《植物組織培養(yǎng)》課件 模塊四－1 器官培養(yǎng)（一）莖段培養(yǎng)

任務(wù)一器官培養(yǎng)（一）莖段培養(yǎng)

任務(wù)二器官培養(yǎng)（二）植物的再生培養(yǎng)

任務(wù)三培養(yǎng)物的不良表現(xiàn)及改進(jìn)措施任務(wù)四花卉的組織培養(yǎng)任務(wù)五水果作物的組織培養(yǎng)任務(wù)六植物液體培養(yǎng)常見植物組配方法與易發(fā)問題處理項(xiàng)目四常見植物組培方法與易發(fā)問題的處理任務(wù)一器官培養(yǎng)（一）一般掌握離體根培養(yǎng)的取材部位和培養(yǎng)基的選擇；掌握莖尖培養(yǎng)的種類和操作步驟；掌握莖段培養(yǎng)中材料的選擇、處理及培養(yǎng)基的調(diào)整；知識目標(biāo)123能夠根據(jù)不同植物及種類選擇合適的外植體進(jìn)行啟動培養(yǎng)；能夠根據(jù)不同的植物器官及器官狀態(tài)，選擇合適的滅菌劑和適宜的滅菌時間，對外植體進(jìn)行表面處理與滅菌；會通過觀察試管苗的長勢，大體判斷采取何種措施改善培養(yǎng)條件；熟練外植體滅菌的工藝操作流程；熟練各種試管苗繼代培養(yǎng)過程中的切割方式與技術(shù)；熟練無菌操作技術(shù)。技能目標(biāo)123456學(xué)習(xí)提示多動手，勤實(shí)踐；多比較，多聯(lián)想，勤歸納；手、口、腦并用，學(xué)做合一。理論閱讀植物器官培養(yǎng)主要是指離體的根、莖、葉、花器和果實(shí)、種子的無菌培養(yǎng)，是植物組織培養(yǎng)中最主要的一個方面。植物器官培養(yǎng)不僅是研究器官生長、營養(yǎng)代謝、生理生化、組織分化和形態(tài)建成的最好材料和方法，而且具有重要的應(yīng)用價值。理論閱讀實(shí)際應(yīng)用植物器官培養(yǎng)可利用莖、葉和花器培養(yǎng)建立的試管培養(yǎng)物，進(jìn)行名優(yōu)特新品種的快速繁殖；利用莖尖培養(yǎng)可以得到脫毒試管苗，解決品種的退化問題，提高產(chǎn)量和品質(zhì)；將植物器官作誘變處理，利用器官培養(yǎng)可得到突變株，進(jìn)行細(xì)胞的突變育種。實(shí)際應(yīng)用離體根培養(yǎng)是進(jìn)行根系生理和代謝研究最優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)體系。因?yàn)楦瞪L快，代謝強(qiáng)，變異小，能根據(jù)研究需要，改變培養(yǎng)基的成分來研究其營養(yǎng)吸收、生長和代謝的變化。在工廠化生物反應(yīng)器系統(tǒng)中通過工藝調(diào)控實(shí)現(xiàn)大規(guī)模根培養(yǎng)，不受環(huán)境和季節(jié)的限制，隨時隨地生產(chǎn)根培養(yǎng)物，進(jìn)行藥物、微量活性物質(zhì)及一系列次生代謝產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。另一方面，由根細(xì)胞可再生成植株用于生產(chǎn)實(shí)踐。第一節(jié)根的培養(yǎng)一、根無性繁殖系的建立1.外植體

根的培養(yǎng)材料一般來自無菌種子發(fā)芽產(chǎn)生的幼根或植株根系經(jīng)滅菌處理后的切段。

2.根無性繁殖系的建立

將種子進(jìn)行表面消毒，在無菌條件下萌發(fā)，待根伸長后從根尖一端切取長1.2cm的根尖（或植株的根系經(jīng)表面滅菌后）接種于培養(yǎng)基中。這些根的培養(yǎng)物生長甚快，幾天后發(fā)育出側(cè)根。待側(cè)根生長約一周后，即切取側(cè)根的根尖進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，它們又迅速生長并長出側(cè)根，又可切下進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)，就可得到從單個根尖衍生而來的離體根的無性繁殖系。這種根可用來進(jìn)行根系生理生化和代謝方面的實(shí)驗(yàn)研究。油棕根培養(yǎng)（引自劉進(jìn)平，2005）油棕根培養(yǎng)（引自劉進(jìn)平，2005）二、培養(yǎng)方法一、植株再生培養(yǎng)根的離體培養(yǎng)也可以用來再生植株。第一步誘導(dǎo)形成愈傷組織；第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的分化，在愈傷組織上分化成小植株。

需要注意的是，愈傷組織如果先分化形成根則往往抑制芽的形成。再生培養(yǎng)流程再生培養(yǎng)流程圖再生培養(yǎng)視頻

視頻二、固氮培養(yǎng)

通過分離和培養(yǎng)具有固氮作用的根瘤菌，接種到禾谷類等作物的試管苗根系中，可以實(shí)現(xiàn)谷物直接利用生物固氮的捷徑。通過選擇有效的適當(dāng)濃度的誘瘤劑誘導(dǎo)根瘤菌侵入試管苗根部結(jié)瘤固氮，固氮菌接種時要給根系創(chuàng)造傷口，以利于根瘤菌的侵入。接種根瘤菌形成的根瘤具有一定的固氮活性并向宿主提供氮素，能促進(jìn)植株生長和氮營養(yǎng)的改善，無論在株高、鮮重和葉綠素含量都有提高。

二、培養(yǎng)方法三、影響因素1.植物種類2.培養(yǎng)基多為濃度低的White培養(yǎng)基，許多植物在1/2MS培養(yǎng)基上能生根。糖的使用濃度應(yīng)稍低，如玫瑰生根蔗糖為2%。3.生長物質(zhì)培養(yǎng)基中添加適宜濃度的生長素有利于根的形成和生長，常用生長素為IAA、NAA、IBA，濃度范圍一般為0.0-1.0mg/L。三、影響因素4.pH根的培養(yǎng)適宜的pH范圍為5.0~6.0，5.光照大多數(shù)人認(rèn)為，黑暗有利于根的形成。試管苗的生根一般無需考慮光照的影響，有時加一點(diǎn)活性炭可減弱光照，對植物的生根比較有利。6.溫度生根溫度一般控制在16~25℃。第二節(jié)莖尖培養(yǎng)

意義：莖尖不僅生長速度快、繁殖率高、不易產(chǎn)生遺傳變異，而且是獲得無病毒苗木的有效途徑，故莖尖培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)最常用的試材之一。類型：莖尖培養(yǎng)分為微莖尖培養(yǎng)和普通莖尖培養(yǎng)。微莖尖指帶有1～2個葉原基的生長錐，其長度不超過0.5mm。普通莖尖指較大的莖尖（如幾mm到幾十mm）、芽尖及側(cè)芽。這里主要講普通莖尖培養(yǎng)。這種培養(yǎng)技術(shù)簡單，操作方便，莖尖容易成活，成苗所需時間短。一、普通莖尖培養(yǎng)

1.取材

挑選雜菌污染少，生長不久的莖尖。木本植物可在取材前對莖尖噴幾次滅菌藥劑。以保證材料不帶或少帶雜菌。用于普通莖尖培養(yǎng)，可先從植物的莖、藤或匍匐枝上切取2cm以上的頂梢。莖尖取材示意圖外植體采集與處理視頻外植體采集與處理視頻

莖尖的解剖構(gòu)造（引自劉進(jìn)平，2005）莖尖的解剖構(gòu)造一、普通莖尖培養(yǎng)

2.滅菌將采到的莖尖切成0.5～1.0cm長，并將大葉除去，休眠芽預(yù)先剝除鱗片。將莖尖置于流水沖洗2～4小時(視干凈程度），再在70%的酒精中處理10-30秒，然后在稀釋5～

10倍的次氯酸鈉（商品次氯酸鈉為10%）中浸10～15分鐘，最后用無菌水沖洗3～

4次，或者用0.1～

0.2%的氯化汞滅菌5～

10分鐘，無菌水沖洗5次以上。莖尖滅菌外植體滅菌視頻外植體滅菌視頻一、普通莖尖培養(yǎng)

3.接種

為了減少污染，可在接種前再剝掉一些葉片，使莖尖為0.5cm左右大小。有些植物的莖尖由于多酚氧化酶的氧化作用而發(fā)生褐化，使培養(yǎng)基變褐，影響材料的成活。所以在接種時，不能用生銹的解剖刀，動作要敏捷，隨切隨接，減少傷口在空氣中暴露的時間，也可配制1～5%Vc液，將切下的莖尖材料浸入處理一下。接種視頻接種視頻一、普通莖尖培養(yǎng)

4.培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基多數(shù)莖尖培養(yǎng)采用MS作為基本培養(yǎng)基或改良MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中生長素是必須的，如2,4-D，IAA，NAA等，一般用0.1mg/L左右，高于此濃度，往往產(chǎn)生畸變芽或形成愈傷組織。莖尖在培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)生長太慢、生長太快和生長正常等三種類型。桑樹莖尖萌發(fā)桑樹莖尖萌發(fā)

楊樹頂芽萌發(fā)成叢生芽楊樹頂芽萌發(fā)成叢生芽

一、普通莖尖培養(yǎng)

4.培養(yǎng)（2）初代培養(yǎng)

莖尖的初代培養(yǎng)主要是通過適宜的培養(yǎng)條件刺激頂芽和腋芽的生長。外植體啟動生長的關(guān)鍵主要是培養(yǎng)基的激素配比與濃度，一般應(yīng)使用較高濃度的細(xì)胞分裂素和較低濃度的生長素，解除頂端優(yōu)勢的抑制作用，生長素濃度過高容易產(chǎn)生愈傷組織。初代培養(yǎng)視頻初代培養(yǎng)視頻一、普通莖尖培養(yǎng)

4.培養(yǎng)

（3）繼代培養(yǎng)

莖尖長成的新梢，可切成若干小段，轉(zhuǎn)入到增殖培養(yǎng)基中。長大后又可切成小段，再轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基，這樣一代一代繼續(xù)下去，便建立和維持了莖尖無性繁殖系。繼代培養(yǎng)的激素濃度要降低或用MS0培養(yǎng)基。有時也可邊進(jìn)行繼代培養(yǎng)邊進(jìn)行誘導(dǎo)生根。取比較長的新梢（如2cm以上）轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，余下較短的新梢繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)視頻繼代培養(yǎng)視頻一、普通莖尖培養(yǎng)

4.培養(yǎng)（4）誘導(dǎo)生根誘導(dǎo)生根多采用1/2MS培養(yǎng)基，即MS培養(yǎng)基的各種組成成份用量均減半的培養(yǎng)基。并加入一定的生長素類調(diào)節(jié)物質(zhì)，如NAA、IBA等。也可將切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液中處理4～8小時，然后轉(zhuǎn)移到無激素的生根培養(yǎng)基中。注意較高濃度的生長素對生根有抑制作用。生根培養(yǎng)視頻生根培養(yǎng)視頻單芽莖段微繁示意圖

單芽莖段微繁示意圖單芽莖段增殖示意圖單芽莖段增殖示意圖叢生芽微繁示意圖（引自劉進(jìn)平，2005）叢生芽微繁示意圖叢生芽增殖示意圖叢生芽增殖示意圖（5）培養(yǎng)條件

每天照光16小時，照度1500～3000Lx即可，溫度通常為25±2℃。一般莖尖培養(yǎng)在40天左右可長成新梢，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。4.培養(yǎng)一、普通莖尖培養(yǎng)5．馴化移栽

生根培養(yǎng)一個月左右，多數(shù)新梢即可獲得生長健壯而發(fā)達(dá)的根系。移植時可根據(jù)生根情況來進(jìn)行。若發(fā)現(xiàn)新梢基部生有較濃密的不定根，長度在1cm以內(nèi)，就可移栽入土。移栽時通過幾天的煉苗過程，從試管中取出小植株，輕輕洗掉培養(yǎng)基。栽后給予較高的空氣濕度條件。一、普通莖尖培養(yǎng)馴化視頻馴化視頻

首先營養(yǎng)缽的培養(yǎng)土要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭小拱棚，以減少水分的蒸騰，初期要常噴霧處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)小苗有生長趨勢，可逐漸減少濕度將拱棚兩端打開通風(fēng)，并且減少噴水次數(shù)。使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，少澆水或不澆水，促進(jìn)小苗長得粗壯。馴化移栽最適宜的溫度是16～20℃，春季地溫較低時，可用電熱線來加溫。光照管理上，初期可用較弱的光照，在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報(bào)紙等，以防陽光灼傷小苗和增加蒸騰作用，后期可直接利用自然光照。為了提高馴化效率，可用育苗盤進(jìn)行馴化生根，選擇2cm左右孔徑的育苗盤即可?？籽ㄑb入蛭石：珍珠巖：草炭土為1︰1︰0.5的基質(zhì)。馴化移栽第三節(jié)莖段培養(yǎng)莖段培養(yǎng)是指對植物帶有一個以上芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖的幼莖切段）進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。莖段培養(yǎng)的主要目的是進(jìn)行植物的離體快速繁殖。莖段培養(yǎng)用于快速繁殖的優(yōu)點(diǎn)在于：培養(yǎng)技術(shù)簡單易行、繁殖速度較快；芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無病、變異小、性狀均一等。第三節(jié)莖段培養(yǎng)一、無菌培養(yǎng)物的建立1.取材

取生長健壯無病蟲的當(dāng)年生幼嫩枝條或鱗莖盤，去掉葉片，剪成3～4cm的小段。取材時注意莖的基部比頂部切段、側(cè)芽比頂芽的成活率低，所以應(yīng)優(yōu)先利用頂部的外植體，但由于每個新梢僅一個頂芽，也可利用腋芽，莖上部的腋芽培養(yǎng)效果較好。還應(yīng)注意盡量在生長期取芽，如蘋果在3～6月取材的成活率為60%，7～11月下降到10%，12～2月都在10%以下。一、無菌培養(yǎng)物的建立

取材視頻取材視頻

2.滅菌

20分鐘，如果材料表面有絨毛應(yīng)在消毒劑中滴加1-2滴土溫—20或80。因材料老嫩和蠟質(zhì)多少而定時間。最后用無菌水沖洗數(shù)次以致干凈，否則植物材料會受殘留滅菌劑的危害。一、無菌培養(yǎng)物的建立滅菌視頻滅菌視頻3.接種

消毒好的莖段用鋒利的解剖刀或剪刀剪去兩端消毒劑殺傷的部位，分切成單芽小段接種于預(yù)先配好的誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)的培養(yǎng)基中，一般每瓶接種一塊外植體，防止交叉感染。一、無菌培養(yǎng)物的建立接種視頻接種視頻二、培養(yǎng)方法和程序1.培養(yǎng)

最常用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，加入3%蔗糖，用0.7%的瓊脂固化。培養(yǎng)條件保持25℃左右，給予充分的光照和光期。經(jīng)培養(yǎng)后莖段的切口特別是基部切口上會長出愈傷組織，呈現(xiàn)稍許增大，而芽開始長長，有時會出現(xiàn)叢生芽，從而得到無菌苗。

二、培養(yǎng)方法和程序

月季莖段側(cè)芽萌發(fā)（引自譚文澄、戴策剛，1991）月季莖段側(cè)芽萌發(fā)在莖段培養(yǎng)中，促進(jìn)腋芽增殖用6-BA是最為有效的。生長素雖不能促進(jìn)腋芽增殖，但可改善苗的生長。GA對芽的伸長有促進(jìn)作用。繼代擴(kuò)繁是莖段培養(yǎng)的主要一步。這可由二種途徑解決：一是促進(jìn)腋芽的快速生長；二是誘導(dǎo)形成大量不定芽。二、培養(yǎng)方法和程序莖段快繁方式模式圖

第一種途徑的好處是不會產(chǎn)生變異，能保持品種優(yōu)良特性，且方法簡便，可在各種植物上使用。每年從一個芽可擴(kuò)繁增殖10萬株以上。莖段快繁方式模式圖第二種途徑（誘導(dǎo)形成大量不定芽）有時會產(chǎn)生變異。繼代增殖過程所用培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑與初代培養(yǎng)相同，有時會稍低。二、培養(yǎng)方法和程序生根培養(yǎng)主要是降低或除去細(xì)胞分裂素而加入生長素。由于在苗增殖時施用了較高濃度的細(xì)胞分裂素，其苗中保持著一定的量，因此在生根培養(yǎng)中不需要加細(xì)胞分裂素。生長素的濃度，NAA一般為0.01～1.0mg/L，IBA和IAA可稍高。生根培養(yǎng)時最好在培養(yǎng)基中加0.3%活性炭，以促進(jìn)生根。二、培養(yǎng)方法和程序二、培養(yǎng)方法和程序2.移植

這是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵一環(huán)。試管苗是在恒溫、濕度飽和、營養(yǎng)豐富、激素適當(dāng)和無菌條件下生長的。植物的組織發(fā)育程度不高，植株幼嫩