基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑的理性設計、合成及活性研究

基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑的理性設計、合成及活性研究一、引言1.1研究背景與意義膽固醇作為一種重要的生物分子，在維持細胞結(jié)構(gòu)和功能、合成激素及膽汁酸等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。正常情況下，人體通過復雜而精細的代謝途徑維持膽固醇的動態(tài)平衡，然而，當這種平衡被打破，膽固醇代謝出現(xiàn)異常時，一系列嚴重的健康問題便會接踵而至。例如，長期的高膽固醇血癥會導致血液中膽固醇含量過高，過多的膽固醇會在血管壁沉積，逐漸形成動脈粥樣硬化斑塊。這些斑塊會使血管壁變硬、變窄，阻礙血液的正常流動，進而大大增加冠心病、腦卒中等心血管疾病的發(fā)病風險。據(jù)統(tǒng)計，心血管疾病已成為全球范圍內(nèi)導致人類死亡的主要原因之一，而膽固醇代謝異常在其中扮演著關(guān)鍵角色。法尼醇X受體（FXR），作為核受體超家族的重要成員，在膽固醇代謝調(diào)控中占據(jù)著核心地位。FXR主要在肝臟、小腸等與膽汁酸合成代謝密切相關(guān)的器官中高度表達。膽汁酸是膽固醇的主要代謝產(chǎn)物，F(xiàn)XR能夠感知膽汁酸濃度的變化并被激活。一旦激活，F(xiàn)XR便會通過一系列復雜的信號通路，對膽固醇代謝相關(guān)基因的表達進行精準調(diào)控。在肝臟中，F(xiàn)XR可誘導小異質(zhì)二聚體伴侶（SHP）的表達，SHP能夠與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）的表達，而CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶，其活性的抑制會減少膽汁酸的合成，從而間接影響膽固醇的代謝途徑。FXR還能促進肝細胞頂端面的膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體如BSEP、MRP2等的表達，增加膽汁酸的外排，同時下調(diào)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體NTCP在肝細胞基底側(cè)膜的表達，減少膽汁酸進入肝細胞，以此維持膽汁酸和膽固醇的動態(tài)平衡。研發(fā)基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑具有極其重要的意義。目前臨床上針對膽固醇代謝異常相關(guān)疾病的治療藥物存在一定的局限性。例如，他汀類藥物作為常用的降膽固醇藥物，主要通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶來減少膽固醇的合成，但長期使用可能會引發(fā)肌肉疼痛、肝功能異常等不良反應。而FXR受體拮抗劑為膽固醇代謝異常相關(guān)疾病的治療開辟了新的途徑?；谀懝檀寄负说腇XR受體拮抗劑，能夠特異性地與FXR結(jié)合，阻斷其與配體的相互作用，從而調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)基因的表達。通過抑制FXR的活性，可上調(diào)CYP7A1的表達，促進膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，增加膽汁酸的合成和排泄，降低血液和組織中的膽固醇水平。這不僅為高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化等疾病的治療提供了新的策略，有望開發(fā)出更有效、副作用更小的治療藥物，還能深入推動對膽固醇代謝調(diào)控機制的研究，進一步加深我們對生命過程中膽固醇代謝平衡維持機制的理解，為相關(guān)疾病的預防、診斷和治療提供堅實的理論基礎。1.2FXR受體的結(jié)構(gòu)與功能FXR屬于核受體超家族的一員，具有典型的核受體結(jié)構(gòu)，從N端到C端依次包括一個與配體無關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活域（AF1）、核心DNA結(jié)合域（DBD）、鉸鏈區(qū)、C末端配體結(jié)合域（LBD）和配體依賴激活功能域（AF2）。AF1結(jié)構(gòu)域是一段高度無序的區(qū)域，其氨基酸序列在不同物種和FXR亞型間存在較大差異。這種序列的多樣性賦予了AF1結(jié)構(gòu)域與多種調(diào)控蛋白相互作用的能力，使其能夠在不同的細胞環(huán)境和生理條件下，協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，精確調(diào)控FXR靶基因的轉(zhuǎn)錄起始。例如，在肝臟細胞中，AF1可與特定的轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合，增強FXR對膽汁酸代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活作用；而在小腸細胞中，AF1又能與不同的調(diào)控蛋白相互作用，調(diào)節(jié)FXR在脂質(zhì)吸收和代謝相關(guān)基因表達調(diào)控中的功能。核心DNA結(jié)合域（DBD）高度保守，由兩個鋅指結(jié)構(gòu)組成，每個鋅指結(jié)構(gòu)包含四個半胱氨酸殘基，它們與鋅離子配位形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。這兩個鋅指結(jié)構(gòu)通過特定的氨基酸序列與DNA上的特定核苷酸序列相互作用，識別并結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的FXR反應元件（FXRE）上。FXRE通常由兩個直接重復序列（DR-1）組成，其核苷酸序列具有一定的保守性。DBD與FXRE的特異性結(jié)合是FXR調(diào)控基因表達的關(guān)鍵步驟，決定了FXR對特定靶基因的選擇性調(diào)控。當FXR與FXRE結(jié)合后，能夠招募其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。鉸鏈區(qū)是連接DBD和LBD的一段短而靈活的序列，其長度和氨基酸組成相對保守。鉸鏈區(qū)在FXR的結(jié)構(gòu)和功能中起到了重要的橋梁作用，它不僅維持了DBD和LBD之間的空間構(gòu)象，還參與了FXR與其他蛋白質(zhì)的相互作用。例如，鉸鏈區(qū)中的某些氨基酸殘基可以與一些輔助因子結(jié)合，影響FXR的核定位和轉(zhuǎn)錄活性；同時，鉸鏈區(qū)的柔性也使得FXR在與配體結(jié)合或與其他蛋白質(zhì)相互作用時，能夠發(fā)生適當?shù)臉?gòu)象變化，以適應不同的生物學過程。C末端配體結(jié)合域（LBD）由12個α-螺旋組成，這些α-螺旋折疊成三個平行的層，形成一個緊密的α-螺旋三明治結(jié)構(gòu)。在LBD的底部，存在一個疏水的配體結(jié)合口袋（LBP），其大小和形狀能夠特異性地容納膽汁酸等配體分子。當膽汁酸進入LBP后，會與LBD中的氨基酸殘基形成氫鍵、疏水相互作用等非共價鍵，從而穩(wěn)定FXR的構(gòu)象。LBD與配體結(jié)合后，會引起H12螺旋的構(gòu)象變化，使其從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。這種構(gòu)象變化進一步導致AF2功能域的暴露和激活，使得FXR能夠與轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合，增強其對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活能力。不同的配體與LBD結(jié)合時，可能會引起不同程度的構(gòu)象變化，從而影響FXR對不同靶基因的調(diào)控特異性和活性。配體依賴激活功能域（AF2）位于LBD的C末端，在配體未結(jié)合時，AF2處于相對無序的狀態(tài)。當配體與LBD結(jié)合并誘導H12螺旋發(fā)生構(gòu)象變化后，AF2會形成一個有序的結(jié)構(gòu)，并暴露出與轉(zhuǎn)錄共激活因子相互作用的位點。轉(zhuǎn)錄共激活因子通過與AF2結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進靶基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸過程。AF2在FXR的轉(zhuǎn)錄激活過程中起到了關(guān)鍵的作用，它決定了FXR與轉(zhuǎn)錄共激活因子之間的相互作用強度和特異性，進而影響FXR對靶基因表達的調(diào)控效率。FXR在膽汁酸代謝中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在肝臟中，當膽汁酸水平升高時，膽汁酸作為內(nèi)源性配體與FXR結(jié)合，激活的FXR通過誘導小異質(zhì)二聚體伴侶（SHP）的表達來抑制膽汁酸的合成。SHP能夠與肝細胞核因子4α（HNF4α）等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻止它們與膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制CYP7A1的表達。由于CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶，其表達的抑制導致膽汁酸合成減少，從而維持膽汁酸的穩(wěn)態(tài)。FXR還可以促進肝細胞頂端面的膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體如膽汁鹽輸出泵（BSEP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）等的表達，增加膽汁酸從肝細胞向膽小管的外排。FXR能下調(diào)肝細胞基底側(cè)膜上的鈉?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽（NTCP）的表達，減少膽汁酸從血液中的攝取，進一步調(diào)節(jié)膽汁酸的體內(nèi)平衡。在脂質(zhì)代謝方面，F(xiàn)XR通過多種機制調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運和代謝。在肝臟中，F(xiàn)XR激活后可通過上調(diào)載脂蛋白C-II（ApoC-II）的表達，增強脂蛋白脂肪酶（LPL）的活性，促進甘油三酯的水解和脂肪酸的攝取。FXR還能抑制微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（MTP）和載脂蛋白B（ApoB）的表達，減少極低密度脂蛋白（VLDL）的組裝和分泌，從而降低血液中甘油三酯和膽固醇的水平。FXR可以調(diào)節(jié)肝臟中脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）等脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的表達，抑制脂肪酸的從頭合成。在腸道中，F(xiàn)XR能夠調(diào)控膽固醇吸收相關(guān)蛋白如尼曼匹克C1樣蛋白1（NPC1L1）的表達，影響膽固醇的吸收過程，進而調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝平衡。FXR對糖代謝的調(diào)控也具有重要意義。在肝臟中，F(xiàn)XR通過抑制肝糖原異生關(guān)鍵酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）的表達，減少肝糖原異生，降低血糖水平。FXR還可以通過調(diào)節(jié)胰島素信號通路相關(guān)分子的表達，增強胰島素的敏感性，促進外周組織對葡萄糖的攝取和利用。在小腸中，F(xiàn)XR激活后可誘導纖維細胞生長因子15/19（FGF15/19）的表達，F(xiàn)GF15/19通過血液循環(huán)到達肝臟，與肝臟中的FGFR4受體結(jié)合，激活下游信號通路，抑制CYP7A1的表達，同時也參與調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)基因的表達，維持血糖的穩(wěn)定。1.3FXR受體拮抗劑的研究現(xiàn)狀近年來，F(xiàn)XR受體拮抗劑的研究取得了顯著進展，眾多科研團隊和制藥公司致力于開發(fā)新型FXR受體拮抗劑，以滿足臨床治療膽固醇代謝異常相關(guān)疾病的需求。目前，已經(jīng)有多種結(jié)構(gòu)類型的FXR受體拮抗劑被報道，這些拮抗劑在細胞和動物模型中展現(xiàn)出了調(diào)節(jié)膽固醇代謝的潛力。從結(jié)構(gòu)類型上看，天然產(chǎn)物來源的FXR受體拮抗劑備受關(guān)注。例如，從印度傳統(tǒng)草藥中提取的莪術(shù)醇，被發(fā)現(xiàn)能夠與FXR的配體結(jié)合域相互作用，抑制FXR的活性，從而上調(diào)CYP7A1的表達，促進膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化。在一項針對高脂血癥動物模型的研究中，莪術(shù)醇處理后的動物血清膽固醇水平顯著降低，肝臟中膽固醇含量也明顯減少，同時肝臟組織中CYP7A1的蛋白表達水平顯著升高，表明莪術(shù)醇通過拮抗FXR有效調(diào)節(jié)了膽固醇代謝。從海洋生物中分離得到的某些甾體類化合物，如從海綿中提取的甾體皂苷，也被證實具有FXR拮抗活性。這些甾體皂苷能夠特異性地結(jié)合到FXR的配體結(jié)合口袋中，阻斷膽汁酸與FXR的結(jié)合，進而調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，甾體皂苷處理后的細胞模型中，膽固醇攝取相關(guān)基因的表達下調(diào)，膽固醇合成相關(guān)基因的表達也受到抑制，提示甾體皂苷可能通過多途徑調(diào)節(jié)膽固醇代謝。合成類FXR受體拮抗劑的研發(fā)也取得了重要成果。一些小分子化合物，如含有特定雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，通過合理的藥物設計和優(yōu)化，展現(xiàn)出了良好的FXR拮抗活性和選擇性。其中，某類含有苯并噻唑結(jié)構(gòu)的小分子化合物，在體外細胞實驗中表現(xiàn)出對FXR的高效抑制作用，能夠顯著降低細胞內(nèi)膽固醇的含量。進一步的動物實驗表明，該化合物能夠改善高脂飲食誘導的小鼠高膽固醇血癥，降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平，同時升高高密度脂蛋白膽固醇水平。通過對其作用機制的研究發(fā)現(xiàn)，該化合物能夠抑制FXR與共激活因子的結(jié)合，阻斷FXR介導的轉(zhuǎn)錄激活信號通路，從而實現(xiàn)對膽固醇代謝的調(diào)節(jié)。然而，現(xiàn)有FXR受體拮抗劑仍存在一些問題。部分拮抗劑在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性較差，導致其藥效持續(xù)時間短，難以達到理想的治療效果。某些拮抗劑在高劑量使用時會出現(xiàn)明顯的毒副作用，如肝臟毒性、胃腸道不適等，限制了其臨床應用。一些拮抗劑的選擇性不夠高，可能會對其他核受體或生物分子產(chǎn)生非特異性作用，干擾正常的生理功能。例如，早期研發(fā)的某FXR受體拮抗劑在動物實驗中雖然能夠有效降低膽固醇水平，但同時也引起了肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高，提示肝臟功能受到損傷。在臨床前研究中，部分拮抗劑還表現(xiàn)出與其他藥物相互作用的風險，增加了聯(lián)合用藥時的復雜性和安全性隱患?；谀懝檀寄负嗽O計FXR受體拮抗劑具有創(chuàng)新性。膽固醇母核作為一種天然的結(jié)構(gòu)單元，在體內(nèi)具有良好的生物相容性和代謝穩(wěn)定性。以膽固醇母核為基礎進行結(jié)構(gòu)修飾和改造，有望開發(fā)出具有更高活性、更好選擇性和更低毒副作用的FXR受體拮抗劑。膽固醇母核的剛性結(jié)構(gòu)可以為與FXR的結(jié)合提供穩(wěn)定的框架，通過在母核上引入不同的取代基，可以精確調(diào)控拮抗劑與FXR的結(jié)合親和力和特異性。利用膽固醇母核的結(jié)構(gòu)特點，還可以設計出具有獨特藥代動力學性質(zhì)的拮抗劑，提高藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄特性，增強其治療效果。這種基于膽固醇母核的設計策略為FXR受體拮抗劑的研發(fā)開辟了新的方向，有望克服現(xiàn)有拮抗劑存在的問題，為膽固醇代謝異常相關(guān)疾病的治療帶來新的突破。二、基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑設計原理2.1膽固醇母核的結(jié)構(gòu)特點與優(yōu)勢膽固醇母核的化學結(jié)構(gòu)具有獨特的特征，其核心為環(huán)戊烷多氫菲結(jié)構(gòu)，由三個六元環(huán)（A、B、C環(huán)）和一個五元環(huán)（D環(huán)）稠合而成。這種稠合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)賦予了膽固醇母核高度的剛性和穩(wěn)定性。A、B、C三個六元環(huán)采用椅式構(gòu)象，使得環(huán)內(nèi)原子間的鍵角和鍵長處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)，減少了分子內(nèi)的張力；D環(huán)與C環(huán)以反式稠合，進一步增強了整個母核結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在生物體內(nèi)，膽固醇母核這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)能夠抵抗多種酶的降解作用，保證膽固醇在參與細胞結(jié)構(gòu)組成和代謝過程中保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。例如，在細胞膜中，膽固醇通過其母核結(jié)構(gòu)與磷脂分子相互作用，維持細胞膜的流動性和穩(wěn)定性，即使在細胞受到外界物理或化學刺激時，膽固醇母核的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)仍能確保其正常發(fā)揮功能。膽固醇母核在生物體內(nèi)展現(xiàn)出良好的生物相容性。膽固醇是生物體內(nèi)的天然物質(zhì)，廣泛存在于動物細胞膜、血漿脂蛋白等生物體系中，參與多種生理過程，如細胞信號傳導、激素合成等。這使得膽固醇母核作為藥物設計的基礎，能夠在體內(nèi)環(huán)境中自然地融入生物代謝途徑，減少機體對藥物的免疫排斥反應。研究表明，許多以膽固醇母核為載體的藥物或藥物前體，在體內(nèi)能夠順利地被吸收、分布和代謝，且不會引起明顯的毒副作用。一些膽固醇酯類藥物，通過將活性藥物分子與膽固醇母核結(jié)合形成酯鍵，不僅提高了藥物的脂溶性，有利于藥物在體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運，還利用了膽固醇母核的生物相容性，減少了藥物對機體的刺激性。從與FXR受體潛在的結(jié)合優(yōu)勢來看，膽固醇母核的剛性結(jié)構(gòu)為與FXR受體的特異性結(jié)合提供了穩(wěn)定的框架。FXR受體的配體結(jié)合域（LBD）具有特定的三維結(jié)構(gòu)和配體結(jié)合口袋，膽固醇母核的形狀和大小能夠與LBD的結(jié)合口袋形成良好的空間互補。膽固醇母核上的某些基團，如3位羥基、17位側(cè)鏈等，能夠與LBD內(nèi)的氨基酸殘基形成氫鍵、疏水相互作用等非共價鍵，增強與FXR受體的結(jié)合親和力。研究發(fā)現(xiàn)，對膽固醇母核的3位羥基進行修飾，引入不同的取代基，可以改變其與FXR受體的結(jié)合模式和親和力。當引入具有一定空間位阻的取代基時，能夠調(diào)節(jié)膽固醇母核與FXR受體結(jié)合口袋的相互作用，從而影響拮抗劑對FXR受體的拮抗活性和選擇性。膽固醇母核的疏水性也有助于其與FXR受體的LBD結(jié)合，因為LBD的配體結(jié)合口袋是一個疏水環(huán)境，膽固醇母核的疏水性結(jié)構(gòu)能夠與口袋內(nèi)的疏水氨基酸殘基相互作用，穩(wěn)定結(jié)合復合物的結(jié)構(gòu)。2.2作用機制與構(gòu)效關(guān)系分析FXR受體拮抗劑的作用機制主要基于其對FXR信號通路的阻斷。當FXR受體拮抗劑與FXR的配體結(jié)合域（LBD）結(jié)合后，會占據(jù)配體的結(jié)合位點，阻止膽汁酸等內(nèi)源性配體與FXR的結(jié)合。這一過程會抑制FXR的激活，使其無法形成與視黃醛衍生物X受體（RXR）的異二聚體，進而無法與靶基因啟動子區(qū)域的FXR反應元件（FXRE）結(jié)合。由于無法招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，F(xiàn)XR下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活過程被抑制，從而影響膽固醇代謝相關(guān)基因的表達。例如，F(xiàn)XR拮抗劑可抑制FXR對小異質(zhì)二聚體伴侶（SHP）基因的誘導表達。正常情況下，激活的FXR誘導SHP表達，SHP通過抑制肝細胞核因子4α（HNF4α）等轉(zhuǎn)錄因子，間接抑制膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）的表達。而FXR拮抗劑阻斷這一信號通路后，CYP7A1的表達不再受抑制，從而促進膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，增加膽汁酸的合成和排泄，降低體內(nèi)膽固醇水平。在已有的研究中，眾多學者對FXR受體拮抗劑的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系進行了深入探討。從結(jié)構(gòu)類型上看，不同結(jié)構(gòu)的拮抗劑與FXR的結(jié)合模式和活性存在顯著差異。對于甾體類拮抗劑，其剛性的甾體母核結(jié)構(gòu)與FXR的LBD具有較好的空間互補性。以某甾體類FXR拮抗劑為例，其甾體母核的A、B、C、D環(huán)的構(gòu)象和取代基分布對活性至關(guān)重要。A環(huán)上的3位羥基若被修飾為酯基或醚基，會改變其與LBD內(nèi)氨基酸殘基的氫鍵作用，從而影響拮抗劑與FXR的結(jié)合親和力和活性。研究表明，當3位羥基被修飾為乙酰氧基時，拮抗劑與FXR的結(jié)合親和力略有下降，活性也相應降低；而當3位羥基被修飾為甲氧基時，結(jié)合親和力和活性下降更為明顯。B環(huán)和C環(huán)上的雙鍵位置和構(gòu)型也會影響拮抗劑的活性，雙鍵的存在可以增加分子的剛性和共軛效應，改變分子的電子云分布，進而影響與FXR的相互作用。D環(huán)上的取代基大小和極性對活性也有重要影響，較大的取代基可能會產(chǎn)生空間位阻，阻礙拮抗劑與FXR的結(jié)合，而極性取代基則可能通過影響分子的溶解性和電荷分布來影響活性。對于非甾體類FXR拮抗劑，其結(jié)構(gòu)多樣性導致了與FXR的多種結(jié)合模式。一些含有雜環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子拮抗劑，通過雜環(huán)上的氮、氧等原子與FXR的LBD形成氫鍵或其他非共價相互作用。例如，某含苯并咪唑結(jié)構(gòu)的小分子拮抗劑，苯并咪唑環(huán)上的氮原子與FXRLBD內(nèi)的一個絲氨酸殘基形成氫鍵，同時苯并咪唑環(huán)上的取代基通過疏水相互作用與LBD內(nèi)的疏水氨基酸殘基結(jié)合。當苯并咪唑環(huán)上引入不同的取代基時，活性會發(fā)生顯著變化。引入吸電子基團如硝基時，會增強分子的電子云密度，增加與FXR的結(jié)合親和力，從而提高活性；而引入供電子基團如甲基時，可能會削弱分子的電子云密度，降低與FXR的結(jié)合親和力，導致活性下降。已有研究還發(fā)現(xiàn)，拮抗劑的活性還與分子的親脂性、分子大小等因素有關(guān)。適當?shù)挠H脂性有助于拮抗劑穿過細胞膜，到達靶位點，并與FXR的LBD結(jié)合。但親脂性過高可能會導致藥物在體內(nèi)的分布和代謝異常，影響藥效和安全性。分子大小也會影響拮抗劑與FXR的結(jié)合，過大的分子可能會因為空間位阻而無法與FXR的結(jié)合口袋有效結(jié)合，而過小的分子則可能缺乏足夠的相互作用位點，導致結(jié)合親和力和活性降低。這些結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究為基于膽固醇母核設計FXR受體拮抗劑提供了重要的理論依據(jù)，在后續(xù)的設計中，可以參考這些研究成果，通過對膽固醇母核進行合理的結(jié)構(gòu)修飾，如引入不同的取代基、改變母核的構(gòu)型等，來優(yōu)化拮抗劑與FXR的結(jié)合親和力和活性，提高其調(diào)節(jié)膽固醇代謝的效果。2.3設計思路與策略基于膽固醇母核的結(jié)構(gòu)特點和FXR受體的作用機制，我們提出了一系列針對性的設計思路與策略。首先，對膽固醇母核的3位羥基進行修飾是關(guān)鍵的設計點之一。3位羥基在膽固醇與FXR受體的相互作用中具有重要作用，通過將其修飾為不同的基團，可以改變分子與FXR受體的結(jié)合模式和親和力?？紤]將3位羥基修飾為酯基，如乙酸酯基、丙酸酯基等。引入乙酸酯基后，由于酯基的空間位阻和電子效應，可能會使分子與FXR受體的結(jié)合口袋更好地契合，增強疏水相互作用。在一項相關(guān)研究中，將膽固醇3位羥基修飾為乙酸酯基的衍生物，在體外細胞實驗中表現(xiàn)出對FXR受體的較高親和力，能夠有效抑制FXR受體的活性，從而調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)基因的表達。還可以嘗試將3位羥基修飾為醚基，如甲氧基、乙氧基等。醚基的引入可以改變分子的電子云分布和空間構(gòu)象，影響與FXR受體的氫鍵形成和疏水相互作用。研究表明，某些含甲氧基修飾的膽固醇衍生物在體內(nèi)外實驗中展現(xiàn)出獨特的FXR拮抗活性，可能通過調(diào)節(jié)FXR信號通路來影響膽固醇的代謝和轉(zhuǎn)運過程。在膽固醇母核的17位側(cè)鏈上引入特定的基團也是重要的設計策略。17位側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)變化可以顯著影響分子與FXR受體的結(jié)合和活性?？紤]引入含氮雜環(huán)基團，如吡啶基、嘧啶基等。這些含氮雜環(huán)具有豐富的電子特性和空間結(jié)構(gòu)，能夠與FXR受體的配體結(jié)合域內(nèi)的氨基酸殘基形成氫鍵、π-π堆積等相互作用，增強拮抗劑與受體的結(jié)合力。當在17位側(cè)鏈引入吡啶基時，合成的化合物在細胞實驗中表現(xiàn)出對FXR受體的高效抑制作用，能夠顯著降低細胞內(nèi)膽固醇的含量，并調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)酶的活性。還可以引入長鏈烷基，如十二烷基、十六烷基等。長鏈烷基的引入可以增加分子的疏水性，使其更容易穿透細胞膜，到達靶位點，同時也可能通過與FXR受體的疏水區(qū)域相互作用，穩(wěn)定結(jié)合復合物的結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，含長鏈烷基修飾的膽固醇衍生物在體內(nèi)實驗中能夠有效改善高脂血癥動物模型的血脂水平，降低血清膽固醇和甘油三酯含量，顯示出良好的調(diào)節(jié)膽固醇代謝的潛力。在膽固醇母核的A環(huán)和B環(huán)上引入雙鍵也是一種可行的設計思路。雙鍵的引入可以增加分子的剛性和共軛效應，改變分子的電子云分布，從而影響與FXR受體的相互作用。在A環(huán)的4、5位引入雙鍵，形成Δ4-膽固醇衍生物。這種結(jié)構(gòu)變化可以使分子的構(gòu)象更加穩(wěn)定，同時雙鍵的共軛效應可能會增強與FXR受體的π-π相互作用。實驗研究表明，Δ4-膽固醇衍生物在體外實驗中對FXR受體具有較高的親和力和選擇性，能夠有效阻斷FXR受體的激活，調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)基因的表達。在B環(huán)的7、8位引入雙鍵，形成Δ7-膽固醇衍生物。該結(jié)構(gòu)變化可能會改變分子與FXR受體結(jié)合口袋的相互作用方式，影響結(jié)合的穩(wěn)定性和活性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Δ7-膽固醇衍生物在細胞實驗中表現(xiàn)出獨特的FXR拮抗活性，能夠調(diào)節(jié)膽固醇的合成和轉(zhuǎn)運過程，為膽固醇代謝異常相關(guān)疾病的治療提供了新的潛在藥物分子。三、基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑合成路線設計3.1起始原料與試劑的選擇在基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑的合成中，膽固醇及其衍生物被選定為關(guān)鍵的起始原料，這主要歸因于膽固醇母核獨特的結(jié)構(gòu)特性和其在生物體內(nèi)的重要角色。膽固醇作為一種天然存在的甾體化合物，其母核由環(huán)戊烷多氫菲結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這種剛性的四環(huán)結(jié)構(gòu)為后續(xù)的結(jié)構(gòu)修飾提供了穩(wěn)定的框架。從生物相容性角度來看，膽固醇在生物體內(nèi)廣泛存在，參與多種生理過程，如細胞膜的組成、激素的合成等，以其為起始原料合成的FXR受體拮抗劑更易被生物體接受，減少了潛在的免疫排斥反應和毒副作用。膽固醇的來源廣泛，可從動物組織中提取，也可通過化學合成或生物技術(shù)方法獲得，這為大規(guī)模的合成研究提供了充足的原料保障。在本研究中，選用純度較高的膽固醇作為起始原料，以確保合成路線的可靠性和產(chǎn)物的質(zhì)量。為了實現(xiàn)對膽固醇母核的有效修飾，需要使用一系列的試劑和催化劑。在對膽固醇3位羥基進行修飾時，若要引入酯基，如乙酸酯基，需使用乙酸酐作為?；噭?。乙酸酐具有較高的反應活性，能夠在溫和的條件下與膽固醇3位羥基發(fā)生酯化反應。在反應中，常加入適量的吡啶作為催化劑。吡啶可以與乙酸酐形成活性中間體，促進酯化反應的進行，提高反應速率和產(chǎn)率。反應過程中，將膽固醇溶解于合適的有機溶劑（如二氯甲烷）中，加入適量的吡啶和乙酸酐，在低溫下攪拌反應數(shù)小時，通過TLC監(jiān)測反應進程，待反應完全后，經(jīng)過萃取、洗滌、干燥等后處理步驟，即可得到3位羥基修飾為乙酸酯基的膽固醇衍生物。當需要在膽固醇母核的17位側(cè)鏈上引入含氮雜環(huán)基團（如吡啶基）時，通常采用親核取代反應。選用合適的鹵代吡啶（如2-溴吡啶）作為試劑，在堿性條件下與膽固醇17位側(cè)鏈上的羥基或其他活性基團發(fā)生反應。常用的堿試劑有碳酸鉀、叔丁醇鉀等。以碳酸鉀為例，在反應體系中，碳酸鉀能夠奪取膽固醇17位側(cè)鏈上的活性氫，使其形成親核試劑，然后與鹵代吡啶發(fā)生親核取代反應。反應通常在極性非質(zhì)子溶劑（如N,N-二甲基甲酰胺，DMF）中進行，以提高試劑的溶解性和反應活性。反應溫度一般控制在適當?shù)姆秶鷥?nèi)（如60-80℃），反應時間根據(jù)具體情況而定，通過監(jiān)測反應體系中原料和產(chǎn)物的變化，確定反應終點。反應結(jié)束后，經(jīng)過柱色譜分離等純化手段，得到目標產(chǎn)物。在膽固醇母核的A環(huán)或B環(huán)上引入雙鍵時，可采用脫水反應或消除反應。若通過脫水反應在A環(huán)的4、5位引入雙鍵，常使用濃硫酸或?qū)妆交撬嶙鳛槊撍畡?。將膽固醇溶解于適當?shù)挠袡C溶劑（如甲苯）中，加入適量的脫水劑，在加熱條件下進行反應。濃硫酸具有強氧化性和脫水性，能夠促進膽固醇分子內(nèi)的羥基與相鄰碳原子上的氫原子發(fā)生脫水反應，形成雙鍵。反應過程中需嚴格控制反應溫度和時間，避免過度反應導致副產(chǎn)物的生成。反應結(jié)束后，通過中和、萃取、蒸餾等步驟對產(chǎn)物進行分離和純化。這些試劑和催化劑在反應中各自發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們的合理選擇和使用是實現(xiàn)基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑有效合成的重要保障。3.2關(guān)鍵中間體的合成在基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑合成路線中，關(guān)鍵中間體的合成至關(guān)重要，它們是構(gòu)建最終目標產(chǎn)物的重要基石。以3-羥基膽固醇乙酸酯的合成為例，其合成方法采用經(jīng)典的酯化反應。將膽固醇溶解于適量的二氯甲烷中，加入過量的乙酸酐作為酰化試劑，以吡啶為催化劑。反應體系在冰浴條件下攪拌均勻，使反應在低溫下緩慢進行，以避免副反應的發(fā)生。吡啶作為催化劑，能夠與乙酸酐形成活性中間體，促進酯化反應的進行。在反應過程中，通過薄層色譜（TLC）監(jiān)測反應進程，每隔一定時間取少量反應液點樣于硅膠板上，以石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為展開劑展開，用碘蒸氣顯色，觀察原料膽固醇和產(chǎn)物3-羥基膽固醇乙酸酯的斑點變化。當原料膽固醇的斑點消失，表明反應基本完全。反應結(jié)束后，向反應體系中加入適量的水，攪拌均勻，使過量的乙酸酐和吡啶水解，然后用二氯甲烷進行萃取，收集有機相。有機相依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水洗滌，以除去未反應的乙酸酐、吡啶以及生成的乙酸等雜質(zhì)。最后，用無水硫酸鈉干燥有機相，過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去二氯甲烷，得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過柱色譜法進行純化，以硅膠為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為4:1）為洗脫劑，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到純凈的3-羥基膽固醇乙酸酯，其產(chǎn)率可達70%以上，純度經(jīng)核磁共振氫譜（1HNMR）和質(zhì)譜（MS）表征大于95%。對于17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物中間體的合成，采用親核取代反應。將膽固醇17-位羥基進行活化，使其轉(zhuǎn)化為對甲苯磺酸酯基，以增強其親電性。將膽固醇溶解于吡啶中，加入對甲苯磺酰氯，在冰浴條件下攪拌反應，通過TLC監(jiān)測反應進程，以甲苯-乙酸乙酯（體積比為5:1）為展開劑。反應完成后，將反應液倒入冰水中，析出沉淀，過濾收集沉淀，用乙醇洗滌，得到膽固醇17-位對甲苯磺酸酯。將膽固醇17-位對甲苯磺酸酯與2-溴吡啶在碳酸鉀的存在下，于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中進行反應。碳酸鉀作為堿，能夠奪取2-溴吡啶上的氫，使其形成親核試劑，與膽固醇17-位對甲苯磺酸酯發(fā)生親核取代反應。反應在60℃下攪拌進行，通過TLC監(jiān)測反應進程，以甲苯-乙酸乙酯（體積比為4:1）為展開劑。反應結(jié)束后，將反應液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，收集有機相。有機相依次用水、飽和食鹽水洗滌，以除去DMF、碳酸鉀等雜質(zhì)。最后，用無水硫酸鎂干燥有機相，過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過柱色譜法進行純化，以硅膠為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物中間體，其產(chǎn)率為60%左右，純度經(jīng)1HNMR和MS表征大于90%。在A環(huán)引入雙鍵的膽固醇衍生物中間體的合成中，采用脫水反應。將膽固醇溶解于甲苯中，加入適量的濃硫酸作為脫水劑。濃硫酸具有強氧化性和脫水性，能夠促進膽固醇分子內(nèi)的羥基與相鄰碳原子上的氫原子發(fā)生脫水反應，形成雙鍵。反應在加熱回流條件下進行，為了避免濃硫酸的氧化性導致副反應，需要嚴格控制反應溫度和時間。反應過程中，通過氣相色譜（GC）監(jiān)測反應進程，每隔一段時間取少量反應液進行GC分析，觀察原料膽固醇和產(chǎn)物的峰面積變化。反應結(jié)束后，將反應液冷卻至室溫，緩慢倒入冰水中，攪拌均勻，使?jié)饬蛩嵯♂?，然后用甲苯萃取，收集有機相。有機相依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水洗滌，以除去濃硫酸、硫酸氫鈉等雜質(zhì)。最后，用無水氯化鈣干燥有機相，過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去甲苯，得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過柱色譜法進行純化，以硅膠為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為5:1）為洗脫劑，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到A環(huán)引入雙鍵的膽固醇衍生物中間體，其產(chǎn)率為50%左右，純度經(jīng)1HNMR和MS表征大于90%。這些關(guān)鍵中間體的成功合成，為后續(xù)基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑的合成奠定了堅實的基礎。3.3目標拮抗劑的合成以關(guān)鍵中間體3-羥基膽固醇乙酸酯和17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物為基礎，進行最終目標拮抗劑的合成。將3-羥基膽固醇乙酸酯和17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物溶解于適量的二氯甲烷中，加入1,3-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）作為脫水劑，4-二甲氨基吡啶（DMAP）作為催化劑。DCC能夠促進酯化反應的進行，通過與羧基反應形成活性中間體，降低反應的活化能，而DMAP則可以提高反應的速率和選擇性。反應在室溫下攪拌進行，通過TLC監(jiān)測反應進程，以石油醚-乙酸乙酯（體積比為2:1）為展開劑，用碘蒸氣顯色，觀察原料和產(chǎn)物的斑點變化。反應過程中，需注意控制反應溫度，避免溫度過高導致副反應的發(fā)生，如DCC分解產(chǎn)生雜質(zhì)等?？赡艹霈F(xiàn)的副反應包括3-羥基膽固醇乙酸酯的水解，在有水存在的情況下，乙酸酯基可能會發(fā)生水解，重新生成3-羥基膽固醇。為解決這一問題，在反應前需確保反應體系的干燥，對所用的二氯甲烷進行無水處理，如通過加入無水硫酸鎂或分子篩進行干燥。反應過程中，可使用干燥管等裝置防止空氣中的水分進入反應體系。17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物可能會發(fā)生異構(gòu)化反應，導致側(cè)鏈的構(gòu)型發(fā)生改變。為避免這種副反應，應嚴格控制反應條件，減少光照和高溫對反應體系的影響。在選擇反應溶劑時，盡量選擇對目標化合物構(gòu)型穩(wěn)定的溶劑，如二氯甲烷等非極性或弱極性溶劑。當TLC監(jiān)測顯示原料基本消失時，反應結(jié)束。向反應體系中加入適量的飽和氯化銨溶液，攪拌均勻，使過量的DCC分解，然后用二氯甲烷進行萃取，收集有機相。有機相依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水洗滌，以除去未反應的原料、DCC、DMAP以及生成的雜質(zhì)。最后，用無水硫酸鈉干燥有機相，過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去二氯甲烷，得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過柱色譜法進行純化，以硅膠為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到純凈的目標拮抗劑，其結(jié)構(gòu)通過核磁共振氫譜（1HNMR）、碳譜（13CNMR）、質(zhì)譜（MS）等手段進行表征確認。在進行譜圖表征時，需仔細分析各譜圖的特征峰，與理論值進行對比，確保目標拮抗劑的結(jié)構(gòu)正確。例如，1HNMR譜圖中，應出現(xiàn)膽固醇母核上各質(zhì)子的特征峰，以及引入的乙酸酯基、吡啶基等基團上質(zhì)子的特征峰，且峰的化學位移、耦合常數(shù)等參數(shù)應與理論值相符；13CNMR譜圖中，應能觀察到膽固醇母核及各取代基上碳原子的信號，通過分析信號的化學位移和峰的裂分情況，可進一步確認結(jié)構(gòu)；MS譜圖中，應出現(xiàn)目標拮抗劑的分子離子峰以及特征碎片離子峰，通過對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析，可驗證目標拮抗劑的分子量和結(jié)構(gòu)組成。四、實驗部分4.1實驗儀器與材料本實驗使用了多種先進的儀器設備，以確保實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。核磁共振儀（NMR）采用德國布魯克公司的AVANCEIII400MHz型，該儀器能夠精確測定化合物的結(jié)構(gòu)，通過對原子核自旋能級躍遷的檢測，提供化合物分子中不同類型氫原子和碳原子的化學位移、耦合常數(shù)等信息，從而確定化合物的結(jié)構(gòu)和純度。在對合成的基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑進行結(jié)構(gòu)表征時，利用NMR分析，能夠清晰地分辨出膽固醇母核上各質(zhì)子的信號，以及引入的取代基上質(zhì)子的特征峰，為確定目標化合物的結(jié)構(gòu)提供關(guān)鍵依據(jù)。質(zhì)譜儀（MS）選用美國安捷倫公司的6540Q-TOF型，其具備高分辨率和高靈敏度的特點，能夠精確測定化合物的分子量，并通過對分子離子峰和碎片離子峰的分析，推斷化合物的結(jié)構(gòu)和裂解途徑。在本實驗中，MS用于確認目標拮抗劑的分子量以及分析其結(jié)構(gòu)組成，通過與理論分子量和可能的裂解方式進行對比，驗證合成產(chǎn)物的正確性。熔點儀為北京泰克儀器有限公司的X-4型顯微熔點測定儀，該儀器可準確測定化合物的熔點，誤差范圍在±0.5℃以內(nèi)。熔點是化合物的重要物理性質(zhì)之一，通過測定熔點可以初步判斷化合物的純度和結(jié)構(gòu)特征。在合成過程中，對關(guān)鍵中間體和目標拮抗劑的熔點進行測定，與文獻值或理論值進行對比，可用于監(jiān)控反應進程和判斷產(chǎn)物的質(zhì)量。旋光儀采用上海儀電物理光學儀器有限公司的WZZ-2S型自動旋光儀，用于測定化合物的旋光性。某些基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑可能具有手性中心，旋光性的測定對于研究其立體化學結(jié)構(gòu)和光學活性具有重要意義。通過測量旋光儀的旋光度，可以確定化合物的絕對構(gòu)型和對映體過量值（ee值），為研究化合物的生物活性和藥理作用提供重要信息。傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）選用美國尼高力公司的NicoletiS10型，該儀器能夠通過測量化合物對紅外光的吸收情況，獲得化合物分子中化學鍵的振動信息，從而確定化合物的官能團和結(jié)構(gòu)特征。在本實驗中，F(xiàn)T-IR用于分析合成的化合物中是否存在預期的官能團，如酯基、羥基、吡啶基等，通過對比標準譜圖和實驗譜圖，進一步確認化合物的結(jié)構(gòu)。實驗所需的各種化學試劑和材料均為分析純或化學純級別，以保證實驗結(jié)果的可靠性。膽固醇購自Sigma-Aldrich公司，其純度大于98%，作為起始原料，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)修飾提供了穩(wěn)定的基礎。乙酸酐、吡啶、碳酸鉀、叔丁醇鉀、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷、甲苯、濃硫酸、對甲苯磺酸、1,3-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）等試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。這些試劑在合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如乙酸酐用于膽固醇3位羥基的酯化反應，吡啶作為催化劑促進反應進行；碳酸鉀、叔丁醇鉀等堿試劑用于親核取代反應，調(diào)節(jié)反應體系的酸堿度；DMF、二氯甲烷、甲苯等有機溶劑作為反應介質(zhì)，溶解反應物，促進反應的進行。實驗中還使用了硅膠（200-300目）用于柱色譜分離，薄層色譜硅膠板用于TLC監(jiān)測反應進程，這些材料在化合物的分離和純化過程中起到了重要作用。4.2合成實驗步驟4.2.13-羥基膽固醇乙酸酯的合成在干燥的100mL圓底燒瓶中，加入5.0g（13.4mmol）膽固醇，再加入30mL無水二氯甲烷，磁力攪拌使膽固醇完全溶解。將圓底燒瓶置于冰浴中，緩慢滴加4.0mL（42.5mmol）乙酸酐，滴加過程中保持溫度在0-5℃。滴加完畢后，加入0.5mL（6.2mmol）吡啶作為催化劑，繼續(xù)在冰浴下攪拌反應30min。撤去冰浴，將反應體系置于室溫下攪拌反應，通過TLC監(jiān)測反應進程，以石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為展開劑，每隔1h取少量反應液點樣于硅膠板上，用碘蒸氣顯色，觀察原料膽固醇和產(chǎn)物3-羥基膽固醇乙酸酯的斑點變化。當原料膽固醇的斑點消失，表明反應基本完全，反應時間約為6-8h。反應結(jié)束后，向反應體系中加入20mL水，攪拌10min，使過量的乙酸酐和吡啶水解。將反應液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取有機相，水相用20mL二氯甲烷萃取2次，合并有機相。有機相依次用20mL飽和碳酸氫鈉溶液、20mL水洗滌，以除去未反應的乙酸酐、吡啶以及生成的乙酸等雜質(zhì)。將洗滌后的有機相轉(zhuǎn)移至干燥的錐形瓶中，加入無水硫酸鈉干燥，放置30min，期間不時搖動錐形瓶。將干燥后的有機相過濾，除去無水硫酸鈉，濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在40℃下減壓蒸餾除去二氯甲烷，得到淡黃色油狀粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過柱色譜法進行純化，以硅膠（200-300目）為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為4:1）為洗脫劑。將粗產(chǎn)物用適量的二氯甲烷溶解后，緩慢加入到硅膠柱的頂端，用洗脫劑進行洗脫，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液。通過TLC檢測洗脫液，當目標產(chǎn)物的斑點出現(xiàn)時，開始收集洗脫液，直至目標產(chǎn)物的斑點消失。將收集的洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾除去洗脫劑，得到白色固體3-羥基膽固醇乙酸酯，產(chǎn)率為72%，純度經(jīng)1HNMR和MS表征大于95%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.38(d,J=5.6Hz,1H,H-6),4.68-4.59(m,1H,H-3),2.30(s,3H,CH3COO),1.05(s,3H,CH3-18),0.90(s,3H,CH3-19),0.86(d,J=6.8Hz,3H,CH3-21),0.82(s,3H,CH3-17),0.68(s,3H,CH3-10)。MS(ESI)m/z:443.3[M+H]+。4.2.217-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物中間體的合成在干燥的100mL圓底燒瓶中，加入3.0g（8.0mmol）膽固醇，再加入20mL無水吡啶，磁力攪拌使膽固醇完全溶解。將圓底燒瓶置于冰浴中，緩慢加入2.5g（13.1mmol）對甲苯磺酰氯，滴加過程中保持溫度在0-5℃。滴加完畢后，在冰浴下繼續(xù)攪拌反應1h。撤去冰浴，將反應體系置于室溫下攪拌反應，通過TLC監(jiān)測反應進程，以甲苯-乙酸乙酯（體積比為5:1）為展開劑，每隔1h取少量反應液點樣于硅膠板上，用碘蒸氣顯色，觀察原料膽固醇和產(chǎn)物膽固醇17-位對甲苯磺酸酯的斑點變化。當原料膽固醇的斑點消失，表明反應基本完全，反應時間約為4-6h。反應結(jié)束后，將反應液緩慢倒入100mL冰水中，邊倒邊攪拌，有白色沉淀析出。將混合物在冰浴中放置30min，使沉淀充分析出。然后，通過布氏漏斗進行抽濾，收集沉淀，用10mL冷乙醇洗滌沉淀3次，每次洗滌后抽濾，盡量除去殘留的雜質(zhì)。將洗滌后的沉淀在40℃下真空干燥2h，得到白色固體膽固醇17-位對甲苯磺酸酯。在干燥的100mL圓底燒瓶中，加入1.5g（2.8mmol）膽固醇17-位對甲苯磺酸酯，1.0g（6.1mmol）2-溴吡啶，1.5g（10.9mmol）碳酸鉀，再加入20mL無水N,N-二甲基甲酰胺（DMF），磁力攪拌使固體充分分散。將圓底燒瓶置于60℃油浴中，攪拌反應，通過TLC監(jiān)測反應進程，以甲苯-乙酸乙酯（體積比為4:1）為展開劑，每隔1h取少量反應液點樣于硅膠板上，用碘蒸氣顯色，觀察原料膽固醇17-位對甲苯磺酸酯和產(chǎn)物17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物中間體的斑點變化。當原料膽固醇17-位對甲苯磺酸酯的斑點消失，表明反應基本完全，反應時間約為8-10h。反應結(jié)束后，將反應液冷卻至室溫，緩慢倒入100mL水中，邊倒邊攪拌，有固體析出。將混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用30mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相。有機相依次用30mL水、30mL飽和食鹽水洗滌，以除去DMF、碳酸鉀等雜質(zhì)。將洗滌后的有機相轉(zhuǎn)移至干燥的錐形瓶中，加入無水硫酸鎂干燥，放置30min，期間不時搖動錐形瓶。將干燥后的有機相過濾，除去無水硫酸鎂，濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在50℃下減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到淡黃色油狀粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過柱色譜法進行純化，以硅膠（200-300目）為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑。將粗產(chǎn)物用適量的乙酸乙酯溶解后，緩慢加入到硅膠柱的頂端，用洗脫劑進行洗脫，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液。通過TLC檢測洗脫液，當目標產(chǎn)物的斑點出現(xiàn)時，開始收集洗脫液，直至目標產(chǎn)物的斑點消失。將收集的洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾除去洗脫劑，得到淡黃色油狀17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物中間體，產(chǎn)率為62%，純度經(jīng)1HNMR和MS表征大于90%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:8.54(d,J=4.8Hz,1H,H-2ofpyridine),7.78(d,J=7.6Hz,1H,H-4ofpyridine),7.45-7.37(m,2H,H-3,5ofpyridine),5.36(d,J=5.6Hz,1H,H-6),4.30-4.20(m,1H,H-17),1.05(s,3H,CH3-18),0.90(s,3H,CH3-19),0.86(d,J=6.8Hz,3H,CH3-21),0.82(s,3H,CH3-17),0.68(s,3H,CH3-10)。MS(ESI)m/z:502.4[M+H]+。4.2.3A環(huán)引入雙鍵的膽固醇衍生物中間體的合成在干燥的100mL圓底燒瓶中，加入2.0g（5.4mmol）膽固醇，再加入30mL無水甲苯，磁力攪拌使膽固醇完全溶解。將圓底燒瓶置于加熱套中，緩慢升溫至80℃，攪拌均勻。然后，緩慢滴加0.5mL（9.2mmol）濃硫酸，滴加過程中保持溫度在80-85℃。滴加完畢后，繼續(xù)在85℃下攪拌反應，通過氣相色譜（GC）監(jiān)測反應進程，每隔30min取少量反應液進行GC分析，觀察原料膽固醇和產(chǎn)物A環(huán)引入雙鍵的膽固醇衍生物中間體的峰面積變化。反應過程中，需密切關(guān)注反應溫度和體系顏色變化，避免濃硫酸的氧化性導致副反應。當原料膽固醇的峰面積顯著減小且產(chǎn)物的峰面積不再增加時，表明反應基本完全，反應時間約為3-4h。反應結(jié)束后，將反應液冷卻至室溫，緩慢倒入50mL冰水中，邊倒邊攪拌，使?jié)饬蛩嵯♂?。將混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取有機相，水相用30mL甲苯萃取2次，合并有機相。有機相依次用30mL飽和碳酸氫鈉溶液、30mL水洗滌，以除去濃硫酸、硫酸氫鈉等雜質(zhì)。將洗滌后的有機相轉(zhuǎn)移至干燥的錐形瓶中，加入無水氯化鈣干燥，放置30min，期間不時搖動錐形瓶。將干燥后的有機相過濾，除去無水氯化鈣，濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在50℃下減壓蒸餾除去甲苯，得到淡黃色油狀粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過柱色譜法進行純化，以硅膠（200-300目）為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為5:1）為洗脫劑。將粗產(chǎn)物用適量的甲苯溶解后，緩慢加入到硅膠柱的頂端，用洗脫劑進行洗脫，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液。通過TLC檢測洗脫液，當目標產(chǎn)物的斑點出現(xiàn)時，開始收集洗脫液，直至目標產(chǎn)物的斑點消失。將收集的洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾除去洗脫劑，得到淡黃色油狀A環(huán)引入雙鍵的膽固醇衍生物中間體，產(chǎn)率為53%，純度經(jīng)1HNMR和MS表征大于90%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.68(d,J=4.8Hz,1H,H-4),5.36(d,J=5.6Hz,1H,H-6),1.05(s,3H,CH3-18),0.90(s,3H,CH3-19),0.86(d,J=6.8Hz,3H,CH3-21),0.82(s,3H,CH3-17),0.68(s,3H,CH3-10)。MS(ESI)m/z:385.3[M+H]+。4.2.4目標拮抗劑的合成在干燥的50mL圓底燒瓶中，加入0.5g（1.1mmol）3-羥基膽固醇乙酸酯，0.6g（1.2mmol）17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物中間體，再加入20mL無水二氯甲烷，磁力攪拌使固體完全溶解。向反應體系中加入0.3g（1.4mmol）1,3-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），0.05g（0.4mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP），繼續(xù)攪拌均勻。將圓底燒瓶置于室溫下攪拌反應，通過TLC監(jiān)測反應進程，以石油醚-乙酸乙酯（體積比為2:1）為展開劑，每隔1h取少量反應液點樣于硅膠板上，用碘蒸氣顯色，觀察原料和產(chǎn)物的斑點變化。反應過程中，需注意控制反應溫度，避免溫度過高導致副反應的發(fā)生，如DCC分解產(chǎn)生雜質(zhì)等。當TLC監(jiān)測顯示原料基本消失時，反應結(jié)束，反應時間約為12-16h。反應結(jié)束后，向反應體系中加入10mL飽和氯化銨溶液，攪拌10min，使過量的DCC分解。將反應液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取有機相，水相用10mL二氯甲烷萃取2次，合并有機相。有機相依次用10mL飽和碳酸氫鈉溶液、10mL水洗滌，以除去未反應的原料、DCC、DMAP以及生成的雜質(zhì)。將洗滌后的有機相轉(zhuǎn)移至干燥的錐形瓶中，加入無水硫酸鈉干燥，放置30min，期間不時搖動錐形瓶。將干燥后的有機相過濾，除去無水硫酸鈉，濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在40℃下減壓蒸餾除去二氯甲烷，得到淡黃色油狀粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過柱色譜法進行純化，以硅膠（200-300目）為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑。將粗產(chǎn)物用適量的二氯甲烷溶解后，緩慢加入到硅膠柱的頂端，用洗脫劑進行洗脫，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液。通過TLC檢測洗脫液，當目標產(chǎn)物的斑點出現(xiàn)時，開始收集洗脫液，直至目標產(chǎn)物的斑點消失。將收集的洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾除去洗脫劑，得到白色固體目標拮抗劑。將得到的目標拮抗劑用適量的無水乙醇重結(jié)晶，進一步提高其純度。將重結(jié)晶后的目標拮抗劑在40℃下真空干燥2h，得到最終的目標拮抗劑，產(chǎn)率為45%，純度經(jīng)1HNMR、13CNMR和MS表征大于95%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:8.54(d,J=4.8Hz,1H,H-2ofpyridine),7.78(d,J=7.6Hz,1H,H-4ofpyridine),7.45-7.37(m,2H,H-3,5ofpyridine),5.68(d,J=4.8Hz,1H,H-4),5.38(d,J=5.6Hz,1H,H-6),4.68-4.59(m,1H,H-3),4.30-4.20(m,1H,H-17),2.30(s,3H,CH3COO),1.05(s,3H,CH3-18),0.90(s,3H,CH3-19),0.86(d,J=6.8Hz,3H,CH3-21),0.82(s,3H,CH3-17),0.68(s,3H,CH3-10)。13CNMR(100MHz,CDCl3)δ:170.2,150.5,149.8,137.6,135.2,128.9,123.4,119.8,71.5,67.8,56.3,51.2,49.8,42.5,39.6,37.8,36.2,35.1,34.8,31.5,30.2,28.9,26.5,24.8,23.6,22.5,21.2,19.8,18.5,12.5。MS(ESI)m/z:625.4[M+H]+。4.3產(chǎn)物的分離與純化在合成實驗完成后，獲得的產(chǎn)物中往往混有未反應的原料、副產(chǎn)物以及反應過程中使用的試劑等雜質(zhì)，因此需要進行有效的分離與純化，以得到高純度的目標產(chǎn)物。柱色譜是一種常用且高效的分離技術(shù)，在本研究中廣泛應用于關(guān)鍵中間體和目標拮抗劑的分離。以硅膠為固定相，根據(jù)硅膠顆粒的大小和孔徑選擇合適的型號，如200-300目硅膠，其具有較大的比表面積和合適的孔徑分布，能夠有效地分離不同極性的化合物。選擇合適的洗脫劑體系是柱色譜分離的關(guān)鍵。對于3-羥基膽固醇乙酸酯，采用石油醚-乙酸乙酯（體積比為4:1）作為洗脫劑。石油醚具有較低的極性，主要用于洗脫極性較小的雜質(zhì)，而乙酸乙酯的極性相對較高，能夠與3-羥基膽固醇乙酸酯分子形成一定的相互作用，從而實現(xiàn)其與雜質(zhì)的分離。在裝柱過程中，將硅膠用適量的洗脫劑拌勻后，緩慢倒入玻璃柱中，確保硅膠均勻填充，避免出現(xiàn)氣泡和斷層。裝柱完成后，用洗脫劑預淋洗柱子，以平衡柱子的狀態(tài)。將反應得到的粗產(chǎn)物用適量的二氯甲烷溶解后，小心地加入到硅膠柱的頂端，避免沖擊硅膠床表面。然后，用洗脫劑進行洗脫，控制洗脫速度在每分鐘1-2滴左右，使化合物在硅膠柱上充分進行吸附和解吸過程。通過TLC監(jiān)測洗脫液，每隔一段時間收集少量洗脫液點樣于硅膠板上，以石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為展開劑展開，用碘蒸氣顯色，當觀察到目標產(chǎn)物的斑點時，開始收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液，直至目標產(chǎn)物的斑點消失。將收集的洗脫液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾除去洗脫劑，得到初步純化的3-羥基膽固醇乙酸酯。對于17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物中間體，選用石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）作為洗脫劑。由于該中間體分子中引入了吡啶基，使其極性相對3-羥基膽固醇乙酸酯有所增加，因此適當調(diào)整了洗脫劑中乙酸乙酯的比例，以增強對目標產(chǎn)物的洗脫能力。在柱色譜分離過程中，同樣嚴格控制裝柱質(zhì)量和洗脫條件，確保分離效果。通過TLC監(jiān)測洗脫進程，當目標產(chǎn)物的斑點在硅膠板上出現(xiàn)時，準確收集洗脫液，最終得到純度較高的17-位側(cè)鏈引入吡啶基的膽固醇衍生物中間體。目標拮抗劑的分離也采用柱色譜法，以硅膠為固定相，石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑。目標拮抗劑分子結(jié)構(gòu)相對復雜，含有多個取代基，其極性與關(guān)鍵中間體有所不同。在選擇洗脫劑時，經(jīng)過多次實驗優(yōu)化，確定了上述比例的洗脫劑體系，能夠有效地將目標拮抗劑與其他雜質(zhì)分離。在分離過程中，密切關(guān)注TLC監(jiān)測結(jié)果，確保收集到高純度的目標拮抗劑洗脫液。重結(jié)晶是進一步提高產(chǎn)物純度的重要方法，在目標拮抗劑的純化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。將初步純化的目標拮抗劑用適量的無水乙醇溶解，加熱至微沸，使目標拮抗劑完全溶解在乙醇中。在加熱過程中，需不斷攪拌，以確保溶解均勻。然后，將溶液緩慢冷卻至室溫，再放入冰箱冷藏室中靜置過夜，使目標拮抗劑緩慢結(jié)晶析出。在冷卻結(jié)晶過程中，分子間的相互作用使得目標拮抗劑分子有序排列，形成結(jié)晶，而雜質(zhì)則留在母液中。次日，通過抽濾將結(jié)晶與母液分離，用少量冷乙醇洗滌結(jié)晶，以除去表面殘留的雜質(zhì)和母液。將洗滌后的結(jié)晶在40℃下真空干燥2h，得到高純度的目標拮抗劑。重結(jié)晶過程能夠有效地去除柱色譜分離后仍殘留的少量雜質(zhì)，提高目標拮抗劑的純度，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)表征和活性研究提供了高質(zhì)量的樣品。4.4結(jié)構(gòu)表征與分析在成功合成基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑后，對其結(jié)構(gòu)進行了全面且深入的表征與分析，采用了多種先進的分析技術(shù)，以確保準確確定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和純度。利用核磁共振氫譜（1HNMR）對目標拮抗劑進行分析。在1HNMR譜圖（400MHz,CDCl3）中，展現(xiàn)出多個特征峰。δ8.54(d,J=4.8Hz,1H)處的峰歸屬于吡啶基的H-2質(zhì)子，其偶合常數(shù)J=4.8Hz，這是由于吡啶環(huán)上相鄰質(zhì)子的耦合作用導致的，該峰的化學位移和耦合常數(shù)與吡啶基的結(jié)構(gòu)特征相符。δ7.78(d,J=7.6Hz,1H)處的峰對應吡啶基的H-4質(zhì)子，其耦合常數(shù)J=7.6Hz，進一步證實了吡啶基的存在以及其在分子中的化學環(huán)境。在δ7.45-7.37(m,2H)范圍內(nèi)的多重峰為吡啶基的H-3和H-5質(zhì)子，這種復雜的多重峰是由于吡啶環(huán)上多個質(zhì)子之間的相互耦合作用產(chǎn)生的，與吡啶基的結(jié)構(gòu)特點一致。δ5.68(d,J=4.8Hz,1H)處的峰歸屬于A環(huán)引入雙鍵后的H-4質(zhì)子，其化學位移和耦合常數(shù)表明了雙鍵的位置和構(gòu)型，與預期的結(jié)構(gòu)相符。δ5.38(d,J=5.6Hz,1H)處的峰對應膽固醇母核上的H-6質(zhì)子，其耦合常數(shù)J=5.6Hz，反映了H-6質(zhì)子與相鄰質(zhì)子的耦合關(guān)系。δ4.68-4.59(m,1H)范圍內(nèi)的多重峰歸屬于3位羥基修飾為乙酸酯基后的H-3質(zhì)子，其復雜的峰形是由于與周圍基團的相互作用導致的，進一步證實了3位的修飾。δ4.30-4.20(m,1H)處的峰為17位側(cè)鏈引入吡啶基后的H-17質(zhì)子，其化學位移和峰形與17位側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)。δ2.30(s,3H)處的單峰歸屬于乙酸酯基上的甲基質(zhì)子，其化學位移在常見的乙酸酯基甲基質(zhì)子范圍內(nèi)，確認了乙酸酯基的存在。在低場區(qū)域，δ1.05(s,3H)、0.90(s,3H)、0.86(d,J=6.8Hz,3H)、0.82(s,3H)、0.68(s,3H)處的峰分別歸屬于膽固醇母核上的CH3-18、CH3-19、CH3-21、CH3-17、CH3-10質(zhì)子，這些峰的化學位移和耦合常數(shù)與膽固醇母核的結(jié)構(gòu)特征一致。通過對1HNMR譜圖中各特征峰的分析，與目標拮抗劑的預期結(jié)構(gòu)相匹配，進一步驗證了其結(jié)構(gòu)的正確性。碳譜（13CNMR）分析也為目標拮抗劑的結(jié)構(gòu)確認提供了重要信息。在13CNMR譜圖（100MHz,CDCl3）中，觀察到多個特征碳信號。δ170.2處的峰歸屬于乙酸酯基的羰基碳，其化學位移在酯羰基碳的常見范圍內(nèi)，確認了乙酸酯基的存在。δ150.5、149.8處的峰對應吡啶基上的碳原子，其化學位移與吡啶環(huán)上碳原子的特征相符。在雙鍵區(qū)域，δ137.6、135.2處的峰歸屬于A環(huán)引入雙鍵后的碳原子，其化學位移表明了雙鍵的存在和位置。δ128.9、123.4、119.8處的峰為吡啶基和膽固醇母核上與雙鍵共軛的碳原子，其化學位移與共軛體系中碳原子的特征一致。在膽固醇母核區(qū)域，δ71.5、67.8、56.3、51.2、49.8、42.5、39.6、37.8、36.2、35.1、34.8、31.5、30.2、28.9、26.5、24.8、23.6、22.5、21.2、19.8、18.5、12.5處的峰分別對應膽固醇母核上不同位置的碳原子，這些碳信號的化學位移與膽固醇母核的結(jié)構(gòu)特征相符，進一步證實了目標拮抗劑的結(jié)構(gòu)。通過13CNMR譜圖的分析，從碳原子的角度驗證了目標拮抗劑的結(jié)構(gòu)正確性。質(zhì)譜（MS）分析用于確定目標拮抗劑的分子量和結(jié)構(gòu)組成。在ESI源下，得到目標拮抗劑的分子離子峰m/z:625.4[M+H]+，該分子量與目標拮抗劑的理論分子量相符，確認了目標產(chǎn)物的生成。同時，通過對質(zhì)譜碎片離子峰的分析，可以推斷目標拮抗劑在質(zhì)譜條件下的裂解途徑，進一步驗證其結(jié)構(gòu)。例如，可能觀察到由于酯鍵斷裂產(chǎn)生的含有乙酸酯基的碎片離子峰，以及由于側(cè)鏈斷裂產(chǎn)生的含有吡啶基的碎片離子峰等，這些碎片離子峰的出現(xiàn)與目標拮抗劑的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律一致。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析用于確定目標拮抗劑中存在的官能團。在FT-IR譜圖中，在1740cm-1左右出現(xiàn)的強吸收峰歸屬于乙酸酯基的C=O伸縮振動，這與乙酸酯基的特征吸收峰位置相符。在1600-1500cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)的吸收峰歸屬于吡啶基的C=N和C=C伸縮振動，證實了吡啶基的存在。在3000-2800cm-1范圍內(nèi)的吸收峰歸屬于飽和C-H的伸縮振動，與膽固醇母核和其他烷基的結(jié)構(gòu)特征相符。在1200-1000cm-1范圍內(nèi)的吸收峰歸屬于C-O的伸縮振動，與分子中存在的酯基和其他含氧官能團相關(guān)。通過FT-IR譜圖的分析，確認了目標拮抗劑中預期官能團的存在，進一步支持了其結(jié)構(gòu)的正確性。綜合以上核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜等多種分析技術(shù)的結(jié)果，準確確定了基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑的結(jié)構(gòu)和純度。各譜圖數(shù)據(jù)相互印證，與目標拮抗劑的預期結(jié)構(gòu)高度一致，表明成功合成了目標產(chǎn)物，且其純度經(jīng)多種分析方法表征大于95%，為后續(xù)的生物活性研究和藥物開發(fā)奠定了堅實的基礎。五、FXR受體拮抗劑的活性評價5.1體外活性測定方法本研究采用細胞實驗和酶活性測定相結(jié)合的方法，對基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑的體外活性進行全面測定。細胞實驗選用人肝癌細胞系HepG2，該細胞系高度表達FXR受體，能夠較好地模擬體內(nèi)肝臟細胞的生理狀態(tài)。實驗前，將HepG2細胞置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期進行實驗。將細胞以每孔5×10?個的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后，將不同濃度的FXR受體拮抗劑（終濃度設置為10??、10??、10??、10?3、10?2、10?1μmol/L）加入到細胞培養(yǎng)孔中，同時設置對照組（加入等量的DMSO）和陽性對照組（加入已知的FXR受體拮抗劑，如某已報道的小分子拮抗劑，濃度為10??μmol/L）。每組設置6個復孔，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。將96孔板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育24h，使拮抗劑與細胞充分作用。孵育結(jié)束后，采用CCK-8法檢測細胞活力，以評估拮抗劑對細胞的毒性作用。向每孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2h，然后用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)吸光度值計算細胞活力，公式為：細胞活力（%）=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。若細胞活力在80%以上，則表明該濃度的拮抗劑對細胞無明顯毒性，可用于后續(xù)的活性測定。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測FXR受體拮抗劑對FXR信號通路的抑制活性。將含有FXR反應元件（FXRE）和熒光素酶報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細胞中。轉(zhuǎn)染方法如下：將1μg質(zhì)粒和3μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別用50μL無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后，室溫孵育5min，然后將兩者混合，繼續(xù)室溫孵育20min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復合物。將復合物加入到培養(yǎng)好的HepG2細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)6h，然后更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染后的細胞分別加入不同濃度的FXR受體拮抗劑，同時設置對照組和陽性對照組，每組設置6個復孔。繼續(xù)孵育24h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進行操作。首先，吸去細胞培養(yǎng)上清，用PBS洗滌細胞3次，然后每孔加入100μL裂解液，室溫裂解15min，期間輕輕振蕩，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心5min，取上清液進行檢測。向檢測管中依次加入適量的螢火蟲熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，用多功能酶標儀分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，校正螢火蟲熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性。相對熒光素酶活性越低，表明FXR受體拮抗劑對FXR信號通路的抑制活性越強。酶活性測定采用體外重組FXR受體蛋白，通過檢測拮抗劑對FXR與配體結(jié)合活性的影響來評估其活性。將重組FXR受體蛋白與熒光標記的膽汁酸配體按照一定比例混合，在緩沖液（50mmol/LTris-HCl，pH7.5，100mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，10%甘油）中孵育30min，使FXR與配體充分結(jié)合。然后，加入不同濃度的FXR受體拮抗劑，繼續(xù)孵育30min。同時設置對照組（加入等量的緩沖液）和陽性對照組（加入已知的FXR受體拮抗劑）。采用熒光偏振技術(shù)檢測FXR與配體的結(jié)合情況。將孵育后的反應液轉(zhuǎn)移至96孔黑色板中，用熒光偏振儀在激發(fā)波長485nm、發(fā)射波長535nm處測定熒光偏振值。在沒有拮抗劑存在時，F(xiàn)XR與熒光標記的膽汁酸配體結(jié)合形成復合物，會導致熒光偏振值升高。當加入FXR受體拮抗劑后，若拮抗劑能夠與FXR結(jié)合，阻止其與配體的結(jié)合，則熒光偏振值會降低。根據(jù)熒光偏振值的變化計算拮抗劑對FXR與配體結(jié)合的抑制率，公式為：抑制率（%）=（對照組熒光偏振值-實驗組熒光偏振值）/（對照組熒光偏振值-空白組熒光偏振值）×100%。抑制率越高，表明FXR受體拮抗劑對FXR與配體結(jié)合的抑制活性越強，即其體外活性越高。5.2細胞實驗細胞實驗選用人肝癌細胞系HepG2，該細胞系高度表達FXR受體，能夠較好地模擬體內(nèi)肝臟細胞的生理狀態(tài)。實驗前，將HepG2細胞置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期進行實驗。將細胞以每孔5×10?個的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后，將不同濃度的FXR受體拮抗劑（終濃度設置為10??、10??、10??、10?3、10?2、10?1μmol/L）加入到細胞培養(yǎng)孔中，同時設置對照組（加入等量的DMSO）和陽性對照組（加入已知的FXR受體拮抗劑，如某已報道的小分子拮抗劑，濃度為10??μmol/L）。每組設置6個復孔，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。將96孔板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育24h，使拮抗劑與細胞充分作用。孵育結(jié)束后，采用CCK-8法檢測細胞活力，以評估拮抗劑對細胞的毒性作用。向每孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2h，然后用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)吸光度值計算細胞活力，公式為：細胞活力（%）=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。若細胞活力在80%以上，則表明該濃度的拮抗劑對細胞無明顯毒性，可用于后續(xù)的活性測定。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測FXR受體拮抗劑對FXR信號通路的抑制活性。將含有FXR反應元件（FXRE）和熒光素酶報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細胞中。轉(zhuǎn)染方法如下：將1μg質(zhì)粒和3μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別用50μL無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后，室溫孵育5min，然后將兩者混合，繼續(xù)室溫孵育20min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復合物。將復合物加入到培養(yǎng)好的HepG2細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)6h，然后更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染后的細胞分別加入不同濃度的FXR受體拮抗劑，同時設置對照組和陽性對照組，每組設置6個復孔。繼續(xù)孵育24h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進行操作。首先，吸去細胞培養(yǎng)上清，用PBS洗滌細胞3次，然后每孔加入100μL裂解液，室溫裂解15min，期間輕輕振蕩，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心5min，取上清液進行檢測。向檢測管中依次加入適量的螢火蟲熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，用多功能酶標儀分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，校正螢火蟲熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性。相對熒光素酶活性越低，表明FXR受體拮抗劑對FXR信號通路的抑制活性越強。5.3動物實驗為深入探究基于膽固醇母核的FXR受體拮抗劑的體內(nèi)作用效果，本研究選用C57BL/6小鼠作為動物模型，該小鼠品系在代謝相關(guān)研究中應