中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)課件

中國人肥胖基因的克隆、序列分析及在大腸桿菌中的表達(dá)資料來源：中華內(nèi)分泌代謝雜志1998年第4期第14卷臨床研究作者：周煒繆為民周丙榮王立明陳志輝焦炳華單位：200433第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室；復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)肥胖基因概述及發(fā)現(xiàn)肥胖基因(Obesegene)是近幾年克隆的一個(gè)新基因,該基因產(chǎn)物———瘦蛋白

(leptin)，是由脂肪組織產(chǎn)生并分泌167個(gè)氨基酸組成的多肽,分泌蛋白分子量約16kb,是反映體內(nèi)脂肪組成及體內(nèi)脂肪含量和調(diào)節(jié)體重的重要信號(hào)因子1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理調(diào)節(jié)。1950年發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)隱性基因突變，命名為肥胖基因(Obesegene），它是一個(gè)單基因突變，導(dǎo)致重度肥胖和2型糖尿病，但其研究一直進(jìn)展甚微。動(dòng)物試驗(yàn)表明將肥胖鼠和正常鼠血液循環(huán)相連，肥胖鼠體重有所下降，提示正常鼠體內(nèi)有一種因子可控制過度肥胖，而肥胖鼠則因基因突變而使該因子表達(dá)減少或作用喪失。經(jīng)過8年努力，F(xiàn)riedman實(shí)驗(yàn)組運(yùn)用定位克隆(Positionalcloning)技術(shù)，分離得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列，為揭開肥胖癥之迷及肥胖癥的診治奠定了基礎(chǔ)。瘦素作用于下丘腦，控制代謝、能耗和生殖系統(tǒng)，調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪含量。實(shí)驗(yàn)表明，重組的瘦素具有使肥胖小鼠代謝和體重正?；?，恢復(fù)肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而無明顯的副作用〔4，5〕。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)脂肪組織：取自男性中國人胃切除手術(shù)病人的正常大網(wǎng)膜，液氮凍存?zhèn)溆眯迈r脂肪組織立即置于液氮凍存。取1克凍存的大網(wǎng)膜脂肪組織，剪成數(shù)小塊，在總量為10ml的Trizol液中高速勻漿1分鐘。將組織勻漿液吸入50ml離心管，于室溫下靜置5分鐘，加入2ml氯仿，劇烈振搖混勻后，室溫靜置3分鐘，然后11000g4℃離心15分鐘，將上層無色水相吸入一新管，加入5ml異丙醇，室溫孵育10分鐘，然后11000g4℃離心10分鐘，75%乙醇洗滌RNA沉淀，7500g4℃離心5分鐘，稍干燥后用400μl無RNase的雙蒸水溶解。（冷凍-離心-保存）RNA抽提中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)反轉(zhuǎn)錄PCR（PCR擴(kuò)增）根據(jù)已報(bào)道的序列設(shè)計(jì)引物，即將編碼成熟肽的第二個(gè)密碼子CCC轉(zhuǎn)變?yōu)榇竽c桿菌常見密碼子CCG:

P1：5’-AACGAATTCATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCAA-3’P2：5’-TTTGGATCCTCAGCACCCAGGGCTGCGGTC-3’以提取的RNA與P2引物70℃共同孵育5分鐘后置冰浴。第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系為200uAMV反轉(zhuǎn)錄酶，5μl5×緩沖液，1μlRNasin，2μgRNA，四種dNTP(各250μmol/L)。100pmol/LP2引物，總體積25μl,37℃，1小時(shí)。取5μlcDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為5uTaq酶，5μl10×緩沖液，四種dNTP(各250μmol/L)，P1和P2引物各100pmol/L，總體積50μl,94℃5分鐘后行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為94℃變性30秒，60℃復(fù)性30秒，72℃延伸1分鐘，35循環(huán)后72℃延伸10分鐘，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)肥胖基因的分子克隆及DNA順序分析

將肥胖基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳純化后行EcoRI和BamHI雙酶切，與同樣經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切的pUC19質(zhì)粒載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。以IPTG/X-Gal體系篩選白色菌落，堿法快速抽提質(zhì)粒，酶切后電泳鑒定重組質(zhì)粒。用ABI377熒光自動(dòng)測序儀進(jìn)行DNA順序分析。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)肥胖基因的分子克隆及DNA順序分析用測序載體pUC19順利地對(duì)肥胖基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行了克隆。通過ABI377熒光自動(dòng)化測序，證明其序列與報(bào)道的白種人完全一致。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)肥胖基因的原核表達(dá)

用EcoRI和SalI將肥胖基因從pUC19載體上切下，克隆入六聚組氨酸融合表達(dá)載體pPROEXHTa

質(zhì)粒(圖1)。pPROEXHTa重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）DH5α菌株并經(jīng)酶切電泳鑒定。接種重組質(zhì)粒的單菌落于3mlLB中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，按1%比例轉(zhuǎn)接至30mlLB中，37℃振搖培養(yǎng)3小時(shí)，使OD600約等于0.3～0.4，加入IPTG至終濃度為0.4mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，離心收集菌體，進(jìn)行SDS電泳。示意圖中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)將肥胖基因克隆入pPROEXHTa六聚組氨酸融合表達(dá)載體，獲得表達(dá)的蛋白分子量為17.5Kd，表達(dá)量高達(dá)20%左右。用所得的瘦蛋白可以進(jìn)一步研究瘦素作用機(jī)制及治療肥胖癥和糖尿病。最后結(jié)果中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)特別說明在有些研究肥胖基因在大腸桿菌表達(dá)中，肥胖基因可在不同大腸桿菌、不同oD600值、不同時(shí)間誘導(dǎo)等條件下表達(dá)，從而可以研究外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)量的效率。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中我們曾分別用隨機(jī)引物和P2引物來進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，結(jié)果后者的PCR得率要高得多。測序結(jié)果表明運(yùn)用RT-PCR方法從中國人脂肪組織獲得的肥胖基因序列與Friedman實(shí)驗(yàn)組報(bào)道的白種人完全一致，可見該基因在人種間可能沒有差異，屬于高度保守序列，在功能上有極其重要的作用。對(duì)肥胖基因的原核表達(dá)，起初我們將肥胖基因克隆入pBL220原核表達(dá)載體，但未獲得表達(dá)。后將其克隆入pPROEXHTa六聚組氨酸融合表達(dá)載體，結(jié)果獲得了高效表達(dá)。運(yùn)用該融合表達(dá)載體并可給產(chǎn)物純化工作帶來便利，只須用相應(yīng)的親和層析系統(tǒng)即可達(dá)到高質(zhì)量的純化。我們成功完成了中國人肥胖基因的克隆，并通過核苷酸順序分析證明中國人肥胖基因和已報(bào)道的白種人DNA順序完全一致。我們得到的基因可用作探針，用于研究肥胖基因在肥胖癥和糖尿病等病人中的表達(dá)情況。通過將肥胖基因克隆入原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)，所得的重組瘦素可用于肥胖癥和糖尿病的治療研究，也可進(jìn)一步探討肥胖基因的作用機(jī)制。結(jié)果討論中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)謝謝欣賞！導(dǎo)演：黃富新主演：中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)肥胖基因表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)1

PCR分子量標(biāo)準(zhǔn)PCRmolecularweightmarker2

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物RT-PCRproduct箭頭所指為肥胖基因條帶Arrowindicatestheobesegeneband運(yùn)用Trizol試劑得到了非常滿意的總RNA，電泳條帶顯示18s和28srRNA分別在1.7kb和4.5kb位置，比例約為1:2，可見總RNA完整性和片段大小均很好。根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，以中國人脂肪組織RNA為模板，結(jié)果非常特異地?cái)U(kuò)增出約500bp片段的肥胖基因條帶(下圖)。

中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)肥胖基因的分子克隆及酶切鑒定

1

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNAmolecularweightmarker2重組的pUC19質(zhì)粒RecombinantpUC19plasmid3重組的pUC19質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI酶切RecombinantpUC19plasmiddigestedbyEcoRIandBamHI

箭頭所指為肥胖基因條帶Arrowindicatestheobesegeneband中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)ATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGA中國人肥胖基因序列

中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(dá)肥胖基因的原核表達(dá)

1低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Lowmolecular

protein

marker

2大腸桿菌DH5α

E.coliDH5α

3載體pPROEXHta轉(zhuǎn)化的DH5