DB22-T2015-2014-壞死梭桿菌檢測(cè)PCR法-吉林省

ICS11.220B41DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2015—2014壞死梭桿菌檢測(cè)PCR法DeterminationofFusobacteriumnecrophorum—PolymeraseChainReaction吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2015—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009、GB/T20001.4—2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省農(nóng)業(yè)委員會(huì)提出，吉林省畜牧業(yè)管理局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳立志、馮二凱、王秀東、劉曉穎、姚志利、王峰、王雷、司方方、范琳琳、徐晶、姜英。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。IDB22/T2015—2014壞死梭桿菌檢測(cè)PCR法警告——使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問(wèn)題，使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合管家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了壞死梭桿菌的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于反芻動(dòng)物壞死梭桿菌的檢測(cè)和分型。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1壞死梭桿菌fusobacteriumnecrophorum體外酶促合成特異性DNA片段的一種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即模板DNA先經(jīng)高溫變性成單鏈，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條引物分別與兩條模板DNA鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）為底物，使退火引物得以延伸。如此反復(fù)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。4縮略語(yǔ)1DB22/T2015—20145原理針對(duì)壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素兩亞種啟動(dòng)子的特異性區(qū)域基因序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)從臨床疑似壞死桿菌病病料擴(kuò)增特異性DNA片段，根據(jù)是否擴(kuò)增特異性片斷及片斷大小對(duì)壞死梭桿菌進(jìn)行檢測(cè)和分型。6試劑與材料除非另有說(shuō)明，所有的化學(xué)試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水規(guī)格應(yīng)符合GB/T6682中二級(jí)水的規(guī)定6.1試劑6.1.1引物上游引物：P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3上游引物：P2:5-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3下游引物：P3:5-GCACGACAAACCAAATAGC-3配制成10μmol/L，-20℃保存。6.1.2DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：DL2000。6.1.3細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。6.1.4dNTP溶液，含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，各2.5mnol/L。6.1.5DNA聚合酶（5U/μL）。100mmol/LKCl,160mmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LMgSO4,200mmol/LTris-HCl(pH8.8),1%TritonX-100，1mg/mLBSA。TAE電泳緩沖液（50倍）滅菌三蒸水微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB）溶液5μL。6.1.10溴化乙錠（10mg/mL）：稱量100mg溴化乙錠溶解于10mL水中，然后分裝成1mL/份，4℃避光保存。50×TAE：稱量242.0gTris溶于700mL蒸餾水中，加入57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）后定容至1000mL，使用時(shí)50倍稀釋。2DB22/T2015—20146.1.126×LoadingBuffer(市售）:含0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液，4℃保存。6.2材料6.2.1離心管：1.5mL。6.2.2吸頭：1000μL。6.2.3吸頭：200μL。6.2.4吸頭：10μL。6.2.5PCR反應(yīng)管。6.2.6冰盒：12孔×4孔。7儀器設(shè)備7.1紫外分光光度計(jì)。7.2PCR儀。7.3電子天平（感量±0.01g）。7.4紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。7.5離心機(jī)>12000r/min。7.6核酸電泳儀。7.7渦旋振蕩器。7.8微量可調(diào)移液器：0.2μL～2μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。7.9恒溫水浴鍋。7.10pH計(jì)8樣品用無(wú)菌棉拭子沾取疑似感染壞死梭桿菌的動(dòng)物病灶的病健結(jié)合處的組織或膿汁，放入滅菌的凍存管中，低溫冷藏保存（0℃~4℃）備用。將采回病料使用200μLTE懸浮，自然沉淀5min，2000r/min離心3min，4000r/min離心1min；吸取上清至另一滅菌EP管，12000r/min離心5min，棄上清；加200μLTE重懸沉淀，12000r/min離心5min，棄上清，洗三次；沉淀加200μLTE重懸。壞死梭桿菌necrophorum亞種（ATCC27852）基因組DNA；壞死梭桿菌funduliforme亞種（ATCC51357）基因組DNA；按照基因組試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取壞死梭桿菌necrophorum亞種（ATCC27852）和壞死梭桿菌funduliforme亞種（ATCC51357）基因組DNA。3DB22/T2015—20148.4.2隱性對(duì)照：滅菌水9檢測(cè)9.1PCR反應(yīng)體系表1PCR反應(yīng)體系單位為微升成分用量ComponentdosagedNTP/（2.5mMeach）2.010×PCRBuffer/（Mg2＋陰性）2.5引物L(fēng)7/(10mM)引物L(fēng)8/(10mM)引物L(fēng)9/(10mM)1.01.01.03.5Mg/（25mM）2/注：按照上述試劑順序逐項(xiàng)加樣至已編好號(hào)的0.2mL的PCR反應(yīng)管中比，混勻后瞬離用TAE電泳緩沖液配制成1%瓊脂糖平板（溴化乙錠終濃度0.5μg/mL）。將平板放入水平電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液剛剛高出凝膠表面，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL與6μL上樣緩沖液混合，分別加入樣品孔中，取5μLDNAMarkerDL2000加入到標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照孔內(nèi)。5V/cm恒壓電泳30-45min。4DB22/T2015—2014用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。在陰性和陽(yáng)性對(duì)照成立情況下，若待檢樣品出現(xiàn)1076bp特異性片段，即判定為Fnn亞型；出現(xiàn)809bp特異性片段，即為Fnf亞型。必要時(shí)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，如果結(jié)果與附錄A參考序列比較，序列相似性在95%以上，可進(jìn)一步確認(rèn)待測(cè)樣品結(jié)果為陽(yáng)性（標(biāo)準(zhǔn)序列見(jiàn)附錄A1、A2）。11廢棄物處理和防止污染的措施。11.1檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物進(jìn)行無(wú)害化處理。11.2檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照WS/T230中污染的預(yù)防和控制規(guī)定執(zhí)行。5DB22/T2015—2014附錄A（資料性附錄）壞死梭桿菌亞型判定的特征性序列A1.壞死梭桿菌Fnn型白細(xì)胞毒素啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增片段序列：GCTTTCCTGCTTGTTTATTTCTCATGATCTTTTTGTTGTTCGAAATATTTGCGATAGAGTTTTGATTATGAAAGAAGGGAAAATCATAGAAGAAGGAAAGAAAGAGGAAATCTTTAAAGCACCGAAAAAAGAGTATACTCAATTTTTGCTGGAAGTGAGTATGAGTTTTATATTTTGATATAAAATCGAATAAAAAGGTATTTTTTTGAAGAAAGGAAGCTTATCTTAACATAGATTTAACATTTGATGTGATAGCATGAATTTAATATAAAATGCTGAAAATGTATCTAAAAATAATATAAAAAGAACATTGTATTTCCATAAAAAAATATTTTTTTAAATAAATATTTTATATAAAAAAATAATTAAATTTAAACTAGACATACAATAAGAAATATGCTAATCTAATAACGCTTGATATTTTAAAAAAATTAAAAATCATGAATACAATAGATGTTTATATCATTTGAGCTTCTTTTTTGAAAAACAGGAATTGTATTTTAATATAAAAAAATACTTCTTAAGATGAATATTTTATATAAAAAAATAATTAAATTCGAACTAGACATATGATAAGAAATATGCTAGTCTAATAACAGTTGATATTTTAAAAAAATTAAAAATTCATAAAAAATAAAATTGGGAGAAATTATGTTTCATTTAAAAAAAGAATTAAAAACATTTGTTTTTTTTATGTTGATTTTAAGTTGCCCAAATATATTGGCAGAAGGAATTCAAACATCCTCTACAGAATCGGATGCTGGAATGCTACTTGATAGAAACAACAGGATATTTCAACAAGGAAAATTACAGAAGATTTTGCATTCTGAGAAAGAAAAACGAAAACAAGGAATTGAAAATTTGGAGAAGAAAAAGGAAGAAGATATCAAAGTATCAGATGTTTCTTTTTTATTAAAAAAATTGGAGATTCCAAAGTCTGATATTTTAACAGAAGAAGAAATCGTAAGGATTTGGGAGCCCTATATAGAAAAAGAAGTTACCGTTGCAGATCTTTATACTATAGTTCAAAAAATCAATGAATTATATCAGGAAAAAGGCTATTTGGTTTGTCGTGCACAATTTTTGTTGGAAGCGAGTATACAATTTTTGTATGAAAAAGATAAAAAGAGAATATAAATTTTGGCTGTTTAAATTTTTTAAACAGCTTTTTTATTTTTGGAATAAAAAAATTAGGAAAGTATATCAAAAAATGAAAAAGAAACCATAAAAATAAAAAAACAAAAAATAATTGTTTTATTTTCGATAAATAAGAAAAAATAGGTATTTTATAATTTTTAAAAAATTAAAATGTTCTGAAATTATAAAAATATTTCTTAAAACGAATATTTTATATAGAAATACGTTCAAATTCAAGCTAGACATATTGTGAGAAATATGTTATTTTGATAATGGCTGTTATTTAATAAAAATTAAAAATTCATGAAAAATAAAATTAGGAGAAATTATGTTTCAGTTAAAGAAAGCTTTGAAAATACTTCTTTTTTTATCGATATTCAATAGCTCAAGTGTTTTTGCAGAAGAAGTCGGAATATTATCTACAGAATTGGATTCCGGAATATTAACAGATAGAAATAATAAAATATTCCAACAAGAAAAATTACAAAGAACATTGAAGTACGAAAAAGAGAAACGAAAGCAGGGAATTGAAAAT