Chapter-2-蛋白質(zhì)-3-蛋白質(zhì)分離技術(shù)

Chapter2蛋白質(zhì)Chapter2蛋白質(zhì)2.1蛋白質(zhì)的概念、重要性及分類2.2氨基酸2.3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)2.4蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系2.5蛋白質(zhì)的性質(zhì)2.6蛋白質(zhì)的提取、別離和純化2.6蛋白質(zhì)的別離、純化

研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。(1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞；(2)別離和純化過程都必須0－4℃的低溫下進(jìn)行。蛋白質(zhì)的別離、純化1．蛋白質(zhì)的別離步驟(1)生物組織的機(jī)械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提；酸性蛋白用稀堿性溶液抽提；脂溶性蛋白用外表活性劑抽提等。(3)粗提:離心除去固體雜質(zhì)后，可通過鹽析、沉淀法、凝膠濾法、超過濾等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。(4)精制：可用層析法、電泳法等進(jìn)行精制。(5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并枯燥成成品。2．蛋白質(zhì)的純化方法〔1〕透析法〔dialysis)透析法2．蛋白質(zhì)的純化方法

凝膠過濾層析（2）柱層析

凝膠過濾原理

當(dāng)不同大小的蛋白質(zhì)顆粒流經(jīng)凝膠柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入凝膠珠內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下移動(dòng)并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度地自由出入凝膠珠的內(nèi)外。大分子小分子

凝膠顆粒凝膠排阻示意圖解凝膠過濾層析蛋白質(zhì)分子一般有兩種形狀，一種是球形分子，另一種是線性分子。線性蛋白質(zhì)分子與球形分子比較，同樣大小分子量的蛋白質(zhì)，線性分子體積大流速快，球形分子體積小流速慢。因此，在凝膠色譜柱中無論是球形分子還是線性分子都可進(jìn)行別離，但球形分子比線性分子的別離度好。此法是利用離子交換劑作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行別離的方法。離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂〔如羧甲基纖維素等〕，陰離子交換樹脂〔如二乙基氨基乙基纖維素等〕。帶正電荷多的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合那么較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，或是改變流動(dòng)相的PH值，或是同時(shí)采用這兩種方法，可以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行別離。

離子交換層析（2）柱層析2．蛋白質(zhì)的純化方法離子交換層析這是一種高效別離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結(jié)合能力。選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價(jià)連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)那么流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液或高鹽溶液洗脫。③親和層析（2）柱層析2．蛋白質(zhì)的純化方法+CCC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附（3）電泳法2．蛋白質(zhì)的純化方法(1)原理：a.蛋白質(zhì)分子狀態(tài)在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一定凈電荷的分子。在電場下向自身電荷相反的方向移動(dòng)。b.復(fù)原劑的解聚作用在蛋白溶液和別離凝膠介質(zhì)中參加復(fù)原劑—-巰基乙醇(-mercaptoethanol)或二硫蘇糖醇(Dithiothretiol,DTT)。蛋白質(zhì)分子在復(fù)原劑作用下二硫鍵被復(fù)原，將多聚體或單鏈折疊的蛋白質(zhì)分子的二硫鍵翻開，形成長短不一的單鏈亞基。c.SDS的包裹作用SDS分子中含有大量的帶負(fù)電的磺酸基。蛋白質(zhì)分子解聚后形成的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合，在SDS的重量到達(dá)蛋白重量的3-4倍時(shí)蛋白質(zhì)分子外表完全被SDS包裹，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)亞基分子，稱之為蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物(protein-SDSmicelles)。由于蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)分子自身有的凈電荷，這樣就消除了不同分子之間原有的電荷差異。(2)操作過程制膠

加樣

電泳

固定

染色

脫色

計(jì)算(3)結(jié)果處理a.電泳圖譜123b.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)log(M)為縱坐標(biāo)，Rf值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。mRlgMr兔肌動(dòng)蛋白牛血清白蛋白兔磷酸化酶牛碳酸酐酶胰蛋白酶抑制劑雞蛋清溶菌酶c.未知蛋白分子量計(jì)算：將未知蛋白的Rf值查到log(M)值，便可知其分子量。計(jì)算分子量。(4)影響因素

影響SDS-復(fù)合物形成的主要因素。SDS-電泳成敗關(guān)之一，是在制備樣品的過程中，蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的程度直接影響電泳別離效果。影響結(jié)合的因素主要有三個(gè):A.溶液中SDS單體的濃度SDS在水溶液中以單體和SDS復(fù)合物混合存在的，能與蛋白質(zhì)結(jié)合的只能是單體。單體的濃度與SDS總濃度，溫度和離子強(qiáng)度有關(guān)。在一定溫度和離子強(qiáng)度下，SDS處于一飽和值，即單體濃度不再隨SDS中濃度增加而增加。為了使SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合充分，SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合的重量比一般是4:1或3:1。B.樣品緩沖液離子強(qiáng)度因?yàn)镾DS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量取決于平衡時(shí)SDS單體濃度，而不是總濃度，只有在較低的離子強(qiáng)度溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度，所以樣品緩沖液應(yīng)選用低離子強(qiáng)度，通常是10-100mmol/l之間。C.二硫鍵是否完全翻開只有蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵完全被翻開，蛋白質(zhì)分子完全解聚，SDS充分與亞基分子結(jié)合，才能準(zhǔn)確測定出亞基分子量。二硫鍵完全被翻開要取決于巰基乙醇的質(zhì)量和使用的劑量。假設(shè)蛋白質(zhì)分子的二硫鍵只是局部被翻開，這是測出的分子量是蛋白質(zhì)分子和亞基分子的混合物。b.蛋白質(zhì)與兩性電解質(zhì)(1)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì)。在不同的pH環(huán)境中所帶的正負(fù)電荷不同。假設(shè)在某特定的pH環(huán)境中其凈電荷為零，此時(shí)的pH為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，在電場下不泳動(dòng)。

(2)載體兩性電解質(zhì)：在等電聚焦電泳中，載體兩性電解質(zhì)具有以下兩種功能：A中和功能：兩性電解質(zhì)的性質(zhì)在別離系統(tǒng)中形成一個(gè)平衡穩(wěn)定的pH梯度，提供中和蛋白質(zhì)電荷的離子，具有pH緩沖能。B載電功能：兩性電解質(zhì)作為電的載體，具有運(yùn)載“電流〞的能力，有良好的導(dǎo)電性能水平板式電泳槽垂直板式電泳槽等電聚焦時(shí)，蛋白質(zhì)混合物的別離是在具有PH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。在電場中，每種蛋白質(zhì)成分將移向并“聚焦〞〔停留在等于其等電點(diǎn)的PH梯度處，形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。它的分辨率很高，可以把人的血清分成40多個(gè)區(qū)帶。適于做同工酶的鑒定。方法:制膠

加樣

電泳

固定

染色

脫色

計(jì)算等電聚焦③雙向電泳〔two-dimensionalelectrophoresis〕

雙向電泳是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳〔按照pI別離〕，然后再進(jìn)行SDS〔按照分子大小〕，經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。肽的化學(xué)合成〔了解〕五、六十年代，世界上，包括我國主要是從動(dòng)物器臟獲取肽。如：胸腺肽這種胸腺肽主要