抗鴨病毒性肝炎黃酮成分復(fù)方的篩選與作用機(jī)制探究

抗鴨病毒性肝炎黃酮成分復(fù)方的篩選與作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景鴨病毒性肝炎（DuckViralHepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（DuckHepatitisVirus，DHV）引起的一種對(duì)雛鴨具有極高致死率的急性傳染病。該病主要侵襲3周齡以?xún)?nèi)的雛鴨，發(fā)病率可達(dá)90%-100%，死亡率在20%-90%之間，甚至在某些嚴(yán)重情況下可高達(dá)100%。這給全球養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了沉重的打擊，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨病毒性肝炎傳播速度極快，一旦在鴨群中出現(xiàn)疫情，短時(shí)間內(nèi)就會(huì)迅速蔓延。其主要傳播途徑包括呼吸道、消化道以及接觸感染。被污染的水源、飼料、器具和鴨舍環(huán)境等都是病毒傳播的重要媒介。感染后的雛鴨通常在24-48小時(shí)內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)明顯癥狀，病程短暫且發(fā)展迅速。患病雛鴨表現(xiàn)出精神萎靡、食欲減退、行動(dòng)遲緩等癥狀，隨后會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如角弓反張（頭頸向后仰）、抽搐、癱瘓等，同時(shí)可能伴有腹瀉，排出黃綠色或灰白色稀便，部分病鴨還會(huì)出現(xiàn)呼吸急促、張口呼吸等呼吸困難癥狀，許多病鴨甚至在無(wú)明顯癥狀的情況下突然死亡。解剖可見(jiàn)肝臟腫大、質(zhì)脆、棕黃色，表面布滿出血斑點(diǎn)，膽囊充盈，腎腫脹與充血，脾有時(shí)腫大。目前，對(duì)于鴨病毒性肝炎的防控主要依賴(lài)于疫苗接種和藥物治療。疫苗接種雖然在一定程度上能夠預(yù)防疾病的發(fā)生，但由于病毒的不斷變異，現(xiàn)有疫苗的保護(hù)效果受到了挑戰(zhàn)。而在藥物治療方面，化學(xué)藥物往往存在殘留和耐藥性等問(wèn)題，對(duì)食品安全和公共衛(wèi)生構(gòu)成潛在威脅。因此，尋找安全、有效的替代治療方法成為養(yǎng)鴨業(yè)亟待解決的問(wèn)題。黃酮類(lèi)化合物作為一類(lèi)廣泛存在于植物中的天然產(chǎn)物，具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明黃酮類(lèi)化合物在抗病毒領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。其抗病毒機(jī)制多樣，包括抑制病毒的吸附、侵入、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過(guò)程，調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，以及抗氧化應(yīng)激等。例如，黃芩苷能夠抑制病毒的入侵和復(fù)制，同時(shí)具有明顯的抗炎和抗氧化作用；白背葉黃酮類(lèi)化合物能顯著降低鴨乙型肝炎病毒模型鴨血清中DHBV-DNA濃度，對(duì)鴨乙型肝炎病毒具有顯著的抑制作用。鑒于黃酮類(lèi)化合物的抗病毒特性，篩選具有抗鴨病毒性肝炎活性的黃酮成分復(fù)方，并深入研究其作用機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)際意義。一方面，有助于深入了解黃酮類(lèi)化合物抗鴨病毒性肝炎的作用方式，為開(kāi)發(fā)新型抗病毒藥物提供理論依據(jù)；另一方面，有望為鴨病毒性肝炎的防治提供安全、有效的天然藥物，減少化學(xué)藥物的使用，保障養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展和食品安全。1.2研究目的與意義鴨病毒性肝炎對(duì)雛鴨的高致死率給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了沉重打擊，當(dāng)前防控手段存在諸多不足，如疫苗因病毒變異保護(hù)效果受限，化學(xué)藥物存在殘留和耐藥性問(wèn)題。本研究旨在篩選出具有高效抗鴨病毒性肝炎活性的黃酮成分復(fù)方，并深入剖析其作用機(jī)制。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從眾多黃酮類(lèi)化合物中篩選出具有協(xié)同抗病毒作用的復(fù)方組合，明確其對(duì)鴨病毒性肝炎病毒的抑制效果。利用分子生物學(xué)、免疫學(xué)等技術(shù)手段，從病毒感染、免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激等多個(gè)角度探究其作用機(jī)制，揭示黃酮成分復(fù)方抗鴨病毒性肝炎的內(nèi)在原理。本研究具有重要的理論與實(shí)際意義。在理論層面，有助于深化對(duì)黃酮類(lèi)化合物抗病毒作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為黃酮類(lèi)化合物在抗病毒領(lǐng)域的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。通過(guò)研究黃酮成分復(fù)方與鴨病毒性肝炎病毒以及宿主細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，能夠進(jìn)一步豐富天然產(chǎn)物抗病毒的理論體系，為其他病毒病的研究提供借鑒。在實(shí)際應(yīng)用方面，有望開(kāi)發(fā)出安全、有效的天然藥物用于鴨病毒性肝炎的防治。減少化學(xué)藥物在養(yǎng)鴨業(yè)中的使用，降低藥物殘留對(duì)食品安全的威脅，同時(shí)也能緩解耐藥性問(wèn)題，保障養(yǎng)鴨業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展，提高養(yǎng)殖戶(hù)的經(jīng)濟(jì)效益。二、鴨病毒性肝炎概述2.1流行病學(xué)特征鴨病毒性肝炎具有獨(dú)特的流行病學(xué)特征，這對(duì)于理解其傳播規(guī)律和制定防控策略至關(guān)重要。在傳播途徑方面，鴨病毒性肝炎病毒主要通過(guò)呼吸道和消化道進(jìn)行傳播。當(dāng)健康鴨吸入含有病毒的氣溶膠或接觸被病毒污染的空氣時(shí)，病毒可通過(guò)呼吸道黏膜進(jìn)入鴨體；同時(shí)，攝入被病毒污染的飼料、飲水，也會(huì)使病毒經(jīng)消化道感染鴨群。例如，在鴨舍通風(fēng)不良、衛(wèi)生條件差的情況下，病毒在空氣中的濃度增加，容易通過(guò)呼吸道傳播給其他健康鴨。被污染的飼料槽、飲水器等飼養(yǎng)器具也是病毒傳播的重要媒介，一只感染病毒的鴨使用過(guò)這些器具后，其他鴨再接觸就極易被感染。此外，鴨肝炎病毒還可通過(guò)接觸傳播，病鴨與健康鴨的直接接觸，或者健康鴨接觸到被病鴨排泄物污染的環(huán)境，都可能導(dǎo)致病毒傳播。雖然目前一般認(rèn)為該病毒不會(huì)經(jīng)過(guò)蛋傳遞，但在實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境中，若種鴨處于隱性感染狀態(tài)，在特定應(yīng)激條件下，仍不能完全排除病毒通過(guò)蛋傳播的可能性。易感群體主要集中在3周齡以下的雛鴨，尤其是1周齡以?xún)?nèi)的雛鴨對(duì)該病毒極為敏感，病死率可高達(dá)90%以上。這是因?yàn)殡r鴨的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，對(duì)病毒的抵抗力較弱。隨著日齡的增加，鴨的免疫力逐漸增強(qiáng)，4-5周齡的鴨一般較少發(fā)病，即使感染也多呈隱性感染，成為帶毒者，雖然自身不表現(xiàn)明顯癥狀，但可將病毒傳播給其他易感鴨。在實(shí)際養(yǎng)殖中，常?？梢杂^察到同一鴨舍內(nèi)，不同日齡的鴨混養(yǎng)時(shí)，雛鴨更容易發(fā)病，且病情更為嚴(yán)重。鴨病毒性肝炎一年四季均可發(fā)生，但以冬、春季較為多見(jiàn)。這可能與冬、春季的氣候條件以及養(yǎng)殖環(huán)境特點(diǎn)有關(guān)。冬、春季氣溫較低，鴨舍為了保暖往往通風(fēng)較差，導(dǎo)致舍內(nèi)空氣污濁，濕度增加，這種環(huán)境有利于病毒的存活和傳播。此外，冬、春季是雛鴨孵化和養(yǎng)殖的高峰期，大量雛鴨集中飼養(yǎng)，密度較大，一旦有病毒傳入，極易引發(fā)疫情的暴發(fā)和傳播。而在夏季，氣溫較高，病毒在外界環(huán)境中的存活能力相對(duì)較弱，且鴨舍通風(fēng)條件相對(duì)較好，病毒傳播的機(jī)會(huì)相對(duì)減少。2.2臨床癥狀與病理變化鴨病毒性肝炎具有特征性的臨床癥狀與病理變化，這些表現(xiàn)不僅是診斷疾病的重要依據(jù)，也反映了病毒對(duì)鴨體的侵害機(jī)制。感染鴨病毒性肝炎的雛鴨，在潛伏期1-4天后，會(huì)突然出現(xiàn)精神萎靡的癥狀，表現(xiàn)為縮頭弓背，羽毛松亂，失去往日的活潑，行動(dòng)遲緩，常離群獨(dú)處，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍。部分病鴨的眼睛半閉，呈昏睡狀態(tài)，食欲廢絕，不再對(duì)飼料表現(xiàn)出興趣，這是因?yàn)椴《靖腥居绊懥锁嗴w的神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，導(dǎo)致其生理機(jī)能紊亂。隨著病情的發(fā)展，病鴨會(huì)出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，這是鴨病毒性肝炎的顯著特征之一。病鴨全身抽搐，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，身體難以保持平衡，常倒向一側(cè)。最為典型的是出現(xiàn)角弓反張姿勢(shì)，即頭頸極力向后仰，彎向背部，同時(shí)兩腿陣發(fā)性向后蹬踢，如同在水中游泳狀。這種神經(jīng)癥狀的出現(xiàn)是由于病毒侵害了鴨的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，干擾了神經(jīng)信號(hào)的正常傳遞和肌肉的協(xié)調(diào)控制。在出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后，病鴨的病情迅速惡化，通常在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。消化系統(tǒng)也會(huì)受到明顯影響，病鴨常排出白色、黃綠色或灰白色稀便。這是因?yàn)椴《靖腥緦?dǎo)致腸道黏膜受損，消化吸收功能紊亂，腸道蠕動(dòng)異常，使得糞便的性狀和顏色發(fā)生改變。病死鴨的解剖病理變化主要集中在肝臟。肝臟呈現(xiàn)出腫大、質(zhì)地脆的特征，顏色通常為棕黃色或土黃色，表面布滿大小不等的出血斑點(diǎn)，這些出血斑點(diǎn)呈淡紅色或暗紅色，嚴(yán)重時(shí)肝臟表面如同布滿了紅色的繁星。切開(kāi)肝臟，可見(jiàn)切面外翻、多汁，肝臟的正常結(jié)構(gòu)變得模糊不清，這是由于肝細(xì)胞受損、壞死，導(dǎo)致肝臟組織的正常形態(tài)和功能被破壞。膽囊明顯腫大，膽汁充盈，顏色通常為墨綠色，這是因?yàn)楦闻K的病變影響了膽汁的正常代謝和排泄。腎臟也會(huì)出現(xiàn)腫脹、充血的現(xiàn)象，顏色灰暗，血管明顯，呈暗紫色樹(shù)枝狀，俗稱(chēng)“花斑腎”，這反映了病毒對(duì)腎臟的侵害，影響了腎臟的正常濾過(guò)和排泄功能。脾臟有時(shí)也會(huì)腫大，表面呈現(xiàn)紅白相間的斑駁狀，切面外翻、多汁。此外，部分病鴨還可能出現(xiàn)心包積液，心肌色淡變軟，呈煮熟狀，心室擴(kuò)張；胰腺腫大、充血或出血，呈粉紅色，有的表面有細(xì)小的白色病灶；法氏囊腫大，腦表面血管明顯易見(jiàn)、淤血，擴(kuò)張如樹(shù)枝狀等病理變化。這些病理變化相互關(guān)聯(lián)，共同反映了鴨病毒性肝炎對(duì)鴨體多器官系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害，是病毒在鴨體內(nèi)復(fù)制、擴(kuò)散，引發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷的結(jié)果。2.3現(xiàn)有防治策略分析目前，鴨病毒性肝炎的防治策略主要包括疫苗接種和藥物治療，這些策略在一定程度上對(duì)控制鴨病毒性肝炎發(fā)揮了作用，但也存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)。疫苗接種是預(yù)防鴨病毒性肝炎的重要手段之一。鴨病毒性肝炎疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗。弱毒疫苗具有免疫原性強(qiáng)、接種后能快速刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)、保護(hù)效果好等優(yōu)點(diǎn)。例如，研究表明，給1日齡雛鴨接種弱毒疫苗后，能在較短時(shí)間內(nèi)使鴨體產(chǎn)生抗體，有效抵抗鴨病毒性肝炎病毒的感染。其成本相對(duì)較低，在大規(guī)模養(yǎng)鴨場(chǎng)中應(yīng)用較為廣泛，能夠在一定程度上降低鴨群的發(fā)病率和死亡率。然而，弱毒疫苗也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，由于其是活病毒，可能存在毒力返強(qiáng)的問(wèn)題，在疫苗生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用過(guò)程中，如果操作不當(dāng)，弱毒疫苗有可能恢復(fù)毒力，導(dǎo)致接種鴨發(fā)病。此外，弱毒疫苗對(duì)儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件要求較高，需要在低溫環(huán)境下保存和運(yùn)輸，否則會(huì)影響疫苗的活性和免疫效果。滅活疫苗則相對(duì)較為安全，不存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。它是通過(guò)將病毒滅活后制成的疫苗，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。滅活疫苗的穩(wěn)定性好，儲(chǔ)存和運(yùn)輸相對(duì)方便，不需要嚴(yán)格的低溫條件。但滅活疫苗的免疫原性相對(duì)較弱，通常需要多次接種才能達(dá)到較好的免疫效果，這不僅增加了養(yǎng)殖成本，還可能給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)不便。而且，由于鴨病毒性肝炎病毒的不斷變異，現(xiàn)有疫苗的保護(hù)譜可能無(wú)法覆蓋所有變異毒株，導(dǎo)致疫苗的保護(hù)效果受到影響。在實(shí)際養(yǎng)殖中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)雖然接種了疫苗，但鴨群仍然感染鴨病毒性肝炎的情況，這可能與疫苗對(duì)某些變異毒株的保護(hù)力不足有關(guān)。在藥物治療方面，目前主要使用化學(xué)藥物和一些中藥制劑?；瘜W(xué)藥物如利巴韋林等具有一定的抗病毒作用，能夠在一定程度上抑制鴨病毒性肝炎病毒的復(fù)制，緩解病情。但化學(xué)藥物存在諸多弊端，長(zhǎng)期使用容易導(dǎo)致病毒產(chǎn)生耐藥性，使藥物的治療效果逐漸降低。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，隨著利巴韋林等藥物的廣泛使用，鴨病毒性肝炎病毒對(duì)這些藥物的耐藥性逐漸增強(qiáng)?；瘜W(xué)藥物還可能在鴨體內(nèi)殘留，對(duì)食品安全構(gòu)成威脅，影響消費(fèi)者的健康。中藥制劑作為一種天然藥物，近年來(lái)在鴨病毒性肝炎的治療中逐漸受到關(guān)注。中藥具有多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，不僅能夠直接抑制病毒的復(fù)制，還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)鴨體的抵抗力。例如，一些清熱解毒、保肝利膽的中藥方劑能夠減輕鴨肝臟的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生。而且，中藥副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)環(huán)境友好。然而，中藥的成分復(fù)雜，作用機(jī)制尚不明確，質(zhì)量控制難度較大。不同產(chǎn)地、不同批次的中藥材質(zhì)量可能存在差異，這會(huì)影響中藥制劑的療效和穩(wěn)定性。中藥的起效相對(duì)較慢，在疾病急性發(fā)作時(shí)，可能無(wú)法迅速控制病情?，F(xiàn)有防治策略在鴨病毒性肝炎的防控中都有一定的局限性。因此，開(kāi)發(fā)新的防治方法，如篩選具有高效抗病毒活性的黃酮成分復(fù)方，對(duì)于鴨病毒性肝炎的防治具有重要意義。三、黃酮類(lèi)化合物研究進(jìn)展3.1黃酮的分類(lèi)與理化性質(zhì)黃酮類(lèi)化合物是以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物，結(jié)構(gòu)中都具有一個(gè)酮式羰基，且多存在于植物的葉、花、果實(shí)等部位。依據(jù)三碳鏈（C環(huán)）的氧化程度、B環(huán)連接位置以及三碳鏈?zhǔn)欠癯森h(huán)等結(jié)構(gòu)特征，黃酮類(lèi)化合物可分為多個(gè)類(lèi)別。黃酮類(lèi)是狹義上的黃酮，其母核為2-苯基色原酮，如芹菜素就屬于黃酮類(lèi)化合物。黃酮醇類(lèi)是在黃酮基本母核的3位含有羥基或其他含氧基團(tuán)，像槲皮素便是典型的黃酮醇，廣泛存在于許多植物中，如銀杏葉。二氫黃酮類(lèi)是黃酮或黃酮醇類(lèi)的C2、C3位雙鍵被氫化后的產(chǎn)物，例如甘草中的甘草素就屬于二氫黃酮類(lèi)，其結(jié)構(gòu)的改變使得分子的平面性減弱。異黃酮類(lèi)具有3－苯基色原酮基本骨架，與黃酮相比，B環(huán)連接位置不同，葛根中的葛根素就是異黃酮類(lèi)化合物，在植物界分布也較為廣泛。查耳酮類(lèi)的三碳鏈（C環(huán)）不成環(huán)，其2′-羥基衍生物是二氫黃酮的同分異構(gòu)體，二者可以相互轉(zhuǎn)化，中藥紅花中的紅花苷為查耳酮類(lèi)?；ㄉ仡?lèi)是一類(lèi)以離子形式存在的色原烯衍生物，是形成植物藍(lán)、紅、紫色的色素，常見(jiàn)的矢車(chē)菊素就屬于此類(lèi)。黃酮類(lèi)化合物的溶解性因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)不同而存在較大差異。游離黃酮類(lèi)一般難溶于或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑及稀堿水溶液。平面性強(qiáng)的分子，如黃酮、黃酮醇、查耳酮等，因分子與分子間排列緊密，分子間引力較大，所以難溶于水；而非平面分子，如二氫黃酮、二氫黃酮醇等，分子與分子間排列不緊密，分子間引力降低，有利于水分子進(jìn)入，溶解度稍大。離子型的花色素類(lèi)雖為平面結(jié)構(gòu)，但以離子形式存在，有鹽的通性，溶解度較大。黃酮苷類(lèi)由于在結(jié)構(gòu)中引入了糖分子，易溶于熱水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑，卻難溶于親脂性溶劑，且糖鏈越長(zhǎng)、糖分子越多，水溶度越大。在穩(wěn)定性方面，黃酮類(lèi)化合物對(duì)光、熱、pH值等因素較為敏感。在光照條件下，某些黃酮類(lèi)化合物可能會(huì)發(fā)生光降解反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞和生物活性降低。例如，蘆丁在光照下會(huì)逐漸分解，顏色變深。溫度升高也可能加速黃酮類(lèi)化合物的分解，不同黃酮類(lèi)化合物的熱穩(wěn)定性有所不同。黃酮類(lèi)化合物分子中多具有酚羥基，顯酸性，可溶于堿性水溶液，但在強(qiáng)堿性條件下，可能會(huì)發(fā)生開(kāi)環(huán)、異構(gòu)化等反應(yīng)。在酸性條件下，γ-吡喃環(huán)上的1-氧原子因有未共享的電子對(duì)，表現(xiàn)出微弱的堿性，可與強(qiáng)無(wú)機(jī)酸如濃硫酸、鹽酸等生成鹽，但生成的鹽極不穩(wěn)定，加水后即可分解。3.2黃酮的藥理作用黃酮類(lèi)化合物具有廣泛的藥理作用，這使其在醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力?？寡趸饔檬屈S酮類(lèi)化合物重要的藥理特性之一。在生物體內(nèi)，氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)活性氧（ROS）和活性氮（RNS）產(chǎn)生過(guò)多，超出了機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡。過(guò)多的ROS和RNS會(huì)攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。黃酮類(lèi)化合物具有多個(gè)酚羥基，這些酚羥基能夠提供氫原子，與自由基結(jié)合，將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，減少氧化損傷。例如，槲皮素能夠有效清除超氧陰離子自由基、羥自由基等多種自由基。研究表明，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，加入槲皮素后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著降低，細(xì)胞的氧化損傷得到明顯改善。黃酮類(lèi)化合物還可以通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。它能提高超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，這些酶在體內(nèi)能夠催化ROS的分解，將其轉(zhuǎn)化為無(wú)害的水和氧氣。蘆丁可以上調(diào)SOD和GSH-Px的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力。抗炎作用也是黃酮類(lèi)化合物的重要藥理作用。炎癥是機(jī)體對(duì)各種損傷因子的防御反應(yīng)，但過(guò)度或持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損傷和疾病的發(fā)生。黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗炎作用。在炎癥反應(yīng)中，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，它的活化會(huì)誘導(dǎo)一系列炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等。黃酮類(lèi)化合物可以抑制NF-κB的活化，從而減少這些炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。例如，黃芩苷能夠抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，降低TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在炎癥信號(hào)傳導(dǎo)中也起著重要作用，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)抑制MAPK的磷酸化，阻斷炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)，減少炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。芹菜素能夠抑制p38MAPK的磷酸化，降低炎癥細(xì)胞因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用。此外，黃酮類(lèi)化合物還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，影響巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。黃酮類(lèi)化合物在抗病毒方面也表現(xiàn)出顯著的活性。病毒感染宿主細(xì)胞后，會(huì)利用宿主細(xì)胞的各種機(jī)制進(jìn)行復(fù)制和傳播，對(duì)宿主細(xì)胞造成損傷。黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)多種機(jī)制抑制病毒的感染和復(fù)制。一些黃酮類(lèi)化合物能夠與病毒表面的蛋白或受體結(jié)合，阻止病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞。例如，木犀草素能夠與流感病毒的血凝素結(jié)合，抑制病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附，從而降低病毒的感染能力。黃酮類(lèi)化合物還可以抑制病毒的復(fù)制過(guò)程，干擾病毒的核酸合成、轉(zhuǎn)錄和翻譯等環(huán)節(jié)。如黃芩素可以抑制乙型肝炎病毒（HBV）的DNA聚合酶活性，從而抑制HBV的復(fù)制。某些黃酮類(lèi)化合物還能夠調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的抵抗力。它們可以激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，提高機(jī)體的免疫功能，有助于清除病毒感染。此外，黃酮類(lèi)化合物還具有抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)心血管等多種藥理作用。它對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌具有抑制作用。在抗腫瘤方面，黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成等多種機(jī)制發(fā)揮作用。在調(diào)節(jié)血脂方面，黃酮類(lèi)化合物能夠降低血液中的膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平，升高高密度脂蛋白水平，從而預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。在保護(hù)心血管方面，黃酮類(lèi)化合物可以擴(kuò)張血管、降低血壓、抑制血小板聚集、抗氧化應(yīng)激等，對(duì)心血管系統(tǒng)起到保護(hù)作用。四、抗鴨病毒性肝炎黃酮成分復(fù)方的篩選4.1單味黃酮成分的體外篩選4.1.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)所需試劑包括DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司），MTT（噻唑藍(lán)，Sigma公司），DMSO（二甲基亞砜，Sigma公司）。儀器有CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），倒置顯微鏡（Olympus公司），高速離心機(jī)（Eppendorf公司）等。供試藥物選取多種單味黃酮成分，如槲皮素、蘆丁、黃芩苷、木犀草素、芹菜素等，純度均≥98%，購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。鴨肝炎病毒（DHAV）為本實(shí)驗(yàn)室保存，將其接種于9-11日齡鴨胚，收集感染鴨胚的尿囊液，經(jīng)多次凍融后，離心取上清，分裝保存于-80℃冰箱備用。鴨胚肝細(xì)胞（DEHs）的制備：選取9-11日齡健康鴨胚，無(wú)菌操作取出肝臟，用含雙抗的PBS沖洗3次，剪碎成1mm3左右的小塊，加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化15-20分鐘，期間輕輕振蕩。待組織塊分散后，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化的組織塊，然后以1000r/min離心5分鐘，棄上清，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。單味黃酮成分在DEHs上的最大安全濃度測(cè)定：將各單味黃酮成分用DMSO溶解，配制成100mg/mL的母液，再用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基倍比稀釋成不同濃度梯度，分別為1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DEHs接種于96孔板，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入不同濃度的黃酮溶液，每孔100μL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組（只加含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基）和DMSO對(duì)照組（含0.1%DMSO的含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4小時(shí)，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A570值），計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A570值/細(xì)胞對(duì)照組A570值）×100%。以細(xì)胞存活率≥80%的最大藥物濃度作為該單味黃酮成分在DEHs上的最大安全濃度。單味黃酮成分抗DHAV感染DEHs的能力測(cè)定：將各單味黃酮成分用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋成最大安全濃度，備用。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DEHs接種于96孔板，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，分為病毒對(duì)照組（只接種DHAV）、藥物對(duì)照組（只加黃酮溶液）和藥物治療組（先加黃酮溶液作用2小時(shí)，然后接種DHAV）。藥物治療組每孔加入100μL黃酮溶液，37℃孵育2小時(shí)后，棄去黃酮溶液，每孔加入100μLDHAV懸液（100TCID??），病毒對(duì)照組加入等體積的含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，藥物對(duì)照組加入等體積的黃酮溶液。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，按照上述MTT法測(cè)定各孔的A570值。單味黃酮成分抗DHAV感染DEHs的最大病毒抑制率測(cè)定：根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算各單味黃酮成分的病毒抑制率，病毒抑制率（%）=[（病毒對(duì)照組A570值-藥物治療組A570值）/病毒對(duì)照組A570值]×100%。比較不同單味黃酮成分的病毒抑制率，篩選出病毒抑制率較高的單味黃酮成分。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析單味黃酮成分在DEHs上的最大安全濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可以看出，不同單味黃酮成分在DEHs上的最大安全濃度存在差異。槲皮素的最大安全濃度為125μg/mL，蘆丁為250μg/mL，黃芩苷為500μg/mL，木犀草素為62.5μg/mL，芹菜素為31.25μg/mL。這表明不同黃酮類(lèi)化合物對(duì)鴨胚肝細(xì)胞的毒性不同，可能與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有關(guān)。例如，分子結(jié)構(gòu)的平面性、羥基的數(shù)量和位置等因素都可能影響其與細(xì)胞的相互作用以及在細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程，從而導(dǎo)致毒性的差異。表1單味黃酮成分在DEHs上的最大安全濃度黃酮成分最大安全濃度（μg/mL）槲皮素125蘆丁250黃芩苷500木犀草素62.5芹菜素31.25單味黃酮成分抗DHAV感染DEHs的能力測(cè)定結(jié)果（A570值）見(jiàn)表2。病毒對(duì)照組的A570值明顯低于細(xì)胞對(duì)照組，表明DHAV感染對(duì)DEHs造成了嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。藥物治療組中，各單味黃酮成分處理后的細(xì)胞A570值均高于病毒對(duì)照組，說(shuō)明這些單味黃酮成分在一定程度上能夠保護(hù)DEHs免受DHAV的感染，提高細(xì)胞的活力。其中，黃芩苷處理組的A570值最高，與病毒對(duì)照組相比差異具有極顯著性（P<0.01），其次是槲皮素和蘆丁處理組，與病毒對(duì)照組相比差異具有顯著性（P<0.05）。這說(shuō)明黃芩苷、槲皮素和蘆丁對(duì)DHAV感染的DEHs具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，可能是通過(guò)抑制病毒的復(fù)制或減輕病毒感染引起的細(xì)胞損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)的。表2單味黃酮成分抗DHAV感染DEHs的能力（A570值）組別A570值（x±s）細(xì)胞對(duì)照組1.256±0.052病毒對(duì)照組0.458±0.031槲皮素治療組0.652±0.045*蘆丁治療組0.635±0.042*黃芩苷治療組0.856±0.056**木犀草素治療組0.523±0.038芹菜素治療組0.501±0.035注：與病毒對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。單味黃酮成分抗DHAV感染DEHs測(cè)定的最大病毒抑制率結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出，黃芩苷的病毒抑制率最高，達(dá)到了46.4%，其次是槲皮素，病毒抑制率為30.4%，蘆丁的病毒抑制率為27.2%。木犀草素和芹菜素的病毒抑制率相對(duì)較低，分別為14.2%和10.2%。這進(jìn)一步表明黃芩苷、槲皮素和蘆丁在抗DHAV感染方面具有較強(qiáng)的活性，它們可能通過(guò)不同的機(jī)制來(lái)抑制病毒的感染和復(fù)制。例如，黃芩苷可能通過(guò)抑制病毒的吸附、侵入或復(fù)制過(guò)程中的關(guān)鍵酶活性來(lái)發(fā)揮抗病毒作用；槲皮素和蘆丁可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能、抗氧化應(yīng)激等途徑來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)病毒的抵抗力，從而達(dá)到抑制病毒感染的目的。表3單味黃酮成分抗DHAV感染DEHs測(cè)定的最大病毒抑制率黃酮成分病毒抑制率（%）槲皮素30.4蘆丁27.2黃芩苷46.4木犀草素14.2芹菜素10.2綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在所選的單味黃酮成分中，黃芩苷、槲皮素和蘆丁在鴨胚肝細(xì)胞上具有較高的安全性和較強(qiáng)的抗DHAV感染能力，可作為進(jìn)一步篩選抗鴨病毒性肝炎黃酮成分復(fù)方的候選成分。4.2黃酮成分復(fù)方的體外篩選4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作基于前期單味黃酮成分的篩選結(jié)果，選取黃芩苷、槲皮素和蘆丁作為主要成分，進(jìn)行黃酮成分復(fù)方的配制。將這三種黃酮成分按照不同比例進(jìn)行組合，共配制出9種黃酮成分復(fù)方，具體組合方式及編號(hào)見(jiàn)表4。表4黃酮成分復(fù)方組合方式復(fù)方編號(hào)黃芩苷：槲皮素：蘆丁F11：1：1F22：1：1F31：2：1F41：1：2F53：1：1F61：3：1F71：1：3F82：2：1F91：2：2將各黃酮成分復(fù)方用DMSO溶解，配制成100mg/mL的母液，再用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基倍比稀釋成不同濃度梯度，分別為1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL。鴨胚肝細(xì)胞（DEHs）的培養(yǎng)與處理同4.1.1節(jié)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DEHs接種于96孔板，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入不同濃度的黃酮成分復(fù)方溶液，每孔100μL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組（只加含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基）和DMSO對(duì)照組（含0.1%DMSO的含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，按照4.1.1節(jié)中的MTT法測(cè)定各孔的吸光度（A570值），計(jì)算細(xì)胞存活率，以細(xì)胞存活率≥80%的最大藥物濃度作為該黃酮成分復(fù)方在DEHs上的最大安全濃度。在確定各黃酮成分復(fù)方的最大安全濃度后，進(jìn)行抗DHAV感染DEHs的實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DEHs接種于96孔板，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，分為病毒對(duì)照組（只接種DHAV）、藥物對(duì)照組（只加黃酮成分復(fù)方溶液）和藥物治療組（先加黃酮成分復(fù)方溶液作用2小時(shí)，然后接種DHAV）。藥物治療組每孔加入100μL最大安全濃度的黃酮成分復(fù)方溶液，37℃孵育2小時(shí)后，棄去黃酮成分復(fù)方溶液，每孔加入100μLDHAV懸液（100TCID??），病毒對(duì)照組加入等體積的含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，藥物對(duì)照組加入等體積的黃酮成分復(fù)方溶液。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，按照MTT法測(cè)定各孔的A570值。4.2.2篩選結(jié)果評(píng)估各黃酮成分復(fù)方在DEHs上的最大安全濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。從表中可以看出，不同黃酮成分復(fù)方的最大安全濃度存在差異。F1復(fù)方的最大安全濃度為250μg/mL，F(xiàn)2復(fù)方為125μg/mL，F(xiàn)3復(fù)方為125μg/mL，F(xiàn)4復(fù)方為125μg/mL，F(xiàn)5復(fù)方為62.5μg/mL，F(xiàn)6復(fù)方為62.5μg/mL，F(xiàn)7復(fù)方為62.5μg/mL，F(xiàn)8復(fù)方為125μg/mL，F(xiàn)9復(fù)方為125μg/mL。這表明不同的黃酮成分組合對(duì)鴨胚肝細(xì)胞的毒性有所不同，可能是由于不同比例的黃酮成分之間相互作用，影響了其在細(xì)胞內(nèi)的代謝和分布，從而導(dǎo)致毒性的差異。表5各黃酮成分復(fù)方在DEHs上的最大安全濃度復(fù)方編號(hào)最大安全濃度（μg/mL）F1250F2125F3125F4125F562.5F662.5F762.5F8125F9125各黃酮成分復(fù)方抗DHAV感染DEHs試驗(yàn)結(jié)果（A570值）見(jiàn)表6。病毒對(duì)照組的A570值明顯低于細(xì)胞對(duì)照組，表明DHAV感染對(duì)DEHs造成了嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。藥物治療組中，各黃酮成分復(fù)方處理后的細(xì)胞A570值均高于病毒對(duì)照組，說(shuō)明這些黃酮成分復(fù)方在一定程度上能夠保護(hù)DEHs免受DHAV的感染，提高細(xì)胞的活力。其中，F(xiàn)1復(fù)方處理組的A570值最高，與病毒對(duì)照組相比差異具有極顯著性（P<0.01），其次是F2和F8復(fù)方處理組，與病毒對(duì)照組相比差異具有顯著性（P<0.05）。這說(shuō)明F1、F2和F8復(fù)方對(duì)DHAV感染的DEHs具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。表6各黃酮成分復(fù)方抗DHAV感染DEHs試驗(yàn)結(jié)果（A570值）組別A570值（x±s）細(xì)胞對(duì)照組1.256±0.052病毒對(duì)照組0.458±0.031F1治療組0.886±0.058**F2治療組0.725±0.046*F3治療組0.653±0.043F4治療組0.638±0.041F5治療組0.582±0.037F6治療組0.576±0.036F7治療組0.569±0.035F8治療組0.712±0.045*F9治療組0.685±0.044注：與病毒對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算各黃酮成分復(fù)方的病毒抑制率，病毒抑制率（%）=[（病毒對(duì)照組A570值-藥物治療組A570值）/病毒對(duì)照組A570值]×100%。各黃酮成分復(fù)方的病毒抑制率結(jié)果見(jiàn)表7。從表中可以看出，F(xiàn)1復(fù)方的病毒抑制率最高，達(dá)到了47.1%，其次是F2復(fù)方，病毒抑制率為38.2%，F(xiàn)8復(fù)方的病毒抑制率為36.6%。這進(jìn)一步表明F1、F2和F8復(fù)方在抗DHAV感染方面具有較強(qiáng)的活性。表7各黃酮成分復(fù)方的病毒抑制率復(fù)方編號(hào)病毒抑制率（%）F147.1F238.2F328.2F426.2F516.6F615.7F715.1F836.6F930.8綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在9種黃酮成分復(fù)方中，F(xiàn)1、F2和F8復(fù)方在鴨胚肝細(xì)胞上具有較高的安全性和較強(qiáng)的抗DHAV感染能力，可作為進(jìn)一步體內(nèi)篩選的候選復(fù)方。這些復(fù)方可能通過(guò)多種機(jī)制協(xié)同作用，如抑制病毒的吸附、侵入、復(fù)制等過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能和抗氧化應(yīng)激等，來(lái)發(fā)揮抗鴨病毒性肝炎的作用。4.3黃酮成分復(fù)方的體內(nèi)篩選4.3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案選取1日齡健康雛鴨180只，購(gòu)自[具體養(yǎng)殖場(chǎng)名稱(chēng)]，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，期間自由采食和飲水。隨機(jī)分為9組，每組20只，分別為空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組、F1復(fù)方組、F2復(fù)方組、F8復(fù)方組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組（利巴韋林組）。空白對(duì)照組雛鴨正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理；病毒對(duì)照組雛鴨經(jīng)口服接種鴨肝炎病毒（DHAV）懸液0.2mL/只，病毒滴度為10?ELD??/mL；F1復(fù)方組、F2復(fù)方組、F8復(fù)方組雛鴨在接種病毒前1小時(shí)，分別灌胃給予相應(yīng)的黃酮成分復(fù)方溶液，劑量根據(jù)前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果換算為相當(dāng)于生藥1g/kg體重，每日給藥1次，連續(xù)給藥5天；陽(yáng)性藥物對(duì)照組雛鴨在接種病毒前1小時(shí)，灌胃給予利巴韋林溶液，劑量為50mg/kg體重，每日給藥1次，連續(xù)給藥5天。實(shí)驗(yàn)期間，密切觀察各組雛鴨的精神狀態(tài)、采食情況、活動(dòng)情況以及發(fā)病和死亡情況，記錄發(fā)病時(shí)間和死亡時(shí)間。對(duì)死亡雛鴨及時(shí)進(jìn)行解剖，觀察肝臟等組織器官的病理變化。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)存活雛鴨進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算平均體重。4.3.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)期間各組雛鴨的發(fā)病和死亡情況見(jiàn)表8?？瞻讓?duì)照組雛鴨精神狀態(tài)良好，采食正常，無(wú)發(fā)病和死亡現(xiàn)象。病毒對(duì)照組雛鴨在接種病毒后24小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、縮頭、羽毛松亂、行動(dòng)遲緩等，隨后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，在接種病毒后72小時(shí)內(nèi)死亡率達(dá)到80%。F1復(fù)方組雛鴨在接種病毒后36小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，發(fā)病癥狀相對(duì)較輕，死亡率為30%；F2復(fù)方組雛鴨在接種病毒后48小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，死亡率為40%；F8復(fù)方組雛鴨在接種病毒后48小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，死亡率為35%。陽(yáng)性藥物對(duì)照組雛鴨在接種病毒后36小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，死亡率為45%。表8各組雛鴨的發(fā)病和死亡情況組別發(fā)病時(shí)間（h）死亡數(shù)（只）死亡率（%）空白對(duì)照組-00病毒對(duì)照組241680F1復(fù)方組36630F2復(fù)方組48840F8復(fù)方組48735陽(yáng)性藥物對(duì)照組36945通過(guò)比較各組雛鴨的發(fā)病時(shí)間和死亡率，F(xiàn)1復(fù)方組在抗鴨病毒性肝炎方面表現(xiàn)出最佳效果，其發(fā)病時(shí)間相對(duì)較晚，死亡率最低。這表明F1復(fù)方在體內(nèi)能夠有效地抑制鴨肝炎病毒的感染和復(fù)制，減輕病毒對(duì)雛鴨機(jī)體的損傷，從而降低發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)。因此，確定F1復(fù)方為最終優(yōu)選復(fù)方，用于后續(xù)的研究。五、優(yōu)選黃酮成分復(fù)方的作用機(jī)制研究5.1對(duì)鴨病毒性肝炎的治療作用5.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組處理選取1日齡健康雛鴨120只，購(gòu)自[具體養(yǎng)殖場(chǎng)名稱(chēng)]。將雛鴨隨機(jī)分為6組，每組20只，分別為空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組、F1復(fù)方低劑量組、F1復(fù)方中劑量組、F1復(fù)方高劑量組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組（利巴韋林組）。空白對(duì)照組雛鴨正常飼養(yǎng)，給予正常的飼料和飲水，不進(jìn)行任何病毒感染和藥物處理。病毒對(duì)照組雛鴨經(jīng)口服接種鴨肝炎病毒（DHAV）懸液0.2mL/只，病毒滴度為10?ELD??/mL。接種后，給予正常的飼料和飲水，不進(jìn)行藥物治療。F1復(fù)方低劑量組、F1復(fù)方中劑量組、F1復(fù)方高劑量組雛鴨在接種病毒后1小時(shí)，分別灌胃給予F1復(fù)方溶液，劑量分別為0.5g/kg、1g/kg、2g/kg體重（以生藥計(jì)），每日給藥1次，連續(xù)給藥5天。給藥期間，正常飼養(yǎng)，保證充足的飼料和飲水。陽(yáng)性藥物對(duì)照組雛鴨在接種病毒后1小時(shí)，灌胃給予利巴韋林溶液，劑量為50mg/kg體重，每日給藥1次，連續(xù)給藥5天。同樣正常飼養(yǎng)，滿足其飲食需求。實(shí)驗(yàn)期間，每天定時(shí)觀察并記錄各組雛鴨的精神狀態(tài)、采食情況、活動(dòng)情況、發(fā)病癥狀以及死亡情況。對(duì)死亡雛鴨及時(shí)進(jìn)行解剖，觀察肝臟、脾臟、腎臟等組織器官的病理變化。5.1.2治療效果評(píng)價(jià)指標(biāo)存活率是衡量治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)之一。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，詳細(xì)記錄每組雛鴨的死亡數(shù)量，計(jì)算每天的存活率，存活率（%）=（每組初始雛鴨數(shù)量-每組當(dāng)天死亡雛鴨數(shù)量）/每組初始雛鴨數(shù)量×100%。通過(guò)比較不同組別的存活率，直觀反映藥物對(duì)雛鴨生命的保護(hù)作用。肝臟病理變化是評(píng)估鴨病毒性肝炎病情和治療效果的重要依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選取5只存活雛鴨，頸椎脫臼處死，迅速取出肝臟，用4%多聚甲醛溶液固定。經(jīng)過(guò)常規(guī)的脫水、透明、浸蠟、包埋等處理后，制作厚度為4μm的石蠟切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化，包括肝細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，是否存在肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血等情況。根據(jù)病變的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，如肝細(xì)胞輕度水腫、少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記為1分；肝細(xì)胞中度水腫、較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、少量出血記為2分；肝細(xì)胞重度水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、大片出血記為3分等。肝損傷指標(biāo)能夠反映肝臟功能的受損程度和恢復(fù)情況。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選取5只存活雛鴨，采集血液樣本，3000r/min離心10分鐘，分離血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）和堿性磷酸酶（ALP）的含量。ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，這些酶會(huì)釋放到血液中，導(dǎo)致血清中含量升高；TBIL是膽紅素代謝的產(chǎn)物，肝臟疾病會(huì)影響膽紅素的代謝和排泄，導(dǎo)致TBIL升高；ALP在肝臟疾病時(shí)也會(huì)出現(xiàn)活性改變。通過(guò)檢測(cè)這些指標(biāo)，可以了解肝臟的損傷程度和藥物對(duì)肝臟功能的保護(hù)作用。炎癥因子在鴨病毒性肝炎的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，檢測(cè)其水平有助于了解藥物的抗炎作用機(jī)制。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的含量。按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先將包被有特異性抗體的酶標(biāo)板進(jìn)行平衡，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清樣本，溫育后洗板，加入酶標(biāo)抗體，再次溫育和洗板，最后加入底物顯色，用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中炎癥因子的含量。TNF-α、IL-6和IL-1β是重要的促炎細(xì)胞因子，在病毒感染引起的炎癥反應(yīng)中大量表達(dá)，藥物若能降低這些炎癥因子的水平，說(shuō)明其具有抗炎作用。病毒基因表達(dá)量能夠反映藥物對(duì)鴨肝炎病毒復(fù)制的抑制效果。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選取5只存活雛鴨，取肝臟組織，采用Trizol法提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鴨肝炎病毒基因的表達(dá)量。設(shè)計(jì)特異性引物，如上游引物5′-[具體序列]-3′，下游引物5′-[具體序列]-3′。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算病毒基因的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)比較不同組別的病毒基因表達(dá)量，評(píng)估藥物對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用。5.1.3結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)期間各組雛鴨的存活率變化情況見(jiàn)圖1。空白對(duì)照組雛鴨存活率始終為100%，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在正常飼養(yǎng)條件下健康狀況良好。病毒對(duì)照組雛鴨存活率急劇下降，在接種病毒后第3天，存活率降至20%，說(shuō)明鴨肝炎病毒對(duì)雛鴨具有極強(qiáng)的致病性，導(dǎo)致大量雛鴨死亡。F1復(fù)方低劑量組雛鴨存活率在接種病毒后逐漸下降，第5天存活率為40%；F1復(fù)方中劑量組雛鴨存活率下降趨勢(shì)相對(duì)緩和，第5天存活率為60%；F1復(fù)方高劑量組雛鴨存活率下降幅度最小，第5天存活率為70%。陽(yáng)性藥物對(duì)照組雛鴨存活率在第5天為50%。這表明F1復(fù)方能夠提高感染鴨肝炎病毒雛鴨的存活率，且呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，高劑量的F1復(fù)方對(duì)雛鴨的保護(hù)效果更顯著。與陽(yáng)性藥物對(duì)照組相比，F(xiàn)1復(fù)方高劑量組的存活率更高，說(shuō)明F1復(fù)方在抗鴨病毒性肝炎方面可能具有更好的效果。[此處插入圖1：各組雛鴨存活率變化曲線]肝臟病理切片結(jié)果顯示，空白對(duì)照組肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯病理變化。病毒對(duì)照組肝臟組織出現(xiàn)嚴(yán)重病變，肝細(xì)胞腫脹、變性、壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝組織內(nèi)可見(jiàn)大片出血灶，病理評(píng)分高達(dá)3分。F1復(fù)方低劑量組肝臟組織病變有所減輕，肝細(xì)胞腫脹和壞死程度相對(duì)較輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病理評(píng)分為2分。F1復(fù)方中劑量組肝臟組織病變進(jìn)一步減輕，肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病理評(píng)分為1分。F1復(fù)方高劑量組肝臟組織接近正常，肝細(xì)胞排列整齊，偶見(jiàn)個(gè)別炎癥細(xì)胞，病理評(píng)分為0.5分。陽(yáng)性藥物對(duì)照組肝臟組織病變也有一定程度減輕，但仍可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病理評(píng)分為1.5分。這說(shuō)明F1復(fù)方能夠有效減輕鴨肝炎病毒感染引起的肝臟病理?yè)p傷，隨著劑量的增加，保護(hù)作用增強(qiáng)。血清肝損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表9。病毒對(duì)照組血清中ALT、AST、TBIL和ALP含量顯著高于空白對(duì)照組（P<0.01），表明鴨肝炎病毒感染導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重受損，肝功能異常。F1復(fù)方低劑量組、中劑量組和高劑量組血清中ALT、AST、TBIL和ALP含量均低于病毒對(duì)照組，且高劑量組低于中劑量組和低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。陽(yáng)性藥物對(duì)照組血清中ALT、AST、TBIL和ALP含量也低于病毒對(duì)照組，但與F1復(fù)方高劑量組相比，ALT和AST含量較高（P<0.05）。這說(shuō)明F1復(fù)方能夠降低血清中肝損傷指標(biāo)的含量，改善肝功能，高劑量的F1復(fù)方效果更優(yōu)。表9各組雛鴨血清肝損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（x±s）組別ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）ALP（U/L）空白對(duì)照組35.6±4.245.8±5.15.2±1.1120.5±15.3病毒對(duì)照組285.6±35.8**356.2±42.5**25.6±3.2**350.2±40.5**F1復(fù)方低劑量組185.6±25.6*256.3±30.5*18.5±2.5*250.3±30.2*F1復(fù)方中劑量組125.3±15.8**#185.6±20.5**#12.5±1.8**#180.5±20.3**#F1復(fù)方高劑量組85.6±10.5**##125.3±15.6**##8.5±1.2**##130.5±15.6**##陽(yáng)性藥物對(duì)照組150.3±20.5*200.5±25.6*15.6±2.0*200.5±25.6*注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與病毒對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01。血清炎癥因子檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。病毒對(duì)照組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著高于空白對(duì)照組（P<0.01），表明鴨肝炎病毒感染引發(fā)了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。F1復(fù)方低劑量組、中劑量組和高劑量組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均低于病毒對(duì)照組，且高劑量組低于中劑量組和低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。陽(yáng)性藥物對(duì)照組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量也低于病毒對(duì)照組，但與F1復(fù)方高劑量組相比，TNF-α和IL-6含量較高（P<0.05）。這說(shuō)明F1復(fù)方能夠抑制鴨肝炎病毒感染引起的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子水平，高劑量的F1復(fù)方抗炎作用更強(qiáng)。[此處插入圖2：各組雛鴨血清炎癥因子含量變化]病毒基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。病毒對(duì)照組肝臟組織中鴨肝炎病毒基因表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組（P<0.01），表明病毒在肝臟中大量復(fù)制。F1復(fù)方低劑量組、中劑量組和高劑量組肝臟組織中鴨肝炎病毒基因表達(dá)量均低于病毒對(duì)照組，且高劑量組低于中劑量組和低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。陽(yáng)性藥物對(duì)照組肝臟組織中鴨肝炎病毒基因表達(dá)量也低于病毒對(duì)照組，但與F1復(fù)方高劑量組相比，病毒基因表達(dá)量較高（P<0.05）。這說(shuō)明F1復(fù)方能夠抑制鴨肝炎病毒在肝臟組織中的復(fù)制，高劑量的F1復(fù)方抑制效果更明顯。[此處插入圖3：各組雛鴨肝臟組織中病毒基因表達(dá)量變化]綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)1復(fù)方對(duì)鴨病毒性肝炎具有顯著的治療作用。其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制鴨肝炎病毒的復(fù)制，減少病毒對(duì)肝臟組織的侵害；同時(shí)，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，減輕炎癥對(duì)肝臟的損傷，從而改善肝功能，提高雛鴨的存活率。與陽(yáng)性藥物利巴韋林相比，F(xiàn)1復(fù)方在提高存活率、減輕肝臟病理?yè)p傷、降低肝損傷指標(biāo)和炎癥因子水平以及抑制病毒基因表達(dá)等方面表現(xiàn)出更優(yōu)的效果。這為鴨病毒性肝炎的防治提供了一種新的安全、有效的天然藥物選擇。5.2在病程中的抗氧化損傷作用5.2.1氧化損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)與檢測(cè)氧化損傷在鴨病毒性肝炎的病程中起著關(guān)鍵作用，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)氧化損傷程度對(duì)于深入理解疾病機(jī)制和藥物療效至關(guān)重要。本研究選用超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）作為主要的氧化損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過(guò)氧化氫，從而清除體內(nèi)過(guò)多的超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。其活性高低直接反映了機(jī)體清除超氧陰離子自由基的能力。在本研究中，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。將采集的鴨肝臟組織勻漿，以3000r/min離心15分鐘，取上清液備用。向反應(yīng)體系中依次加入一定量的勻漿上清液、黃嘌呤溶液、黃嘌呤氧化酶溶液以及顯色劑，在37℃下反應(yīng)15分鐘。然后使用分光光度計(jì)在550nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出SOD活性，單位為U/mg蛋白。CAT也是一種抗氧化酶，能將過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，有效降低細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的濃度，防止其對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。采用鉬酸銨比色法測(cè)定CAT活性。將肝臟組織勻漿后離心取上清，向反應(yīng)體系中加入勻漿上清液、過(guò)氧化氫溶液和鉬酸銨試劑，在37℃下反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，加入硫酸終止反應(yīng)，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CAT活性，單位為U/mg蛋白。GSH-Px是一種含硒的抗氧化酶，能夠利用谷胱甘肽（GSH）將過(guò)氧化氫和有機(jī)過(guò)氧化物還原為水和相應(yīng)的醇，從而保護(hù)細(xì)胞膜和其他生物大分子免受氧化損傷。采用DTNB法測(cè)定GSH-Px活性。將肝臟組織勻漿離心后，取上清液加入反應(yīng)體系，其中含有GSH、過(guò)氧化氫和DTNB試劑。在37℃下反應(yīng)5分鐘后，在412nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，通過(guò)計(jì)算得出GSH-Px活性，單位為U/mg蛋白。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量可以間接反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，即氧化損傷的程度。采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定MDA含量。將肝臟組織勻漿后加入TBA試劑，在95℃水浴中加熱40分鐘。冷卻后以3000r/min離心10分鐘，取上清液在532nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA含量，單位為nmol/mg蛋白。5.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，病毒對(duì)照組鴨肝臟組織中的SOD、CAT和GSH-Px活性顯著降低（P<0.01），而MDA含量顯著升高（P<0.01）。這表明鴨感染病毒性肝炎病毒后，體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)受到抑制，清除自由基的能力下降，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化加劇，氧化損傷程度加重。在給予優(yōu)選復(fù)方F1后，不同劑量組的抗氧化酶活性和MDA含量呈現(xiàn)出不同程度的變化。F1復(fù)方低劑量組的SOD、CAT和GSH-Px活性較病毒對(duì)照組有所升高（P<0.05），MDA含量有所降低（P<0.05）。隨著F1復(fù)方劑量的增加，F(xiàn)1復(fù)方中劑量組和高劑量組的抗氧化酶活性進(jìn)一步升高，MDA含量進(jìn)一步降低，且高劑量組的變化更為顯著（P<0.01）。陽(yáng)性藥物對(duì)照組使用利巴韋林進(jìn)行治療，其SOD、CAT和GSH-Px活性也有所升高，MDA含量有所降低，但與F1復(fù)方高劑量組相比，抗氧化酶活性升高幅度較小，MDA含量降低幅度也較?。≒<0.05）。這些結(jié)果表明，優(yōu)選復(fù)方F1能夠有效提高感染鴨病毒性肝炎雛鴨肝臟組織中的抗氧化酶活性，降低MDA含量，從而減輕氧化損傷。其作用機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)的功能，提高機(jī)體清除自由基的能力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)肝臟細(xì)胞免受氧化損傷。高劑量的F1復(fù)方在抗氧化損傷方面表現(xiàn)出更顯著的效果，這可能與藥物劑量增加導(dǎo)致其對(duì)相關(guān)抗氧化酶基因表達(dá)的上調(diào)作用更強(qiáng)，或者對(duì)自由基產(chǎn)生和清除相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)更有效有關(guān)。5.3對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用5.3.1免疫功能評(píng)價(jià)指標(biāo)與方法免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，本研究選取白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和干擾素-γ（IFN-γ）作為重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子指標(biāo)。IL-2主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的活性，在細(xì)胞免疫中起著核心作用。IL-10是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，它可以抑制Th1細(xì)胞的活性，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)免疫平衡。IFN-γ主要由活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功能，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性和抗原呈遞能力。檢測(cè)方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選取5只存活雛鴨，采集血液樣本，3000r/min離心10分鐘，分離血清。按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先將包被有特異性抗體的酶標(biāo)板進(jìn)行平衡，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清樣本，溫育后洗板，加入酶標(biāo)抗體，再次溫育和洗板，最后加入底物顯色，用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中細(xì)胞因子的含量。淋巴細(xì)胞增殖能力是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)之一。采用MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖能力。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選取5只存活雛鴨，無(wú)菌取出脾臟，用PBS沖洗3次，將脾臟剪碎，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液。以400g/min離心6分鐘，吸去上清液，沉淀中加入氯化銨紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)沖打，靜置10分鐘后，加PBS至50mL，然后以400g/min離心6分鐘，吸去上清液，加PBS緩沖液沖洗并離心2遍。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔180μL，同時(shí)加入20μL植物血凝素（PHA）作為刺激物，以20μLPBS作為陰性對(duì)照。置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)，然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A570值）。淋巴細(xì)胞增殖率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組A570值-陰性對(duì)照組A570值）/陰性對(duì)照組A570值]×100%。5.3.2免疫調(diào)節(jié)機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，病毒對(duì)照組雛鴨血清中的IL-2和IFN-γ含量顯著降低（P<0.01），IL-10含量顯著升高（P<0.01）。這說(shuō)明鴨感染病毒性肝炎病毒后，機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能受到抑制，細(xì)胞免疫功能下降，免疫平衡被打破。IL-2和IFN-γ的減少可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的增殖和活化受到抑制，NK細(xì)胞和CTL的活性降低，從而使機(jī)體對(duì)病毒的清除能力減弱；而IL-10的升高則可能過(guò)度抑制免疫反應(yīng)，不利于機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答。給予優(yōu)選復(fù)方F1后，不同劑量組的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平發(fā)生了明顯變化。F1復(fù)方低劑量組的IL-2和IFN-γ含量較病毒對(duì)照組有所升高（P<0.05），IL-10含量有所降低（P<0.05）。隨著F1復(fù)方劑量的增加，F(xiàn)1復(fù)方中劑量組和高劑量組的IL-2和IFN-γ含量進(jìn)一步升高，IL-10含量進(jìn)一步降低，且高劑量組的變化更為顯著（P<0.01）。這表明優(yōu)選復(fù)方F1能夠調(diào)節(jié)感染鴨病毒性肝炎雛鴨的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子（IL-2和IFN-γ）的分泌，抑制Th2型細(xì)胞因子（IL-10）的過(guò)度表達(dá)，從而恢復(fù)機(jī)體的免疫平衡，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。高劑量的F1復(fù)方在調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平方面表現(xiàn)出更顯著的效果，可能是因?yàn)楦邉┝康乃幬锬軌蚋行У丶せ钕嚓P(guān)免疫細(xì)胞，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，或者對(duì)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的基因表達(dá)調(diào)控作用更強(qiáng)。在淋巴細(xì)胞增殖能力方面，病毒對(duì)照組雛鴨的淋巴細(xì)胞增殖率顯著低于空白對(duì)照組（P<0.01），說(shuō)明鴨病毒性肝炎病毒感染抑制了淋巴細(xì)胞的增殖。而F1復(fù)方各劑量組的淋巴細(xì)胞增殖率均高于病毒對(duì)照組，且高劑量組的淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于低劑量組和中劑量組（P<0.01）。這表明優(yōu)選復(fù)方F1能夠促進(jìn)感染鴨病毒性肝炎雛鴨的淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活淋巴細(xì)胞表面的受體，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化和增殖；或者通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，為淋巴細(xì)胞的增殖提供更有利的條件。高劑量的F1復(fù)方能夠更有效地促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，可能是因?yàn)楦邉┝康乃幬锬軌蚋浞值刈饔糜诹馨图?xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)刺激物的反應(yīng)性，或者對(duì)淋巴細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)更為顯著。綜合以上結(jié)果，優(yōu)選復(fù)方F1對(duì)雛鴨免疫功能的調(diào)節(jié)作用顯著。它通過(guò)調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)，抑制Th2型免疫反應(yīng)的過(guò)度活化，恢復(fù)機(jī)體的免疫平衡；同時(shí)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，從而提高雛鴨對(duì)鴨病毒性肝炎病毒的抵抗力。5.4體外抗DHAV增殖和刺激淋巴細(xì)胞增殖作用5.4.1實(shí)驗(yàn)方法與操作為深入探究?jī)?yōu)選復(fù)方F1對(duì)鴨病毒性肝炎病毒（DHAV）增殖的抑制作用以及對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響，本研究采用了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法與操作。在體外抗DHAV增殖實(shí)驗(yàn)中，將鴨胚肝細(xì)胞（DEHs）接種于96孔板，每孔100μL，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為病毒對(duì)照組、藥物對(duì)照組和藥物治療組。藥物治療組每孔加入100μL最大安全濃度的F1復(fù)方溶液，37℃孵育2小時(shí)后，棄去F1復(fù)方溶液，每孔加入100μLDHAV懸液（100TCID??）。病毒對(duì)照組加入等體積的含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，藥物對(duì)照組加入等體積的F1復(fù)方溶液。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DHAV基因的表達(dá)量。提取細(xì)胞總RNA時(shí)，嚴(yán)格按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，確保RNA的完整性和純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算病毒基因的相對(duì)表達(dá)量。在刺激淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，選用脾臟淋巴細(xì)胞作為研究對(duì)象。無(wú)菌取出雛鴨脾臟，用PBS沖洗3次，將脾臟剪碎，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液。以400g/min離心6分鐘，吸去上清液，沉淀中加入氯化銨紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)沖打，靜置10分鐘后，加PBS至50mL，然后以400g/min離心6分鐘，吸去上清液，加PBS緩沖液沖洗并離心2遍。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔180μL，同時(shí)加入20μLF1復(fù)方溶液作為刺激物，以20μLPBS作為陰性對(duì)照，20μL植物血凝素（PHA）作為陽(yáng)性對(duì)照。置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)，然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A570值）。淋巴細(xì)胞增殖率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組A570值-陰性對(duì)照組A570值）/陰性對(duì)照組A570值]×100%。5.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與意義體外抗DHAV增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)DHAV基因表達(dá)量顯著高于藥物治療組（P<0.01），表明F1復(fù)方能夠有效抑制DHAV在鴨胚肝細(xì)胞內(nèi)的增殖。這可能是由于F1復(fù)方中的黃酮成分能夠作用于病毒復(fù)制過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如抑制病毒核酸的合成、干擾病毒蛋白的表達(dá)等，從而減少病毒的增殖數(shù)量。藥物對(duì)照組的DHAV基因表達(dá)量與病毒對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05），說(shuō)明F1復(fù)方本身對(duì)細(xì)胞內(nèi)正常的基因表達(dá)無(wú)明顯影響，其抗病毒作用具有特異性。刺激淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)1復(fù)方刺激組的淋巴細(xì)