實驗動物 猴免疫缺陷病毒檢驗方法 編制說明

《實驗動物猴免疫缺陷病毒檢測方法》GB14926.62修訂編制說明1.任務(wù)來源：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)委員會2023年國家標(biāo)準(zhǔn)復(fù)審修訂計劃（國標(biāo)委14926.62《實驗動物猴免疫缺陷病毒檢測方法》由全國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委2.起草單位：廣東省生物技術(shù)研究院（廣東省實驗動物監(jiān)測中心）、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物所、蘇州西山生物技術(shù)有限公司。任務(wù)下達(dá)后中國實驗動物學(xué)會立即組織專家成立修訂驗動物猴免疫缺陷病毒檢測方法》GB/T14926.62修訂工作。本標(biāo)準(zhǔn)修訂單位實驗動物所、蘇州西山生物技術(shù)有限公司、為前病毒。SIV是國標(biāo)中SPF級猴需要排除的病原體，也是進出口猴必須檢測基礎(chǔ)研究及新藥臨床評價中越來越受到人們的重視。如猴艾滋病(SAIDS)就是研結(jié)果的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，實驗猴的質(zhì)量目前，國內(nèi)SIV感染診斷方法主要是針對抗體檢測的血清學(xué)檢測方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和免疫熒光試驗（IFA）等。SIV感染猴通常表現(xiàn)為無癥狀狀態(tài)，且在感染的初期或終末期，動物免疫系統(tǒng)功能低下，常規(guī)血清學(xué)SIV抗體檢測可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，抗體檢測方法不能實時反映動物體內(nèi)的病原檢測方法，傳統(tǒng)的SIV病原檢測以病毒分離結(jié)果作為衡量病毒感染情況的重要指標(biāo),病毒分離的方法操作相對簡便,結(jié)果穩(wěn)定,特異性好,但培養(yǎng)周期過長,敏感性低,尤其在疾病的潛伏期和平臺期,即血漿RNA病毒載量降低的情動物猴免疫缺陷病毒檢測中。PCR技術(shù)檢測猴免疫缺陷病毒在國內(nèi)的報道首先目前，關(guān)于PCR檢測技術(shù)在猴免疫缺陷病毒中的檢測已有相關(guān)報告，且國內(nèi)外許多實驗動物檢測機構(gòu)也開展了實驗動物病時熒光定量PCR檢測方法更加快速簡便、且具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性的血清學(xué)檢測方法，T/CALAS47-22.本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的技術(shù)內(nèi)容及要求應(yīng)科學(xué)合理，適用性和可對預(yù)防和控制猴免疫缺陷病毒傳播具有重要意義。本標(biāo)準(zhǔn)開展過程中，在GB/T14926.62-2001原有基礎(chǔ)上，將核酸檢測技術(shù)列入其中，實驗人員可根據(jù)實驗室實際條件和需要進行選擇，以便有效、快速地本標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容包括猴免疫缺陷病毒檢測方法包括抗體檢測方法和核酸檢）；）；），f)增加規(guī)范性附錄A，在附錄A中介利用PrimerExpress3.0引物探針設(shè)計軟件（AppliedBiosystems），根據(jù)類病毒序列進行比較，保證引物序列的通用性和特異性。引物和探針由表1SIV實時熒光RT-PCR擴增引物和探針參照Takara公司PremixExTaq(PerfectRealTime)試劑盒操作說明配制SIV熒光定量PCR反應(yīng)體系，以SIV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（1×105copies/μl）作為反應(yīng)模板用矩陣法對熒光PCR反應(yīng)體系中引物（0.1~1.0μM）和TaqMan探針濃度通過比較Ct值和熒光強度增加值(絕對熒光強度與背景熒光強度的差值，ΔRn)來判斷優(yōu)化結(jié)果；采用二溫循環(huán)法對反應(yīng)的退火溫表2引物優(yōu)化Ct值結(jié)果600nM，800nM200nM100nM700nM600nM為陰性對照，水作為空白對照（NTC），驗證該方法的特異性。結(jié)果除SIV為陽性外，其他病毒均為陰性，用空白Cem174細(xì)胞DNA和水空白對照也均未出現(xiàn)擴增，表明建立的方法具有良好的特異性（圖3）。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用Easydilution（Takara公司）做10倍系列稀釋，得到2×107~2×100copies/μL系列標(biāo)準(zhǔn)模板。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件測定各稀釋結(jié)果見圖11-9，可見各梯度之間間隔的Ct值基本相等，Cem174細(xì)胞DNA和其線性回歸方程為Ct=-3.26×lg（拷貝數(shù)）+41.02，公式計算得擴增效率E=101/3.26-1=1.027，即擴增效率為102.7%，相關(guān)系數(shù)組因模板濃度較低無擴增曲線。因此，本研究中標(biāo)準(zhǔn)品定量200拷貝以上能表11-現(xiàn)較好線性和相關(guān)性，故本方法檢測的靈敏度為200個拷貝。定性判定可認(rèn)為Ct值大于35為陰性，Ct值小于35為陽性。對6份10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(2×107~2×模板（Copies/well）Ct1Ct2Ct3Ct4Ct5Ct平均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)CV%2X1070.0510.30%2X10620.220.620.3720.3820.7120.450.2020.99%2X10523.923.423.4623.5623.4823.560.1980.84%2X10427.127.0927.0327.5327.170.2030.75%2X10330.1330.4130.7830.4830.0130.360.3041.00%2X10233.4233.633.7633.833.1533.550.2670.80%性期（1-56day）、無癥狀潛伏期和ARC期（56-690day）血應(yīng)用SIVqPCR檢測方法對SIV實驗感染猴感染急性期（1-56day）、無癥狀潛伏期和ARC期（56-690day）血漿中SIVRNA載量進行了連續(xù)采樣測定。結(jié)果顯示所建立的SIVRNA熒光定量PCR檢測系統(tǒng)最低檢測限度為5000DNA拷貝每107-102copies范圍之間，理論上其定量準(zhǔn)確性可以達(dá)到200個拷貝，但我們在對了定量檢測的靈敏度。這可能與我們的標(biāo)準(zhǔn)品是用質(zhì)粒來進行定量，忽略了反），感染急性期SIV感染猴的血漿病毒載量出現(xiàn)一過性上升；進入無癥狀潛伏7監(jiān)測結(jié)果比