(shí)際的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀ｊP(guān)于Wnt信號(hào)通路，其在胚胎發(fā)育、組織再生和疾病發(fā)病機(jī)制等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在國(guó)外，[具體團(tuán)隊(duì)4]解析了Wnt信號(hào)通路中FZD/DVL復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了FZDs與DVL結(jié)合的通用機(jī)制，即Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑的分子機(jī)制，為理解Wnt信號(hào)途徑激活的機(jī)制和相關(guān)藥物設(shè)計(jì)提供了重要依據(jù)。[具體團(tuán)隊(duì)5]通過(guò)基因編輯技術(shù)，敲除小鼠體內(nèi)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵基因，研究其對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路的異常激活可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。國(guó)內(nèi)方面，[具體團(tuán)隊(duì)6]利用3D生物打印技術(shù)，在體外構(gòu)建了具有正常功能的人類心臟器官模型，并通過(guò)激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，成功誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為功能性房室結(jié)細(xì)胞，為Wnt信號(hào)通路在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供了新的思路。對(duì)于SATB1基因，國(guó)外[具體團(tuán)隊(duì)7]研究發(fā)現(xiàn)SATB1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且其高表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。[具體團(tuán)隊(duì)8]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)SATB1可以通過(guò)調(diào)控一系列基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。國(guó)內(nèi)[具體團(tuán)隊(duì)9]對(duì)SATB1在甲狀腺癌中的表達(dá)及功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)SATB1與甲狀腺癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，其高表達(dá)具有促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的作用，PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了SATB1的促轉(zhuǎn)移過(guò)程。然而，目前關(guān)于RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路影響的研究仍存在不足。雖然已有研究表明SATB1與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Wnt信號(hào)通路在乳腺癌干細(xì)胞中也發(fā)揮著重要作用，但二者之間的具體聯(lián)系及分子機(jī)制尚未完全明確。在已有的研究中，針對(duì)SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響，缺乏系統(tǒng)的、深入的研究。多數(shù)研究?jī)H停留在細(xì)胞水平的初步探索，對(duì)于其在體內(nèi)的作用機(jī)制以及與其他信號(hào)通路的相互作用等方面的研究還較為匱乏。此外，目前的研究方法和技術(shù)也存在一定的局限性，難以全面、準(zhǔn)確地揭示SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。因此，深入研究RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響，具有重要的理論和實(shí)際意義，有望為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響，揭示SATB1在乳腺癌干細(xì)胞中的作用機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：構(gòu)建SATB1-shRNA慢病毒表達(dá)載體并篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株：依據(jù)RNA干擾技術(shù)原理，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SATB1基因的小發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆至慢病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建SATB1-shRNA慢病毒表達(dá)載體。隨后，利用該載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)SATB1-shRNA的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。在此過(guò)程中，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中SATB1基因和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以確保干擾效果的有效性。此部分研究?jī)?nèi)容是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，穩(wěn)定的干擾細(xì)胞株能夠?yàn)樯钊胙芯縎ATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞的影響提供可靠的實(shí)驗(yàn)材料。通過(guò)構(gòu)建和篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)SATB1基因的持續(xù)干擾，從而更準(zhǔn)確地觀察其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。分選乳腺癌干細(xì)胞并鑒定：從乳腺癌細(xì)胞系或乳腺癌組織中，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)或磁珠分選技術(shù)，依據(jù)乳腺癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物（如CD44+/CD24-），分選出乳腺癌干細(xì)胞。接著，采用成球?qū)嶒?yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等方法，對(duì)分選得到的乳腺癌干細(xì)胞的自我更新能力、增殖能力和致瘤能力進(jìn)行鑒定。明確乳腺癌干細(xì)胞的特性，能夠?yàn)楹罄m(xù)研究提供精準(zhǔn)的研究對(duì)象，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過(guò)分選和鑒定乳腺癌干細(xì)胞，可以獲得高純度的干細(xì)胞群體，便于深入研究其生物學(xué)特性和相關(guān)信號(hào)通路。檢測(cè)RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響：將SATB1-shRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌干細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體或未轉(zhuǎn)染的乳腺癌干細(xì)胞）。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因（如Wnt1、β-catenin、TCF4等）的mRNA表達(dá)水平變化；運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白（如Wnt1、β-catenin、p-β-catenin、TCF4等）的表達(dá)水平變化；采用免疫熒光染色技術(shù)觀察β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的定位變化。全面了解RNA干擾SATB1基因后，Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)及定位變化，有助于揭示SATB1基因?qū)nt信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)多種技術(shù)手段的綜合運(yùn)用，可以從不同層面深入研究SATB1基因?qū)nt信號(hào)通路的影響，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制提供有力的證據(jù)。檢測(cè)RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞生物學(xué)行為的影響：通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU法）檢測(cè)干擾SATB1基因后乳腺癌干細(xì)胞的增殖能力變化；利用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（如Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)）和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（如Matrigel包被的Transwell小室實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)其遷移和侵襲能力變化；采用細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化；通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)其自我更新能力的變化。深入了解RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞生物學(xué)行為的影響，能夠明確SATB1基因在乳腺癌干細(xì)胞中的功能，為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。通過(guò)對(duì)乳腺癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的全面檢測(cè)，可以直觀地反映出SATB1基因?qū)ζ涞挠绊懀瑸檫M(jìn)一步研究其作用機(jī)制和開(kāi)發(fā)治療策略提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。探討RNA干擾SATB1基因影響乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制：基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證SATB1與Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合作用；通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SATB1在Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因染色質(zhì)上的結(jié)合情況；利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)（如免疫共沉淀、GSTpull-down實(shí)驗(yàn)）探究SATB1與Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白之間的相互作用。深入揭示RNA干擾SATB1基因影響乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制，為乳腺癌的治療提供更深入的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。通過(guò)多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的聯(lián)合應(yīng)用，可以從分子層面深入剖析SATB1基因?qū)nt信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，為開(kāi)發(fā)有效的治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從細(xì)胞和分子水平深入探究RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響，具體研究方法如下：RNA干擾技術(shù)：依據(jù)RNA干擾的原理，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SATB1基因的小發(fā)夾RNA（shRNA）序列。通過(guò)將shRNA序列克隆至慢病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建SATB1-shRNA慢病毒表達(dá)載體。該技術(shù)能夠特異性地降解SATB1基因的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SATB1基因表達(dá)的有效干擾，為后續(xù)研究提供穩(wěn)定的干擾細(xì)胞模型。慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)：利用慢病毒作為載體，將構(gòu)建好的SATB1-shRNA慢病毒表達(dá)載體導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞中。慢病毒具有高效感染、穩(wěn)定整合到宿主基因組等優(yōu)點(diǎn)，能夠確保shRNA在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)SATB1基因的長(zhǎng)期干擾。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)：提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板，利用特異性引物對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因（如Wnt1、β-catenin、TCF4等）的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，可以準(zhǔn)確地定量分析基因表達(dá)量的變化，為研究RNA干擾SATB1基因?qū)nt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響提供數(shù)據(jù)支持。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)：提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白（如Wnt1、β-catenin、p-β-catenin、TCF4等）的表達(dá)水平。Westernblot技術(shù)能夠從蛋白質(zhì)水平直觀地反映出相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化，有助于深入了解RNA干擾SATB1基因?qū)nt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。免疫熒光染色技術(shù)：將細(xì)胞固定在載玻片上，用特異性抗體標(biāo)記β-catenin，通過(guò)熒光顯微鏡觀察β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的定位變化。免疫熒光染色技術(shù)可以直觀地展示β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，為研究Wnt信號(hào)通路的激活狀態(tài)提供重要信息。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法、EdU法）：CCK-8法是利用細(xì)胞增殖時(shí)線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有顏色的甲瓚產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物的吸光度值來(lái)反映細(xì)胞的增殖情況；EdU法是將EdU（一種胸腺嘧啶核苷類似物）加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，EdU能夠在細(xì)胞DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中，通過(guò)熒光染色檢測(cè)EdU的摻入情況，從而反映細(xì)胞的增殖活性。這兩種方法能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)干擾SATB1基因后乳腺癌干細(xì)胞的增殖能力變化。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)）和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Matrigel包被的Transwell小室實(shí)驗(yàn)）：Transwell小室實(shí)驗(yàn)是將細(xì)胞接種在上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細(xì)胞會(huì)向趨化因子濃度高的方向遷移或侵襲，通過(guò)計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力；劃痕實(shí)驗(yàn)是在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞向劃痕處遷移的情況，以此來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力；Matrigel包被的Transwell小室實(shí)驗(yàn)則是在上室底部預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，檢測(cè)細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的能力，從而評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。這些實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^地反映干擾SATB1基因后乳腺癌干細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法）：AnnexinV-FITC/PI雙染法是利用AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，PI能夠?qū)乃兰?xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞比例，從而區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞；TUNEL法是利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶將生物素或地高辛等標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂的DNA3'-OH末端，再通過(guò)與標(biāo)記物特異性結(jié)合的熒光素或酶底物顯色，從而檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。這兩種方法能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)干擾SATB1基因后乳腺癌干細(xì)胞凋亡率的變化。成球?qū)嶒?yàn)：將乳腺癌干細(xì)胞接種在低吸附培養(yǎng)板中，加入含有生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察細(xì)胞形成乳腺球的能力。成球?qū)嶒?yàn)?zāi)軌蛑苯臃从橙橄侔└杉?xì)胞的自我更新能力，通過(guò)比較干擾SATB1基因前后細(xì)胞成球的數(shù)量和大小，可評(píng)估SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞自我更新能力的影響。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建含有Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因載體，與SATB1表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性，驗(yàn)證SATB1與Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合作用，從而明確SATB1對(duì)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)：利用抗體特異性地結(jié)合并沉淀目標(biāo)蛋白-DNA復(fù)合物，然后對(duì)沉淀下來(lái)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增或測(cè)序分析，檢測(cè)SATB1在Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因染色質(zhì)上的結(jié)合情況，進(jìn)一步驗(yàn)證SATB1與Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的相互作用。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)（免疫共沉淀、GSTpull-down實(shí)驗(yàn)）：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是利用抗體將與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)一起沉淀下來(lái)，通過(guò)Westernblot檢測(cè)沉淀中的蛋白質(zhì)，從而確定蛋白質(zhì)之間的相互作用；GSTpull-down實(shí)驗(yàn)是將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白與目標(biāo)蛋白在體外孵育，利用GST與谷胱甘肽親和柱的特異性結(jié)合，將與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)分離出來(lái)，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡或質(zhì)譜分析鑒定相互作用的蛋白質(zhì)。這兩種實(shí)驗(yàn)方法能夠深入探究SATB1與Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系。技術(shù)路線圖展示了本研究的整體實(shí)驗(yàn)流程（見(jiàn)圖1）。首先，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SATB1基因的shRNA序列，構(gòu)建SATB1-shRNA慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)SATB1-shRNA的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。接著，從乳腺癌細(xì)胞系或乳腺癌組織中，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)或磁珠分選技術(shù)，依據(jù)乳腺癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物（如CD44+/CD24-），分選出乳腺癌干細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定。隨后，將SATB1-shRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌干細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組，分別利用qRT-PCR、Westernblot、免疫熒光染色等技術(shù)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)及定位變化；通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、成球?qū)嶒?yàn)等檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。最后，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、ChIP實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)等探討RNA干擾SATB1基因影響乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1技術(shù)路線圖二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乳腺癌與乳腺癌干細(xì)胞乳腺癌是一種起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中均位居前列，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康和生活質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球女性乳腺癌新發(fā)病例達(dá)226萬(wàn)例，死亡病例達(dá)68萬(wàn)例，發(fā)病率和死亡率均居女性惡性腫瘤首位。在中國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡逐漸年輕化。2020年中國(guó)女性乳腺癌新發(fā)病例約為42萬(wàn)例，占女性惡性腫瘤新發(fā)病例的19.9%。目前，乳腺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等。手術(shù)治療是乳腺癌的主要治療方法之一，包括乳房切除術(shù)和保乳手術(shù)等。化療則是通過(guò)使用化學(xué)藥物來(lái)殺死癌細(xì)胞，常用的化療藥物包括蒽環(huán)類、紫杉類等。放療是利用高能射線對(duì)腫瘤部位進(jìn)行照射，以殺死癌細(xì)胞。內(nèi)分泌治療主要針對(duì)激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者，通過(guò)抑制雌激素的合成或作用來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。靶向治療則是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)，使用特異性的藥物進(jìn)行治療，如抗HER2靶向治療等。然而，盡管這些治療手段在一定程度上提高了乳腺癌患者的生存率，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌干細(xì)胞是乳腺癌腫瘤組織中一小部分具有自我更新、多向分化潛能和高致瘤性的細(xì)胞。這些細(xì)胞具有與正常干細(xì)胞相似的特性，能夠在腫瘤組織中保持相對(duì)靜止的狀態(tài)，逃避常規(guī)治療的殺傷。當(dāng)腫瘤組織受到刺激時(shí)，乳腺癌干細(xì)胞能夠迅速增殖和分化，形成新的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。乳腺癌干細(xì)胞的存在被認(rèn)為是乳腺癌治療失敗的重要原因之一。乳腺癌干細(xì)胞具有一些獨(dú)特的特性。首先，它們具有自我更新能力，能夠不斷地產(chǎn)生新的干細(xì)胞和分化細(xì)胞，維持腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。其次，乳腺癌干細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠分化為不同類型的腫瘤細(xì)胞，形成腫瘤的異質(zhì)性。此外，乳腺癌干細(xì)胞還具有高致瘤性，少量的乳腺癌干細(xì)胞就能夠在體內(nèi)形成腫瘤。研究表明，將100個(gè)CD44+/CD24-的乳腺癌干細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，就能夠形成腫瘤，而需要注射10萬(wàn)個(gè)以上的非干細(xì)胞才能形成腫瘤。目前，常用的乳腺癌干細(xì)胞分離鑒定方法主要包括基于表面標(biāo)志物的分選法、流式細(xì)胞術(shù)分選法和條件培養(yǎng)基篩選法等?；诒砻鏄?biāo)志物的分選法是利用乳腺癌干細(xì)胞表面特有的標(biāo)志物，如CD44、CD24、ALDH1等，采用免疫磁珠分選、熒光激活細(xì)胞分選等技術(shù)將其分離出來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)，CD44+/CD24-的細(xì)胞亞群具有乳腺癌干細(xì)胞的特性，能夠在體外形成乳腺球，并且具有較強(qiáng)的致瘤性。流式細(xì)胞術(shù)分選法則是根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，能夠獲得高純度的乳腺癌干細(xì)胞。條件培養(yǎng)基篩選法是利用乳腺癌干細(xì)胞在特定條件下的生長(zhǎng)特性，將腫瘤組織接種于無(wú)血清培養(yǎng)基中，通過(guò)保持細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境，誘導(dǎo)腫瘤組織中的乳腺癌干細(xì)胞增殖，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。乳腺癌干細(xì)胞在腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一方面，乳腺癌干細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究表明，乳腺癌干細(xì)胞能夠通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在EMT過(guò)程中，乳腺癌干細(xì)胞會(huì)失去上皮細(xì)胞的特征，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如表達(dá)E-cadherin減少，表達(dá)N-cadherin和Vimentin增加等，從而使其能夠更容易地遷移和侵襲到周圍組織。另一方面，乳腺癌干細(xì)胞具有耐藥性，能夠耐受放療、化療等治療手段，這使得它們?cè)谥委熯^(guò)程中能夠存活下來(lái)，成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。乳腺癌干細(xì)胞耐藥的機(jī)制主要包括藥物外排泵的高表達(dá)、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、凋亡信號(hào)通路的抑制等。例如，乳腺癌干細(xì)胞中ABCG2等藥物外排泵的表達(dá)水平較高，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排出細(xì)胞外，從而降低化療藥物的療效。2.2Wnt信號(hào)通路Wnt信號(hào)通路是一個(gè)在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及疾病發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中就包括乳腺癌。Wnt信號(hào)通路主要由分泌蛋白Wnt家族、跨膜受體Frizzled（Fzd）家族、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）、胞內(nèi)蛋白Dishevelled（Dvl）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、軸蛋白（Axin）、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）以及轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族等組成。根據(jù)其下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的不同，Wnt信號(hào)通路可分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路（Wnt/β-catenin信號(hào)通路）和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路（Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路）。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)機(jī)制如下：在沒(méi)有Wnt信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin與Axin、APC、GSK3β等形成降解復(fù)合體。其中，GSK3β和酪蛋白激酶1（CK1）會(huì)依次對(duì)β-catenin的N端絲氨酸/蘇氨酸殘基進(jìn)行磷酸化修飾。磷酸化后的β-catenin被β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)蛋白（β-TRCP）識(shí)別并結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)泛素化途徑被蛋白酶體降解，使得細(xì)胞內(nèi)β-catenin的水平維持在較低狀態(tài)。此時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF與共抑制因子Groucho結(jié)合，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt配體與細(xì)胞膜上的Fzd受體和共受體LRP5/6結(jié)合，形成Wnt-Fzd-LRP5/6復(fù)合物。這一復(fù)合物的形成會(huì)招募Dvl蛋白到細(xì)胞膜上，Dvl蛋白通過(guò)與Axin相互作用，使Axin-GSK3β蛋白復(fù)合物也被招募到細(xì)胞膜處。在細(xì)胞膜上，LRP5/6受體胞內(nèi)段先后被GSK3β、Cdk14-CyclinY和CK1γ磷酸化，磷酸化后的LRP5/6為Axin提供了結(jié)合位點(diǎn)。這一過(guò)程使得降解復(fù)合體的功能受到抑制，β-catenin的磷酸化和降解過(guò)程受阻，從而導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定積累。積累的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，取代共抑制因子Groucho，從而啟動(dòng)下游靶基因（如c-myc、CyclinD1等）的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為。在乳腺癌干細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究表明，Wnt信號(hào)通路的持續(xù)激活能夠維持乳腺癌干細(xì)胞的自我更新能力。當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常激活時(shí)，乳腺癌干細(xì)胞能夠不斷增殖，形成新的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。Wnt信號(hào)通路還能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞的分化，使其保持干細(xì)胞特性。這使得乳腺癌干細(xì)胞能夠逃避常規(guī)治療，在治療后重新啟動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌干細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平明顯高于非干細(xì)胞，且抑制Wnt信號(hào)通路能夠降低乳腺癌干細(xì)胞的自我更新能力和致瘤性。此外，Wnt信號(hào)通路還可以通過(guò)與其他信號(hào)通路（如Notch、Hedgehog等信號(hào)通路）相互作用，共同調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為。Wnt信號(hào)通路的異常激活與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌組織中，常常檢測(cè)到Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的突變或異常表達(dá)。例如，β-catenin基因的突變會(huì)導(dǎo)致其蛋白無(wú)法被正常降解，從而使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)積累，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。此外，Wnt配體的過(guò)表達(dá)或Fzd受體的異常激活也會(huì)導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的過(guò)度激活，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，Wnt信號(hào)通路的激活與乳腺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的乳腺癌患者往往具有更差的預(yù)后。2.3SATB1基因富含AT序列的特異結(jié)合蛋白1（SATB1）是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)序列特異性結(jié)合蛋白，在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。SATB1基因位于3號(hào)染色體3p23區(qū)，全長(zhǎng)763個(gè)氨基酸。其編碼的蛋白質(zhì)包含有兩個(gè)CUT基序，可通過(guò)形成類似PDZ結(jié)構(gòu)的二聚體，以高度親和力與核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（MAR）序列相結(jié)合。在SATB1氨基酸序列的中部約有150個(gè)氨基酸，這部分氨基酸是和MAR發(fā)生結(jié)合的核心序列，并且具有高度堿基解配對(duì)（BUR）傾向的區(qū)域。在BUR內(nèi)，具有成簇的AT富含序列，包括混合的A、T、C并以G結(jié)尾，稱之為ATC序列，每個(gè)ATC序列又含有核心解鏈元件（CUE），CUE的突變會(huì)消除所在區(qū)域的堿基解配對(duì)傾向，從而使SATB1對(duì)MAR的結(jié)合活性消失。SATB1在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，它能夠通過(guò)與MAR序列結(jié)合，參與染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而調(diào)控組織特異性基因的表達(dá)。SATB1可以作為一種“分子支架”，在細(xì)胞核內(nèi)形成獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，為特殊的DNA序列提供錨定位點(diǎn)，影響染色質(zhì)開(kāi)放結(jié)構(gòu)的形成。當(dāng)SATB1與特定的DNA區(qū)域結(jié)合時(shí)，它可以招募各種轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾酶，促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，SATB1能夠與一些腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。此外，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是其功能調(diào)節(jié)的重要方式，SATB1的磷酸化、乙?；托》核鼗瘶有揎椏烧{(diào)節(jié)其DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。大量研究表明，SATB1在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與乳腺癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在一項(xiàng)對(duì)84例乳腺癌組織的研究中，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SATB1在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于乳腺癌旁組織，差異具有顯著性。SATB1蛋白在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，隨著組織學(xué)分級(jí)、臨床分期的增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，SATB1的表達(dá)水平顯著升高。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，SATB1的表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SATB1高表達(dá)提示乳腺癌患者預(yù)后不良。SATB1在乳腺癌中的作用機(jī)制較為復(fù)雜，其中一個(gè)重要的方面是通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路來(lái)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wnt信號(hào)通路在乳腺癌干細(xì)胞的維持、增殖和分化等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而SATB1可以通過(guò)與Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，調(diào)節(jié)該信號(hào)通路的活性。研究表明，SATB1能夠與β-catenin結(jié)合，促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累，從而增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路的活性，促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞的自我更新和增殖。SATB1還可以通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，影響乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)，SATB1高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因（如Wnt1、c-myc、CyclinD1等）的表達(dá)水平明顯升高，這些基因的異常表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。2.4RNA干擾技術(shù)RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種在真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，它通過(guò)雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)，高效、特異性地降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的抑制。這一現(xiàn)象最早在植物和線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)。1990年，Napoli等將查爾酮合成酶基因?qū)氚珷颗Ｖ?，試圖加深花朵的紫色，然而結(jié)果卻出乎意料，不僅轉(zhuǎn)入的基因未正常表達(dá)，而且植物自身的查爾酮合成酶基因表達(dá)也受到了抑制，花朵顏色反而變淺，這種現(xiàn)象被稱為共抑制。1995年，Guo和Kemphues在線蟲(chóng)中進(jìn)行反義RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)正義RNA也能抑制靶基因的表達(dá)，當(dāng)時(shí)對(duì)此現(xiàn)象無(wú)法解釋。直到1998年，F(xiàn)ire等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，dsRNA才是導(dǎo)致基因沉默的真正原因，并將這種由dsRNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象命名為RNA干擾。此后，RNAi技術(shù)迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，為基因功能研究和疾病治療提供了新的有力工具。RNAi的作用機(jī)制主要包括起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段。在起始階段，外源或內(nèi)源的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，被一種名為Dicer的核酸酶識(shí)別并切割成21-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的小片段，這些小片段被稱為小干擾RNA（siRNA）。Dicer屬于RNaseIII家族，它具有解旋酶活性以及dsRNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)，能夠精確地將dsRNA切割成具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的siRNA。在效應(yīng)階段，siRNA雙鏈在ATP供能的情況下被RNA解旋酶解旋，其中的反義鏈與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)組裝形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的核酸酶活性在結(jié)合反義鏈后被激活，使其能夠通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別并結(jié)合到靶mRNA的特定序列上，隨后在距離RISC的3’端11個(gè)堿基位置切割靶mRNA，導(dǎo)致mRNA降解，從而阻斷靶基因的表達(dá)。在擴(kuò)增階段，被切割的mRNA片段可作為模板，在RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）作用下合成新的dsRNA，這些新生成的dsRNA又能被Dicer切割成新的siRNA，繼續(xù)參與RNAi過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的持續(xù)抑制。這一過(guò)程使得RNAi具有信號(hào)放大效應(yīng)，少量的dsRNA即可引發(fā)強(qiáng)烈的基因沉默效果。RNAi技術(shù)在基因功能研究和腫瘤治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。在基因功能研究方面，由于RNAi能夠高度特異性地沉默特定基因，為研究基因的功能提供了一種高效的手段。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的siRNA或短發(fā)夾RNA（shRNA），可以在細(xì)胞水平或動(dòng)物模型中抑制該基因的表達(dá)，從而觀察其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為或生物體表型的影響。例如，在研究某一未知功能基因時(shí)，利用RNAi技術(shù)將其沉默后，觀察細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程是否發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該基因在這些生物學(xué)過(guò)程中的作用。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)，尤其適用于對(duì)一些難以進(jìn)行基因敲除的細(xì)胞系或生物體進(jìn)行基因功能研究。在腫瘤治療領(lǐng)域，RNAi技術(shù)為攻克腫瘤這一難題提供了新的思路和方法。腫瘤的發(fā)生發(fā)展往往與多個(gè)基因的異常表達(dá)密切相關(guān)，通過(guò)RNAi技術(shù)特異性地抑制這些異常表達(dá)的基因，有望達(dá)到治療腫瘤的目的。研究表明，可以針對(duì)腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的癌基因（如HER2、KRAS等）設(shè)計(jì)siRNA或shRNA，通過(guò)抑制這些癌基因的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的治療。RNAi技術(shù)還可以與其他治療方法（如化療、放療、靶向治療等）聯(lián)合應(yīng)用，增強(qiáng)治療效果，降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。例如，將針對(duì)腫瘤耐藥基因的RNAi與化療藥物聯(lián)合使用，可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，增強(qiáng)化療效果。鑒于RNAi技術(shù)在基因功能研究和腫瘤治療等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用及其顯著優(yōu)勢(shì)，利用RNAi技術(shù)抑制SATB1基因表達(dá)具有高度的可行性。通過(guò)設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SATB1基因的siRNA或shRNA，能夠特異性地降解SATB1基因的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SATB1基因表達(dá)的有效抑制。這將為深入研究SATB1基因在乳腺癌干細(xì)胞中的作用機(jī)制提供有力的工具，有助于揭示SATB1基因與乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路之間的內(nèi)在聯(lián)系。利用RNAi技術(shù)抑制SATB1基因表達(dá)，還可能為乳腺癌的治療開(kāi)辟新的途徑，通過(guò)干擾SATB1基因?qū)nt信號(hào)通路的調(diào)控，抑制乳腺癌干細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，為乳腺癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和策略。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料人類乳腺癌Mcf-7細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細(xì)胞株具有上皮細(xì)胞形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性，且為雌激素受體陽(yáng)性，常被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的基礎(chǔ)研究，尤其是在雌激素相關(guān)信號(hào)通路以及乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的研究中。主要試劑如下：RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司），用于細(xì)胞總蛋白的提取，其成分包含多種離子型和非離子型去污劑，能夠有效裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），利用雙縮脲反應(yīng)原理，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子反應(yīng)生成絡(luò)合物，通過(guò)檢測(cè)絡(luò)合物的吸光度來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），包含丙烯酰胺、N，N’-亞甲雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液等成分，用于制備SDS-PAGE凝膠，以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離；PVDF膜（Millipore公司），具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，能夠高效地吸附蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)膜的常用材料；SATB1抗體（Abcam公司），該抗體特異性高，能夠準(zhǔn)確識(shí)別SATB1蛋白，用于檢測(cè)細(xì)胞中SATB1蛋白的表達(dá)水平；β-actin抗體（CellSignalingTechnology公司），作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白質(zhì)上樣量的差異，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（武漢博士德生物工程有限公司），與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶催化底物顯色，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)；TRIzol試劑（Invitrogen公司），是一種新型總RNA抽提試劑，能夠快速、有效地從細(xì)胞或組織中提取總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、緩沖液等成分，可將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)提供模板；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），含有熱啟動(dòng)Taq酶、dNTPs、SYBRGreenI熒光染料等，能夠在PCR反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，從而準(zhǔn)確地定量分析基因的表達(dá)水平；嘌呤霉素（Sigma公司），常用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，其作用機(jī)制是抑制蛋白質(zhì)的合成，只有成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)抗性基因的細(xì)胞才能在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中存活；Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司），是一種從Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的基底膜基質(zhì)，富含多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中用于模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力；CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)研究所），利用細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有顏色的甲瓚產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物的吸光度值來(lái)準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖情況；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司），利用AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，PI能夠?qū)乃兰?xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞比例，從而準(zhǔn)確地區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備包括：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），最大轉(zhuǎn)速可達(dá)15000rpm，能夠在低溫條件下快速離心細(xì)胞或蛋白質(zhì)樣品，實(shí)現(xiàn)樣品的分離和濃縮；PCR儀（Bio-Rad公司），具有溫度控制精確、升降溫速度快等優(yōu)點(diǎn)，可滿足逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)的需求；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司），能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)，準(zhǔn)確地定量分析基因的表達(dá)水平；電泳儀（Bio-Rad公司），提供穩(wěn)定的電場(chǎng)，用于SDS-PAGE凝膠電泳，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon公司），能夠?qū)﹄娪竞蟮哪z進(jìn)行成像和分析，檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），可用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖產(chǎn)生的吸光度值，以及BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)濃度對(duì)應(yīng)的吸光度值；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物或細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選和分析，在乳腺癌干細(xì)胞的分選和鑒定以及細(xì)胞凋亡檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用；恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個(gè)無(wú)菌的操作環(huán)境，確保細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)菌性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與包裝依據(jù)GenBank中SATB1基因序列（登錄號(hào)：[具體登錄號(hào)]），運(yùn)用RNAi設(shè)計(jì)軟件（如Ambion公司的siRNATargetFinder、Dharmacon公司的siDESIGNCenter等），設(shè)計(jì)針對(duì)SATB1基因的小發(fā)夾RNA（shRNA）干擾序列。設(shè)計(jì)時(shí)遵循以下原則：干擾序列長(zhǎng)度為19-21個(gè)核苷酸，GC含量在30%-70%之間，避免出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)以上的T或A堿基，且干擾序列與其他基因無(wú)明顯同源性。經(jīng)軟件分析和篩選，確定3條干擾序列，同時(shí)設(shè)計(jì)1條陰性對(duì)照序列（不與任何已知基因序列互補(bǔ)），序列信息如下（表1）：[此處插入表格1：SATB1-shRNA及陰性對(duì)照序列信息]序列名稱序列（5'-3'）SATB1-shRNA1[具體序列1]SATB1-shRNA2[具體序列2]SATB1-shRNA3[具體序列3]NegativeControl-shRNA[具體序列4]將設(shè)計(jì)好的干擾序列和陰性對(duì)照序列分別合成寡核苷酸雙鏈，兩端添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)（如BamHI和EcoRI），以便后續(xù)與慢病毒載體連接。采用化學(xué)合成法合成寡核苷酸雙鏈，合成過(guò)程中進(jìn)行質(zhì)量控制，確保序列的準(zhǔn)確性和完整性。合成完成后，通過(guò)PAGE或HPLC對(duì)寡核苷酸雙鏈進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料。選用慢病毒載體（如pLVX-shRNA2載體），該載體含有綠色熒光蛋白（GFP）基因和嘌呤霉素抗性基因，便于后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選和鑒定。用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對(duì)慢病毒載體進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×Buffer5μL，載體DNA（1μg/μL）1μg，BamHI1μL，EcoRI1μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。將酶切體系置于37℃水浴鍋中孵育2-3小時(shí)，使載體充分酶切。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收線性化的載體片段。回收過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，確?；厥盏妮d體片段純度和濃度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。將純化后的寡核苷酸雙鏈與線性化的慢病毒載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為：10×T4DNALigaseBuffer2μL，線性化載體DNA50-100ng，寡核苷酸雙鏈100-200ng，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。將連接體系置于16℃恒溫金屬浴中孵育過(guò)夜，使寡核苷酸雙鏈與載體充分連接。連接反應(yīng)完成后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中。將感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，置于冰上解凍，取5-10μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將混合物置于42℃水浴鍋中熱激90秒，迅速轉(zhuǎn)移至冰上冷卻2-3分鐘。向管中加入900μL無(wú)抗LB培養(yǎng)基，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，待菌落長(zhǎng)出。從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒DNA，采用PCR和雙酶切鑒定的方法篩選陽(yáng)性克隆。PCR鑒定引物根據(jù)載體和插入片段的序列設(shè)計(jì)，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，質(zhì)粒DNA1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸1-2分鐘，共30-35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則初步判斷為陽(yáng)性克隆。對(duì)初步鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系和條件同載體酶切步驟。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)線性化載體片段和插入片段，則確定為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的干擾序列一致，表明RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的RNAi慢病毒載體（pLVX-SATB1-shRNA）與包裝質(zhì)粒（psPAX2和pMD2G）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。轉(zhuǎn)染前1天，將293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%-80%融合度。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。取1.5μgpLVX-SATB1-shRNA、1μgpsPAX2和0.5μgpMD2G質(zhì)粒DNA，分別加入到100μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。另取5μLLipofectamine3000試劑加入到100μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的質(zhì)粒DNA與稀釋后的Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。收集含有病毒的上清培養(yǎng)液，4℃、3000rpm離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片。將上清液通過(guò)0.45μm濾器過(guò)濾，進(jìn)一步去除雜質(zhì)。采用超速離心法或病毒濃縮試劑盒對(duì)病毒上清進(jìn)行濃縮，將濃縮后的病毒液分裝至無(wú)菌離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎脤?shí)時(shí)熒光定量PCR法或TCID??法測(cè)定病毒滴度，確保病毒滴度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定病毒滴度的原理是通過(guò)檢測(cè)病毒基因組中特定基因的拷貝數(shù)來(lái)確定病毒滴度。具體操作步驟為：提取病毒基因組DNA，設(shè)計(jì)針對(duì)病毒基因組特定基因的引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出病毒基因組拷貝數(shù)，進(jìn)而換算出病毒滴度。TCID??法測(cè)定病毒滴度的原理是將病毒液進(jìn)行系列稀釋，接種到敏感細(xì)胞中，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算出病毒滴度。具體操作步驟為：將病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度接種多個(gè)孔的敏感細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算出TCID??值，進(jìn)而換算出病毒滴度。3.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人乳腺癌Mcf-7細(xì)胞株在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-3分鐘，待細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Mcf-7細(xì)胞，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，加入1mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，更換為無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基。將空包病毒（作為陰性對(duì)照）和重組慢病毒（LV-SATB1-shRNA）分別用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為50的比例加入到24孔板中，同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene），輕輕混勻。將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育8小時(shí)后，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到80%以上時(shí)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。隨后，向培養(yǎng)基中加入終濃度為2μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，每2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞全部死亡，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存于液氮中備用。在凍存細(xì)胞時(shí)，先將細(xì)胞用含10%DMSO和20%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?-5×10?個(gè)/mL，然后將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1mL。將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中保存。3.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染的Mcf-7細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空包病毒的Mcf-7細(xì)胞、轉(zhuǎn)染重組慢病毒的Mcf-7細(xì)胞）的總RNA。具體操作如下：棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，每孔加入1mLTRIzol試劑，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無(wú)色水相，含有RNA；中層為白色蛋白層；下層為紅色酚氯仿相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，離心后管底出現(xiàn)白色RNA沉淀，棄去上清液。加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕顛倒離心管，洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液。將離心管置于超凈工作臺(tái)中，室溫晾干RNA沉淀5-10分鐘，待沉淀表面無(wú)明顯液體殘留后，加入適量DEPC水溶解RNA，輕輕吹打使RNA完全溶解。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，總RNA1μg，RNase-freedH?O補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻，37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，4℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因（如Wnt1、β-catenin、TCF4等）以及內(nèi)參基因GAPDH的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息如下（表2）：[此處插入表格2：實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列信息]基因名稱引物序列（5'-3'）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（bp）Wnt1F：[具體序列5]R：[具體序列6][具體長(zhǎng)度1]β-cateninF：[具體序列7]R：[具體序列8][具體長(zhǎng)度2]TCF4F：[具體序列9]R：[具體序列10][具體長(zhǎng)度3]GAPDHF：[具體序列11]R：[具體序列12][具體長(zhǎng)度4]以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上游引物（10μM）0.5μL，下游引物（10μM）0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，從60℃以0.5℃/s的速度升溫至95℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算公式為：ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，相對(duì)表達(dá)量=2?ΔΔCt。通過(guò)比較各組細(xì)胞中目的基因相對(duì)表達(dá)量的差異，分析RNA干擾SATB1基因?qū)nt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。3.2.4Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)使用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白。將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗2-3次，每孔加入100-150μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上孵育30分鐘，期間輕輕搖晃離心管，使細(xì)胞充分裂解。4℃、12000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將BCA試劑A和試劑B按照50:1的比例混合，配制成BCA工作液。取適量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為2mg/mL），用PBS緩沖液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（如0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL）。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和蛋白樣品各20μL加入到96孔板中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，再加入200μLBCA工作液，輕輕混勻。將96孔板置于37℃恒溫箱中孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定A???處的吸光度值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白樣品的濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，使蛋白終濃度為1-2μg/μL。將混合液在100℃金屬浴中煮沸5分鐘，使蛋白充分變性。冷卻至室溫后，12000rpm離心5分鐘，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠（如10%分離膠用于分離16-70kDa的蛋白）和5%濃縮膠。電泳時(shí)，先在80V電壓下電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜緩沖液為含25mMTris、192mM甘氨酸和20%甲醇的溶液。將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后依次放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡。將凝膠和PVDF膜按照“海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿”的順序組裝在轉(zhuǎn)膜夾中，注意避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以300四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果通過(guò)化學(xué)合成法合成針對(duì)SATB1基因的shRNA寡核苷酸雙鏈，并將其克隆至慢病毒載體pLVX-shRNA2中，成功構(gòu)建了RNAi慢病毒載體。對(duì)重組慢病毒載體進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示（圖2），經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后，在1%瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的兩條條帶，一條為線性化的載體片段，大小約為[X]kb；另一條為插入的shRNA片段，大小約為[X]bp，表明重組慢病毒載體構(gòu)建成功。[此處插入酶切鑒定結(jié)果圖2：重組慢病毒載體酶切鑒定結(jié)果]圖2重組慢病毒載體酶切鑒定結(jié)果M：DNAMarker；1：重組慢病毒載體雙酶切產(chǎn)物將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的shRNA序列完全一致，進(jìn)一步證實(shí)了RNAi慢病毒載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。測(cè)序峰圖清晰，無(wú)堿基突變、缺失或插入等異常情況（圖3）。[此處插入測(cè)序結(jié)果峰圖3：重組慢病毒載體測(cè)序峰圖]圖3重組慢病毒載體測(cè)序峰圖采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定病毒滴度，結(jié)果表明，重組慢病毒的滴度達(dá)到了[X]TU/mL，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒滴度的要求，能夠有效轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，為后續(xù)研究RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞的影響奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及SATB1基因抑制效果將構(gòu)建好的重組慢病毒（LV-SATB1-shRNA）和空包病毒（陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)染人乳腺癌Mcf-7細(xì)胞48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，重組慢病毒轉(zhuǎn)染組和空包病毒轉(zhuǎn)染組均可見(jiàn)大量綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功。通過(guò)隨機(jī)選取多個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例，結(jié)果表明重組慢病毒轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率為[X]%，空包病毒轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率為[X]%，兩組轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著差異（圖4）。這說(shuō)明所采用的轉(zhuǎn)染方法能夠有效地將慢病毒導(dǎo)入Mcf-7細(xì)胞中，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的保障。[此處插入轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞GFP熒光表達(dá)情況圖4：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞GFP熒光表達(dá)情況]圖4轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞GFP熒光表達(dá)情況A：重組慢病毒轉(zhuǎn)染組；B：空包病毒轉(zhuǎn)染組（標(biāo)尺=100μm）進(jìn)一步通過(guò)嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染的Mcf-7細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空包病毒的Mcf-7細(xì)胞、轉(zhuǎn)染重組慢病毒的Mcf-7細(xì)胞）中SATB1基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示（圖5A），與未轉(zhuǎn)染組和空包病毒轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染重組慢病毒的Mcf-7細(xì)胞中SATB1基因mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），分別下降至未轉(zhuǎn)染組的[X]%和空包病毒轉(zhuǎn)染組的[X]%。Westernblot結(jié)果（圖5B、5C）也表明，轉(zhuǎn)染重組慢病毒后，SATB1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，灰度值分析顯示，與未轉(zhuǎn)染組和空包病毒轉(zhuǎn)染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分證明了構(gòu)建的RNAi慢病毒載體能夠有效抑制Mcf-7細(xì)胞中SATB1基因的表達(dá)，為后續(xù)研究RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞的影響奠定了基礎(chǔ)。[此處插入圖5：各組細(xì)胞中SATB1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果]圖5各組細(xì)胞中SATB1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果A：qRT-PCR檢測(cè)SATB1基因mRNA表達(dá)水平；B：Westernblot檢測(cè)SATB1蛋白表達(dá)水平；C：SATB1蛋白表達(dá)水平的灰度值分析*P<0.05，**P<0.01，與未轉(zhuǎn)染組相比；#P<0.05，##P<0.01，與空包病毒轉(zhuǎn)染組相比4.3乳腺癌干細(xì)胞的分選及鑒定結(jié)果采用流式細(xì)胞術(shù)，依據(jù)乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44+/CD24-，從人乳腺癌Mcf-7細(xì)胞系中進(jìn)行乳腺癌干細(xì)胞的分選。分選結(jié)果如圖6所示，通過(guò)設(shè)置合適的分選門，成功分選出CD44+/CD24-細(xì)胞亞群，該亞群細(xì)胞比例為[X]%。[此處插入圖6：流式細(xì)胞術(shù)分選乳腺癌干細(xì)胞結(jié)果]圖6流式細(xì)胞術(shù)分選乳腺癌干細(xì)胞結(jié)果A：未分選的Mcf-7細(xì)胞；B：分選后的CD44+/CD24-細(xì)胞亞群對(duì)分選得到的CD44+/CD24-細(xì)胞進(jìn)行成球?qū)嶒?yàn)，以鑒定其干細(xì)胞特性。將分選后的細(xì)胞接種于低吸附96孔板中，加入含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，CD44+/CD24-細(xì)胞能夠形成大小不一的乳腺球（圖7A），而CD44-/CD24+細(xì)胞幾乎不能形成乳腺球。乳腺球形成效率分析結(jié)果顯示，CD44+/CD24-細(xì)胞的乳腺球形成效率為[X]%，顯著高于CD44-/CD24+細(xì)胞的乳腺球形成效率[X]%（圖7B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明分選得到的CD44+/CD24-細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力，符合乳腺癌干細(xì)胞的特征。[此處插入圖7：乳腺癌干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果]圖7乳腺癌干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果A：培養(yǎng)7天后CD44+/CD24-細(xì)胞形成的乳腺球（標(biāo)尺=100μm）；B：乳腺球形成效率分析**P<0.01，與CD44-/CD24+細(xì)胞相比為進(jìn)一步驗(yàn)證分選細(xì)胞的干細(xì)胞特性，進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。將分選后的CD44+/CD24-細(xì)胞和CD44-/CD24+細(xì)胞分別接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)10-14天。結(jié)果顯示，CD44+/CD24-細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯多于CD44-/CD24+細(xì)胞（圖8A）?？寺⌒纬陕式y(tǒng)計(jì)分析表明，CD44+/CD24-細(xì)胞的克隆形成率為[X]%，顯著高于CD44-/CD24+細(xì)胞的克隆形成率[X]%（圖8B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了分選得到的CD44+/CD24-細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，是乳腺癌干細(xì)胞的重要特征之一。[此處插入圖8：乳腺癌干細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果]圖8乳腺癌干細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果A：培養(yǎng)14天后CD44+/CD24-細(xì)胞和CD44-/CD24+細(xì)胞形成的克?。籅：克隆形成率分析**P<0.01，與CD44-/CD24+細(xì)胞相比綜合以上流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果以及成球?qū)嶒?yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)的鑒定結(jié)果，可以確定成功從人乳腺癌Mcf-7細(xì)胞系中分離出具有干細(xì)胞特性的CD44+/CD24-細(xì)胞亞群，為后續(xù)研究RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。4.4干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)干擾SATB1基因后乳腺癌干細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因Wnt1、β-catenin的mRNA表達(dá)水平。以未轉(zhuǎn)染的乳腺癌干細(xì)胞為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空包病毒的乳腺癌干細(xì)胞為陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染重組慢病毒（LV-SATB1-shRNA）的乳腺癌干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中Wnt1基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），分別下降至對(duì)照組的[X]%和陰性對(duì)照組的[X]%；β-catenin基因的mRNA表達(dá)水平也明顯下調(diào)（P<0.01），分別為對(duì)照組的[X]%和陰性對(duì)照組的[X]%。這表明干擾SATB1基因能夠顯著抑制乳腺癌干細(xì)胞中Wnt1和β-catenin基因的mRNA表達(dá)，進(jìn)而影響Wnt信號(hào)通路的激活。[此處插入圖9：干擾SATB1基因后乳腺癌干細(xì)胞中Wnt1、β-catenin基因mRNA表達(dá)水平變化]圖9干擾SATB1基因后乳腺癌干細(xì)胞中Wnt1、β-catenin基因mRNA表達(dá)水平變化*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與陰性對(duì)照組相比在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，Wnt1作為配體，與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，能夠激活下游信號(hào)傳導(dǎo)，促使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。而本研究中干擾SATB1基因后，Wnt1和β-catenin基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，這意味著Wnt信號(hào)通路的起始環(huán)節(jié)受到抑制，可能導(dǎo)致β-catenin的積累和入核過(guò)程受阻，進(jìn)而影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終影響乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為。這一結(jié)果為深入探究SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也進(jìn)一步表明SATB1基因在乳腺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的激活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，干擾SATB1基因有望成為抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為的有效策略。五、討論5.1RNA干擾SATB1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞Wnt信號(hào)通路影響的機(jī)制探討本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)成功抑制了乳腺癌干細(xì)胞中SATB1基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾SATB1基因后，乳腺癌干細(xì)胞中Wnt1和β-catenin基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低。這一現(xiàn)象背后的分子機(jī)制可能與SATB1在基因表達(dá)調(diào)控中的作用密切相關(guān)。SATB1作為一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)序列特異性結(jié)合蛋白，能夠與染色質(zhì)上的特定區(qū)域結(jié)合，參與染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和基因表達(dá)的調(diào)控。在乳腺癌干細(xì)胞中，SATB1可能通過(guò)與Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合，直接調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄活性。研究表明，SATB1可以招募轉(zhuǎn)錄激活因子或染色質(zhì)修飾酶到其結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)SATB1基因被干擾后，其與Wnt1和β-catenin基因調(diào)控區(qū)域的結(jié)合能力下降，導(dǎo)致