實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 沙門菌檢測(cè)方法 征求意見稿

本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌檢測(cè)方法。本文件適用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本和動(dòng)物源性生物制品為來源的樣品中沙門菌的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注明日下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注明日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.42實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)標(biāo)本采集GB/T14926.43實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)染色法、培養(yǎng)基和試劑GBGB4789.4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)3原理沙門菌在培養(yǎng)基上有特定的生長(zhǎng)、形態(tài)和生理生化特征；菌體抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，產(chǎn)生凝集反應(yīng)。沙門菌屬中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見沙門菌株有特有的基因組核酸序列，可被基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等的核酸擴(kuò)增技術(shù)所識(shí)別。4主要設(shè)備和材料恒溫培養(yǎng)箱、實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增儀5培養(yǎng)基及試劑5.1培養(yǎng)法用試劑5.1.1亞硒酸氫鈉增菌液（SF）5.1.2Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基5.1.3DHL瓊脂5.1.4木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂5.1.5三糖鐵瓊脂（TSI）5.1.6糖發(fā)酵培養(yǎng)基5.1.7賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基5.1.8氰化鉀培養(yǎng)基5.1.9蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑5.1.10沙門菌多價(jià)診斷血清5.1.11半固體瓊脂5.1.12營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）5.1.13尿素瓊脂（ph7.2）5.1.14鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培養(yǎng)基5.1.15丙二酸鈉培養(yǎng)基上述培養(yǎng)基的配置方法參見GB/T14926.43《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)染色法、培養(yǎng)基和試劑》，未列入GB/T14926.43的試劑，參考GB4789.4附錄中的培養(yǎng)基組成進(jìn)行配制。5.2核酸擴(kuò)增法試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的引物和探針見下表；PCR實(shí)驗(yàn)需要其他試劑見附錄A。引物和探針名稱Salm-FAAGTTGATGGTGCGAGGTTCSalm-RCCACATCATCAGCCTGACACSalm-ProbeVIC-TGGCGGTCCAATGTGGTTAT-BHQ16檢測(cè)程序36℃±1℃,過夜36℃±1℃,過夜生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)疑似沙門菌!↓↓靛基質(zhì)-賴氨酸+/-36℃±1℃,18h~24h↓核酸擴(kuò)增鑒定結(jié)果不符合結(jié)核酸擴(kuò)增鑒定結(jié)果不符合結(jié)果符合賴氨酸+血清學(xué)分型（選做）血清學(xué)分型（選做）7操作步驟采取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物回盲部?jī)?nèi)容物、糞便或肛拭子，可參照GB/T14926.42的要求。7.2分離培養(yǎng)7.2.1直接分離培養(yǎng)回盲部?jī)?nèi)容物或糞便或肛拭子（上述樣本充足直接劃線接種DHL瓊脂平板或XLD瓊脂平板，于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h~24h。7.2.2增菌分離培養(yǎng)當(dāng)采集的回盲內(nèi)容物或糞便或肛拭子較少時(shí)，可選擇增菌處理，將標(biāo)本樣品接種的SF增菌液，置36±1℃培養(yǎng)過夜，再接種分離培養(yǎng)基。7.3鑒定7.3.1菌落特征DHL瓊脂上為無色半透明，菌落中心黑色或幾乎全黑色；XLD瓊脂上為粉紅色菌落帶或不帶黑芯，有些為全黑色菌落，有些菌株為黃色菌落帶或不帶黑芯。7.3.2菌體特征革蘭陰性桿菌，無芽孢，無莢膜。7.3.3生化特征按GB4789.4中5.4規(guī)定的生化反應(yīng)或選用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀或商品化鑒定試劑盒。7.3.4血清玻片凝集試驗(yàn)陽性。7.4全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用在分離培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基上的可疑菌落，可應(yīng)用全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)的鑒定。7.5病原基因組核酸擴(kuò)增檢測(cè)需要時(shí)，可采用分子病原學(xué)方法鑒定。對(duì)來自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的樣品可以進(jìn)行基因組核酸提取，并參照附錄A的方法進(jìn)行沙門菌基因組核酸擴(kuò)增，并參照附錄判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。8結(jié)果報(bào)告根據(jù)檢測(cè)結(jié)果出具報(bào)告。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌基因組核酸檢測(cè)方法A1材料和試劑A1.1核酸樣品保存液A1.2細(xì)菌基因組核酸提取試劑或試劑盒A1.3無核酸酶水（DEPCtreatedH2O）A1.4含Taq酶等成分的PCR體系混合液或等效成分。A1.5引物和探針：根據(jù)表A1序列合成引物和探針，引物和探針加入滅菌無核酸酶水配制成10μmol/L儲(chǔ)備液，-20℃保存。引物和探針序列見正文5.2。A2.檢測(cè)方法A2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌核酸檢測(cè)樣品的采集與處理參考GB/T14926.42《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)標(biāo)本采集》的一般要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道，特別是盲腸內(nèi)容物樣品的采集（小型嚙齒動(dòng)物適用糞便樣品應(yīng)新鮮采集，疑似患病動(dòng)物的糞便樣品采集應(yīng)注意生物安全防護(hù)；肛拭子樣品采集要做好動(dòng)物的保定，必要時(shí)采取麻醉措施。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本和動(dòng)物源性生物制品為來源的樣品，在樣品采集時(shí)應(yīng)考慮樣品中沙門菌污染量可能較低，采樣量應(yīng)有所增加。樣品采集量應(yīng)滿足后續(xù)核酸提取的需要，可根據(jù)選擇的核酸提取試劑的要求進(jìn)行控制。用于核酸檢測(cè)的樣品應(yīng)盡快加入含胍鹽的核酸樣品保護(hù)液，震蕩混勻后，低溫保存；當(dāng)日完成檢測(cè)，可暫時(shí)保存在2~8℃的環(huán)境；當(dāng)日無法完成后續(xù)核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)的，應(yīng)儲(chǔ)存于-20℃以下的低溫環(huán)境。A2.2樣品中細(xì)菌基因組DNA核酸的提取與保存根據(jù)核酸提取技術(shù)方法的要求或核酸提取試劑的要求進(jìn)行核酸提取。核酸提取應(yīng)對(duì)提取過程和提取環(huán)境進(jìn)行控制，防止對(duì)樣品對(duì)環(huán)境的污染，也需要控制樣品可能對(duì)環(huán)境和其他樣品的污染。提出的樣品核酸應(yīng)做好樣品標(biāo)識(shí)，在后續(xù)擴(kuò)增完成前應(yīng)做好保藏。1日內(nèi)可保藏于2~8℃的環(huán)境；長(zhǎng)期保藏，于-70℃以下低溫環(huán)境。應(yīng)避免反復(fù)凍融，防止核酸降解。A2.3沙門菌目標(biāo)片段的擴(kuò)增與檢測(cè)按照附表A.1進(jìn)行檢測(cè)體系的設(shè)立。表A.1探針法實(shí)時(shí)熒光PCR體系的配置體系×12×ProbeqPCR擴(kuò)增緩存液PCRForwardPrimerPCRReversePrimerProbeRNaseFreedH2OTotalDNA0.40.40.8x2總體積20反應(yīng)液的配制亦在冰上操作，建立擴(kuò)增體系后再加入核酸模板。每次檢測(cè)除待測(cè)樣品外，應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，空白對(duì)照即為不加模板對(duì)照（notemplatecontrol，NTC），即在反應(yīng)中用水來代替模板。擴(kuò)增程序按照附表A.2進(jìn)行。表A.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)步驟時(shí)間（s）循環(huán)數(shù)預(yù)變性301變性5退火、延伸3440注：可使用其他等效的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做相應(yīng)調(diào)整。A2.4結(jié)果的記錄擴(kuò)增判定基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣本擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。應(yīng)記錄擴(kuò)增曲線和單個(gè)樣品的Ct值。A3檢測(cè)結(jié)果的判定A3.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)空白對(duì)照無Ct值，并且無典型擴(kuò)增曲線。陰性對(duì)照無Ct值，并且無典型擴(kuò)增曲線。陽性對(duì)照樣品的Ct值，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)控要求進(jìn)行控制，擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)在其標(biāo)稱Ct值范圍±1之內(nèi)。滿足上述質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)收集的樣品擴(kuò)增熒光曲線和樣品Ct值判定結(jié)果。A3.2A3.2.1待測(cè)樣本有典型擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35時(shí)，可判定樣品中含有沙門菌基因組DNA。A3.2.2待測(cè)樣本有典型擴(kuò)增曲線，35＜Ct值≤40，需復(fù)檢，復(fù)檢仍出現(xiàn)35＜Ct值≤40，并