THXCY-雜交苜蓿種子真實性鑒定SSR分子標記法

ICS65.120B40團體標準T/HXCYXXX-2025雜交苜蓿種子真實性鑒定SSR分子標記法AuthenticityIdentificationofHybridAlfalfaSeedsbySSR（征求意見稿）202X-XX-XX發(fā)布202X-XX-XX實施北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟發(fā)布

T/HXCYxxx—2025雜交苜蓿種子真實性鑒定SSR分子標記法1范圍本文件規(guī)定了SSR分子標記法鑒定雜交苜蓿種子真實性的術(shù)語和定義、儀器設(shè)備、實驗步驟、結(jié)果分析等內(nèi)容。本文件適用于雜交苜蓿種子真實性鑒定、品種的審定、新品種知識產(chǎn)權(quán)保護及種子市場監(jiān)管。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T2930.4《草種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗》DB62/T4094《草品種真實性檢驗規(guī)程SSR標記法》3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1簡單重復序列simplesequencerepeat(SSR)是由1-6個核苷酸為基本單位，通過連續(xù)串聯(lián)重復形成的DNA片段，長達通常在幾十個至幾百個bp之間，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復序列，重復單元的數(shù)量在不同個體或物種中高度可變，形成多態(tài)性標記，是遺傳分析的重要工具。3.2瓊脂糖凝膠電泳agarosegelelectrophoresis是一種基于分子大小分離DNA片段的常用分子生物學技術(shù)。瓊脂糖凝膠電泳利用瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)，在電場作用下，使帶負電的核酸分子（DNA）從負極向正極遷移，通過凝膠孔徑的分子篩效應(yīng)，實現(xiàn)不同大小核酸片段的分離。分離后的核酸可通過染色進行可視化分析。3.3聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction(PCR)是一種在體外快速擴增特定DNA片段的分子生物學技術(shù)，通過模擬DNA天然復制過程，實現(xiàn)目標序列的指數(shù)級擴增。DNA雙鏈變性：高溫（約95℃）使雙鏈DNA解鏈為單鏈模板；引物退火：降溫（通常是55℃～65℃）使特異性引物與單鏈DNA的互補區(qū)域結(jié)合；鏈延伸：中溫（約72℃）下，DNA聚合酶以單鏈為模板，按照堿基互補配對原則，以5'→3'方向合成新鏈；重復循環(huán)上述步驟，實現(xiàn)DNA指數(shù)增長。3.4引物primer是人工合成的短核苷酸序列（通常在18bp～30bp），能夠通過堿基互補配對與模板DNA特異性結(jié)合，引導DNA聚合酶從3'端開始合成新鏈。3.5聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)是一種基于分子大小、電荷或構(gòu)象分離DNA的高分辨率電泳技術(shù)。以聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)，通過交聯(lián)聚合反應(yīng)，利用電場驅(qū)動帶電分子遷移。4縮略詞下列縮略語適用于本文件。bp:basepair，堿基對DNA：deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核苷酸DNAmarker:用于比較DNA片段大小的標準工具TBE：電泳緩沖液Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐熱DNA聚合酶dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸ddH2O：雙蒸水（超純水）LoadingBuffer：上樣緩沖液5原理因基因組存在著能夠世代遺傳的簡單重復序列，雜交種子具有雙親等位標記互補帶型。根據(jù)父母本的特征分子標記對應(yīng)在雜交種中的譜帶，可判斷該雜交種的真?zhèn)涡?。SSR分子標記技術(shù)因其多態(tài)性高、重復性好、操作簡便等特點，是遺傳分析的重要工具。設(shè)計特異引物，利用PCR技術(shù)進行擴增，擴增產(chǎn)物利用電泳進行分離，分析其長度多態(tài)性，達到雜交苜蓿種子真實性鑒定。6儀器設(shè)備高壓滅菌鍋、臺式冷凍高速離心機、恒溫水浴鍋（30-100℃）、超純水儀、電子天平、凝膠成像系統(tǒng)、PCR擴增儀、電泳儀、垂直電泳槽及配套制膠工具、搖床、磁力攪拌器等。7所需試劑所用試劑均為分析純。7.1DNA提取使用植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取。（液氮、研缽等）7.2瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖、核酸染料、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、冰醋酸、氫氧化鈉、6×LoadingBuffer等。7.3PCR擴增引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×Buffer緩沖液、ddH2O、Mg2+、Mix反應(yīng)混合液。7.4聚丙烯酰胺凝膠電泳溴酚藍、丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、硼酸、親和硅烷、玻璃硅烷、乙酸、DNAmarker、無水乙醇、碳酸鈉、四甲基乙二胺、過硫酸銨、去離子甲酰胺、冰醋酸、硝酸銀、甲醛、氫氧化鈉等。8引物引物信息見表1。表1引物信息表引物名稱正向序列（5‘-3’）反向序列（3‘-5’）MTB60AAGAATGACGAAGAGGCGAATCAGAAATTCCCTCCCATTGAFcact60CCTCCCTAACTTTCCAACATGGATCAACGTGTCTTTCAFct32TTTTTGTCCCACCTCATTAGTTGGTTAGATTCAAAGGGTTACMTLEC2ACGGAAAGATTCTTGAATAGATCTGGTTCGCTGTTCTCATGMTB330ATCAACGTGTTGTCACCTCCTTCCATAAGCATTGTCGCTTGB14B03GCTTGTTCTTCTTCAAGCTCACCTGACTTGTGTTTTATGCMTB45TCCTTGAGAGGTTTACAAAGCATCAATGGTACCTCATTTCAACAAMTB340GACTTTGATTGGAAGGCCAAATCCACCACAAATCACAGGAAMTB200ATTAGTGTGCGGGTCACCTCAGTTTCGTACTCCCTCCGGTMMT42CGTCGTTTACTCAAACGACACCGCGTGTTTCTGCTGATTCATMMTB76AAAAAGGGATCGGCACACTTGAGGACACAGTCTCCGTGAGCMTRmiR045ATGACTTCAACCATAACTCCAAAAAGAAAAAGAGGCTGACATMTRmiR054TAGCTAGCAATGAAAACCACTCAAGCACAGAAGAAAAGTTGAMTRmiR072ACTCCAATTGTGGCTATAAAAGGTCCATGAGCTAACAAACTA9試驗步驟9.1取樣供檢的樣品按GB/T2930.4《草種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗》標準中規(guī)定的方法進行發(fā)芽，從發(fā)芽的幼苗中取樣進行檢測。同時對父、母本幼嫩葉片進行取樣。9.2DNA提取本文件采用植物基因組DNA提取試劑盒進行苜蓿DNA的提取，提取流程按照DNA提取試劑盒流程說明書進行。9.3DNA質(zhì)量檢測將2L的DNA樣品與1L的6×LoadingBuffer充分混合均勻后點于0.8%的瓊脂糖凝膠點樣孔內(nèi)。進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀下進行拍照觀察。凝膠配制：（1）配制TBE溶液：稱取108g的Tris堿、55g硼酸、EDTA-Na29.3g于燒杯中，加800ml去離子水攪拌溶解，用NaOH調(diào)節(jié)PH值為8.0，混合均勻，定容至1L;（2）稱取0.4g瓊脂粉置于100ml錐形瓶中，加入20ml1×TBE后，放到加熱器加熱至瓊脂糖完全融化;（3）待瓊脂糖完全融化后，加入2μl核酸染料，混合均勻后，冷卻;（4）將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠沿制膠槽邊沿小心緩慢地倒入內(nèi)槽玻璃板上，待瓊脂糖凝膠溶液緩慢展開，直至整個制膠槽內(nèi)槽表面形成均勻無氣泡的膠層，室溫靜置;（5）待凝膠完全凝固后，垂直輕拔出梳子，取出膠帶，放入電泳槽中，用于上樣。9.4引物篩選利用親本DNA，在核心引物中篩選出具有較好多態(tài)性、親本間DNA片段差異較大，條帶清晰的引物，作為特定引物對供檢樣品進行檢測。9.5PCR擴增9.5.1反應(yīng)體系10L的反應(yīng)體系包含2L的DNA，正反引物各0.4L、5LMix反應(yīng)混合液和2.2L超純水。9.5.2反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃下延伸1min，循環(huán)35次，在72℃下延伸10min。注：此程序中退火溫度根據(jù)引物進行調(diào)節(jié)。9.5.3擴增產(chǎn)物PAGE電泳檢測擴增產(chǎn)物基因型用PAGE電泳檢測，本標準使用100孔垂直電泳槽進行PAGE電泳檢測的方法。9.6PAGE電泳9.6.1凝膠制備（1）先取六對十二板玻璃板，加洗潔精，用自來水洗凈每板玻璃板表面灰塵和污漬直至光滑無污漬（避免凝膠過程中產(chǎn)生氣泡），再用蒸餾水沖洗，直立晾干，用95%的酒精擦拭玻璃板后，晾干備用;（2）取適量的剝離硅烷均勻地涂抹在短玻璃板上，取同量的親和硅烷，均勻地涂抹在長玻璃板上，干燥待用；（3）將兩塊玻璃板對向放置，四邊對齊后用夾子夾牢兩個豎邊，備用；（4）量取40ml的8%聚丙烯酰胺（提前配好）于100ml燒杯中；（5）向燒杯中分別加入40μl的四甲基乙二胺和200μl的過硫酸銨，迅速混勻；（6）將混合均勻的溶液沿孔邊緣緩緩倒入，使溶液充滿兩板之間而不外漏。灌膠過程中應(yīng)緩慢避免出現(xiàn)氣泡。同時，也不宜過慢，以免在還未灌完膠時出現(xiàn)已凝固的情況；（7）灌膠完成后，插上梳子（不能左右搖晃），放置2h以上，使其完全凝固；（8）膠完全凝固之后，緩慢拔出梳子，拔梳子過程中要垂直拔出，不能左右搖晃；（9）將配好的5×TBE倒入電泳槽下槽，用夾子將制好的膠固定在電泳槽兩側(cè)，在電泳槽的上側(cè)倒入5×TBE沒過膠面。預(yù)電泳10min~20min。9.6.2電泳在膠板兩側(cè)點入2μl的2000bpDNA分子量標準，依次將2μl的PCR產(chǎn)物迅速注入點樣孔內(nèi)（避免出現(xiàn)氣泡），同時記錄好點樣順序。加樣完成后，在200V恒壓下電泳2h。9.6.3銀染顯色（1）關(guān)閉電泳槽，切斷電源，去掉夾子，回收電泳槽上槽的5×TBE于燒杯中。取下玻璃板并沖洗，緩慢取下涂有剝離硅烷的玻璃板，將涂有親和硅烷的玻璃板置于盛有固定液（提前配制）的盤中。放在80rmp的搖床上，搖晃15min；（2）取出膠板（帶有凝膠的玻璃板），將膠板放入盛有1L蒸餾水的盤內(nèi)5min；（3）硝酸銀溶液配制：稱取2g的硝酸銀，加入1000ml的蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻;（4）將漂洗好的膠板取出放入盛有硝酸銀溶液的盤中，在80rmp的搖床上，搖晃15min；（5）取出膠板，放入盛有1L蒸餾水的盤內(nèi)清洗；（6）顯示溶液配制：稱取20g氫氧化鈉，加入1000ml的蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻后，加入5ml甲醛溶液，搖勻，使其充分混合備用;（7）取出清洗過的膠板，放入顯示溶液中，放置在80rmp的搖床上，直至條帶清晰