微生物檢驗技術(shù)知識點

1微生物：是一群形體細小、給構(gòu)簡單、人肉眼看不見，必須借助于光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡放大兒

百倍、幾千倍甚至幾萬倍才能看到的生物。

2微生物的種類：原核細胞型：細菌、放線菌、螺旋體、立克次氏體、支原體、衣原體：

?真核細胞型：酵母菌、霉菌、微藻類等；

?非細胞型：病毒、亞病毒（類病毒、擬病毒、骯病毒）。

3病源微生物：感染人、動植物，導(dǎo)致疾病發(fā)生的有害微生物，稱之為病原微生物。

4、微生物對產(chǎn)品的污染：對產(chǎn)品造成污染的微生物來源：土壤、空氣、水、人和動植物、生產(chǎn)原料、

生產(chǎn)器械及包裝材料等

5微生物檢驗的意義：

1）是衡量動植物性產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一，也是判定被檢產(chǎn)品能否食用的科學(xué)依據(jù)之一。

2）通過微生物檢驗，可以判斷產(chǎn)品加工環(huán)境及產(chǎn)品衛(wèi)生環(huán)境，能夠?qū)Ξa(chǎn)品被微生物污染的程度作出正

確的評價，為各項衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)，提供傳染病和人類、動物和食物中毒的防治措施。

3）微生物檢驗是以貫徹“預(yù)防為主”的衛(wèi)生方針，可以有效地防止或者減少食物中毒、人畜共患病的

發(fā)生，保障人民的身體健康；同時，它對提高產(chǎn)品質(zhì)量，防止經(jīng)濟損失，保證出口等方面具有政治上和

經(jīng)濟上的重要意義。

6微生物檢驗的范圍與對象：

?微生物檢驗。范圍

：車間用水、空氣、地面、墻壁等。

2.各種產(chǎn)品的原、鋪料檢驗：包括食用動物、谷物、添加劑等一切原輔材料。

3.各類產(chǎn)品加工、儲藏、銷售諸環(huán)節(jié)的檢驗：包括食品從業(yè)人員的衛(wèi)生狀況檢驗、加工工具、運輸車輛、

包裝材料的檢驗等。

:重要的是對出廠產(chǎn)品、可疑產(chǎn)品及食物中有毒食品的檢驗.

微生物檢驗。對象7類

⑴食品（2）化裝品（3）藥品（4）一次性用品及其他生活用品（5）應(yīng)施檢疫的出口動物產(chǎn)品（6）

環(huán)境（7）有關(guān)國際條約或其他法律、法規(guī)規(guī)定的強制性衛(wèi)生檢驗的進出口商品

我國衛(wèi)生部公布的食品微生物指標有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項

大腸菌群是指示水質(zhì)受糞便污染的指示菌，細菌總數(shù)指示水體受污染物污染的情況。

微生物檢驗常規(guī)技術(shù)包括顯微技術(shù)，染色技術(shù)，火菌和消毒技術(shù)，培養(yǎng)基制備技術(shù)，接種，

別離純化和培養(yǎng)技術(shù)，無菌取樣技術(shù)，微生物的計數(shù)技術(shù)，菌種保藏技術(shù)，微生物常規(guī)鑒

定技術(shù)等

平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞,取一定

量的稀釋樣液涂在平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個

單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算

出樣品中的含菌數(shù)。

菌落形成單位cfu,colony-formingunit。

疏水網(wǎng)膜法（HGMF）：采用疏水網(wǎng)膜過濾樣品，將捕獲了被檢微生物的疏水網(wǎng)膜上傾入適

當?shù)沫傊?，?jīng)一定時間培養(yǎng)后即可計數(shù)

直接熒光過濾膜技術(shù)（DEFT）：將樣品經(jīng)特殊濾膜過濾后，經(jīng)口丫呢橙染色，利用紫外線顯微

鏡來快速測定活菌數(shù)。

葡萄糖昔酶熒光法：通過在培養(yǎng)基中參加指示劑、色素、熒光物質(zhì)，成為快速檢驗大腸菌

群的常用方法。

第二章

第一節(jié)微生物檢驗的根本程序

1檢驗前的準備2樣品的采集3樣品的送檢4樣品的處理方法

5致病菌檢驗參考菌群的選擇6樣品的檢驗7檢驗結(jié)果的報告

檢驗前的準備

1.準備好所需的各種儀器：如冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡等

2,按技術(shù)要求將各種玻璃儀器進行清洗、烘干、包扎、滅菌，冷卻后送無菌室備用。

3.準備好實驗所需的各種試劑、藥品，制備好普通營養(yǎng)瓊脂或其他選擇性培養(yǎng)基。根據(jù)需

要分裝試管或滅菌后傾注平板或保存在46℃的水浴中或保存在4c的冰箱中備用。

4.做好無菌室或超凈工作臺的滅菌工作，提前l(fā)h滅函30~60min。

5.檢驗人員的工作衣、鞋、帽、口罩等滅菌后備用。

6.工作人員進入無菌室后，實驗沒有完成之前不得隨便出入無菌室。

微生物實驗室檢驗。流程

無菌取樣一樣品均質(zhì)一樣液稀釋一樣品接種一恒溫培養(yǎng)一結(jié)果觀察

食品微生物檢測

r常規(guī)微生物檢測

微生物檢測《

〔致病微生物檢測

常規(guī)微生物工程：細菌總數(shù)、大腸菌群、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)，此類細菌不致病，但會嚴

重影響食品的外觀及風(fēng)味。日前常用微生物培養(yǎng)法來計數(shù)菌落，允許有該類菌落，但菌落

總數(shù)不能超標。

致病微生物工程：沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157：H7、彎曲桿

菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等。致病微生物在食品中是絕對不允許

存在的，所以快速檢測食品中是否存在有致病微生物，是食品平安檢驗的重中之重。

食品微生物檢驗。指標

我國衛(wèi)生部公布的食品微生物<>指標有菌落總數(shù)，大腸菌群和致病菌三項。

1.菌落總數(shù)：菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1g或1mL檢樣中

所含細菌菌落的總數(shù)。

2.大腸菌群：大腸菌群是寄居于人及溫血動物腸道內(nèi)的腸居菌，它隨著的大便排出體外。

食品中如果大腸菌群數(shù)越多，說明食品受糞便污染的程度越大。

3.致病菌：致病菌既能夠引起人們發(fā)病的細菌。對不同的食品和不同的場合，應(yīng)該選擇一

定的參考菌群進行檢驗。

4.霉菌及其毒素：我國還沒有制定出霉菌的具體指標，鑒于有很多霉菌能夠產(chǎn)生毒素，引

起疾病，故應(yīng)該對產(chǎn)毒霉菌進行檢驗。

5.其它指標：還應(yīng)包括病毒：肝炎病毒、豬瘟病毒、雞新城疫病毒、馬立克氏病毒、口蹄

疫病毒、狂犬病病毒、豬水泡病毒等；另外，從食品檢驗的角度考慮，寄生蟲也被很多學(xué)

者列為微生物檢驗的指標。

樣品的采集目的：

便于食品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督管理；鑒別食品中是否存在有毒有害物質(zhì)；

為新產(chǎn)品、新資源利用、新食品、新化工產(chǎn)品、新工藝在投產(chǎn)前進行衛(wèi)生鑒定。

采樣標簽的填寫

標簽內(nèi)容主要：編號、樣品名稱、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)日期、產(chǎn)品批號、產(chǎn)品數(shù)量、存放條件、

采樣時間、采樣人姓名，現(xiàn)場情況。

樣品采集的種類

1.大樣，指一整批；

2.中樣，是從樣品中各局部取得的混合樣品，一般為200g；

3.小樣，又稱檢樣，做分析用的，一般為25g

采樣的步驟：

采樣前調(diào)查一現(xiàn)場觀察一確定采樣方案f采樣一樣品封存一開具采樣證明

采樣的要求

1＞嚴格遵守樣品采集的操作規(guī)程。2、所采樣品必須具有代表性。

3、采樣操作要防止污染，防止變質(zhì)、損壞、喪失。

4、不得參加防腐劑、固定劑等。5、樣品采集和現(xiàn)場測定必須有二人以上參加。

檢驗樣品：

食品生產(chǎn)環(huán)境如水、空氣、土壤樣品；生產(chǎn)各工序樣品如設(shè)備、管道；

8類食品發(fā)生食物中毒時的樣品

微生物檢驗的取樣方案

1ICMSF取樣方案：2美國FDA的取樣方案；

3世界糧農(nóng)組織(FAO)取樣方案；4我國的食品取樣方案。

①ICMSF取樣方案

國際食品微生物標準委員會(簡稱ICMSF)的取樣方案是依據(jù)事先給食品進行的危害程度劃

分來確定的。將所有食品分成3種危害度：

I類危害：老人和嬰幼兒食品及在食用前可能會增加危害的食品；

II類危害：立即食用的食品，在食用前危害根本不變；

III類危害：食用前經(jīng)加熱處理，危害減小的食品。

將檢驗指標對食品衛(wèi)生的重要程度分成一般、中等和嚴重3檔。

根據(jù)以上危害度的分類，又將取樣方案分成二級法和三級法。

二級法：設(shè)定取樣數(shù)n,指標值m,超過指標值m的樣品數(shù)為C,只要C〉0,就判定整批產(chǎn)品不

合格。

三級法：設(shè)定取樣數(shù)n,指標值m,附加指標值M,介于m與M之間的樣品數(shù)C。只要有一個

樣品值超過M或C規(guī)定的數(shù)就判整批產(chǎn)品不合格。

②美國FDA的取樣方案

食品藥品管理局(FDA)的取樣方案與ICMSF的取樣方案根本一致，所不同的是嚴重指標所

取的15、30、60個樣可以分別混合，混合的樣品量最大不超過375go也就是說所取的樣

品每個為100g,從中取出25g,然后將15個25g混合成一個375g樣品，混勻后再取25g

作為試樣檢驗，剩余樣品妥善保存?zhèn)溆谩?/p>

食品微生物檢驗采樣方法：

按照上述采樣方案，能采取最小包裝的樣品就采取完整包裝，必須拆包裝取樣的應(yīng)按無菌操

作進行。

不同類型的食品應(yīng)采用不同的工具和方法：

1.液體樣品：充分混勻,以無菌操作開啟包裝，用100mL無菌注射器抽取，注

入無菌容器。

2半固體樣品：以無菌操作拆開包裝，用無菌勺子從幾個部位挖取樣品，放入無菌容器。

3.固體食品：大塊整體食品應(yīng)用無菌刀具和鏡子從不同部位割取,割取時應(yīng)兼顧外表與深部,

注意樣品的代表性；小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。假

設(shè)為檢驗食品的污染情況，可取表層樣品；假設(shè)為檢驗食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。

4.冷凍食品：大包裝小塊冷凍食晶按小塊個體采取;大塊冷凍食品可以用無菌刀從不同部位

削取樣品或用無菌小手鋸從凍塊上舉取樣品,也可以用無菌鉆頭鉆取碎屑狀樣品，放入容器。

同體食品和冷凍食品的取樣還應(yīng)注意檢驗?zāi)康?，假設(shè)需檢驗食品污染情況，可取表層樣品;假

設(shè)需檢驗其品質(zhì)情況，應(yīng)取深部樣品。

5.生產(chǎn)工序監(jiān)測

⑴車間用水。自來水樣從車間各水龍頭上采取冷卻水;湯料等從車間容器不同部位用100mL

無菌注射器抽取。

⑵車間臺面、用具及加工人員手的衛(wèi)生監(jiān)測。用5cm2孔無菌采樣板及5支無菌棉簽擦拭

25cm2面積。假設(shè)所采外表枯燥，那么用無菌稀釋液潤濕棉簽后擦拭;假設(shè)外表有水，那么用

干棉簽擦拭,擦拭后立即將棉簽頭用無菌剪刀剪入盛樣容器。

⑶車間空氣采樣。直接降塵法。將5個直徑90mm的普通營養(yǎng)瓊脂平板分別置于車間的四

角和中部，翻開平皿蓋5min,然后蓋蓋送檢。

樣品的送檢要求

1、采集好的樣品應(yīng)及時送到食品微生物檢驗室：要快速運送，不要超過3小時；易變質(zhì)的

樣品要冷藏，假設(shè)路途遙遠，無需冷凍樣品可保持在上5℃低溫下運送；需保持冷凍狀態(tài)

的樣品，可保存在泡沫塑料隔熱箱，維持0℃。

2、樣品送檢時；必須認真填寫送檢申請單，以供檢驗人員參考。

3、送檢過程：要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)。

4、檢驗人員接到送檢單后應(yīng)立即登記，填寫序號,并按檢驗要求，立即將樣品放入冰箱或冰

盒中,并積極準備條件進行檢驗。

5、食品微生物檢驗室必須備有專用冰箱存放樣品一般陽性樣品發(fā)出報告后3d（特殊情況可

適當延長）方能處理樣品;進口食品的陽性樣品，需保存6個月方能處理糊性樣品可及時處

理。

樣品的預(yù)處理方法

（一）液體樣品的處理

1瓶裝液體樣品的處理

用點燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，接著用石炭酸或來蘇爾消毒后的紗布蓋好，再用無菌

開瓶器將蓋啟開；含有二氧化碳的樣品可倒入500mL磨口瓶內(nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅

菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，取樣25mL檢驗。

2盒裝或軟塑料包裝樣品的處理

將其開口處用75%酒精棉擦拭消毒，用無菌剪子剪開包裝，覆蓋上滅菌紗布或浸有消

毒液的紗布在剪開局部，直接吸取樣品25mL,或傾入另一滅菌容器中再取樣25mL檢驗。

（二）固體樣品的處理

1.搗碎均質(zhì)法：將中樣（2100g）剪碎或攪拌混勻，從中取25g放入帶225mL稀釋液的

無菌均偵杯中，8000~10000i7min均質(zhì)l~2min即可。是對大局部食品樣品都適用的

方法。

2剪碎振搖法:將中樣（2l（）0g）剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣進一步剪碎，放入帶225mL

稀釋液和適量直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要

大于40cmo

3研磨法：將中樣（2100g）剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣放入無菌乳缽中充分研磨后，

再放入帶有225mL無菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。

4整粒振搖法：完整自然保護膜的顆粒狀樣品（如蒜瓣、青豆等）

直接稱取25g整粒樣品置于帶有225mL稀釋液和適量直徑5mm左右玻璃珠的無菌稀釋瓶

中,蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。

5胃蠕動均質(zhì)法：這是國外使用的一種新型的均質(zhì)樣品的方法。

將一定量的樣品和稀釋液放入無菌均質(zhì)袋中，開機均質(zhì)。均質(zhì)器有?個長方形金屬缸其旁安

有金屬葉板,可打擊均質(zhì)袋，金屬葉板由一恒速馬達帶動作前后移動而撞碎樣品

（三）冷凍樣品

冷凍樣品，先將中樣在0~4℃下解凍，時間不能超過18h,或在45℃下解凍，時間不能

超過15min。再取檢樣25g做稀釋處理。

菌落總數(shù)：

食品中含的細菌的多少，常以每克或與毫升

食品中或每平方厘米表面積含有的細菌個數(shù)

來表示O

菌落息數(shù)檢驗方法：平板培養(yǎng)計數(shù)法

在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在一定條件下

（需氧情況下，36±1℃,24-48h）培養(yǎng)長

出的菌落總數(shù)，以菌落形成單住表示，簡稱

cfu.并不能包括食品中全部活菌數(shù)。

因微生物的生活特性各異，不可能在一種培養(yǎng)條件下全部生長，故檢出的菌落數(shù)小于細菌

總數(shù)，但仍可評定食品的污染程度，是常用方法。

菌落總數(shù)的食品衛(wèi)生學(xué)意義：

作為食品被污染程度的指標，反映食品的新鮮程度；

預(yù)測食品的存放期限程度：食品生產(chǎn)過程中變質(zhì)與否、食品生產(chǎn)過程中食品的一般衛(wèi)生狀

況。

大腸菌群

大腸菌群為腸桿菌科內(nèi)一群需氧、兼，性厭氧

的革蘭氏陰，性無芽拊桿菌，肯它在35—37P

24h發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣^

包括犬胸式希氏菌屬、檸猱峻桿菌屬、克

雷伯氏菌屬、m溝腸桿菌屬。

大腸菌群多存在于人類經(jīng)?；顒拥膱鏊?/p>

糞便污染的地方?，F(xiàn)已成為許多國家對食品

和衛(wèi)生質(zhì)量鑒之妁孑旨才示。

食品中大腸菌群的數(shù)量測定：

一般采用100克或100毫升食品中的大腸菌群最可能數(shù)（MPN）來表示。

國標測定方法：乳糖九管發(fā)酵法。不僅說明樣品中有無糞便污染，另方面還可根據(jù)數(shù)量的

多少，判定樣品受污染的程度

致病菌檢驗參考菌群的選擇

蛋及蛋制品：沙門氏菌、葡萄球菌、變形桿菌等

水產(chǎn)品海產(chǎn)品：鏈球菌、副溶血性弧菌

乳制品：沙門氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌

畜禽肉類：腸道致病菌和致病性球菌

米面類：蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌、酵母霉菌等

罐頭：耐熱性芽胞桿菌、嗜熱脂肪桿菌、大芽胞桿菌、凝值芽胞桿菌

樣品的檢驗過程

（一）、收樣：

1、收到樣品后逐一核對驗收，登記編號。

如2004年收到的50號樣品，編號可寫成：20010050

2、立即將樣品放在冰箱或冰盒中，并積極做好準備工作。

（二）、檢驗

1、選擇檢驗方法

國內(nèi)：國家標準

國外：國際標準：如FAO標準、WHO標準；

每個進口國的標準：如美國FDA標準、日本厚生省標準、歐共體標準等

2、檢驗要求

(1)按照標準操作規(guī)程進行檢驗操作，邊工作邊做原始記錄。

(2)檢測結(jié)束，連同結(jié)果一起交同條線技術(shù)人員復(fù)核。復(fù)核過程中發(fā)現(xiàn)錯誤，復(fù)核人應(yīng)通

知檢測人更正，然后重新復(fù)核。

(3)檢測人和復(fù)核人在原始記錄上簽名，并編寫“檢測報告底稿〃。

(4)所有檢測工程完成后，檢測人員將原始記錄、樣品卡、報告書底稿交科主任作全面校

核。

3、樣品的保存

(1)陰性樣品：在發(fā)出報告可及時處理；

(2)陽性樣品：在發(fā)出報告以后3天才能處理樣品；

13)進口食品的陽性樣品：要保存6個月才能處理。

(4)微生物檢驗不進行復(fù)檢

4檢驗結(jié)果的報告

1.經(jīng)審核后的報告底稿、樣品卡、原始記錄，上交打印正式報告二份。

2.將報告正本交審核人及批準人簽名，并在報告書上蓋上“檢驗專用章〃CMA章和中

心公章后對外發(fā)文。

3.收文科室或收文人要在檢測申請書上收件人一欄內(nèi)簽字，以示收到該報告的正式文

本。

4.在報告正式文本發(fā)出前，任何有關(guān)檢測的數(shù)據(jù)、結(jié)果、原始記錄都不得外傳，否那

么作為違反保密制度論處。

第二節(jié)微生物檢驗的常用儀器

顯微鏡移液器、冰箱超凈工作臺、滅菌鍋離心機

水浴鍋、培養(yǎng)箱烘箱或枯燥箱勻質(zhì)器各種玻璃器材

?(一)普通顯微鏡的保養(yǎng)：

1、觀察完后，移去觀察的載玻片標本。

2、用過油浸鏡，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著擦鏡液擦拭2-3次，

最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。

3、轉(zhuǎn)動“物鏡轉(zhuǎn)換器〃，放在低倍鏡的位置。

4、將鏡身下降到最低位置，調(diào)節(jié)好鏡臺上標本移動器的位置，罩上防塵套

(二)培養(yǎng)箱

普通恒溫培養(yǎng)箱隔水式恒溫培養(yǎng)箱電熱恒溫培養(yǎng)箱

生化恒溫培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱

培養(yǎng)箱的配置和使用：

配置：22(°C)、30(℃)、37(℃)培養(yǎng)箱各一個

使用考前須知：

⑴箱內(nèi)不能放入過熱或過冷的物品，取放物品時應(yīng)快速進行并做到隨手關(guān)閉箱門。

⑵內(nèi)放一杯水，以保持濕度。

⑶培養(yǎng)物不能放在最底層，也不得放置過于擁擠。

(4)每月消毒一次，先用3%的來蘇爾液涂布消毒，再用清水擦凈。

⑸不得當烘箱使用。

(三)水浴鍋：水浴鍋內(nèi)應(yīng)注加蒸憎水而非自來水，使用時請注意水位

(四)勻質(zhì)器：無菌均質(zhì)器高速勻漿機

(五)超凈工作臺：側(cè)流式、直流式和外流式

超凈臺的使用和考前須知：

1使用前先翻開紫外燈照射，紫外線照射時間40?6()分鐘：

2、使用中，有機玻璃罩受到污染，嚴禁用酒精棉球擦拭，請用含水棉布榛拭；

3、請保持超凈臺整潔，不要堆積雜物；

4、使用完畢，勿忘關(guān)閉酒精燈；

5、請做好使用記錄。

6、如遇故障，除記錄在冊外，還應(yīng)及時與有關(guān)人員聯(lián)系，盡早排除故障。

7、學(xué)期開始做無菌試驗一次，以保證凈化臺正常使用。平時可根據(jù)情況，定期做無菌試驗，

以測定凈化臺是否符合無菌要求。

(六)離心機；普通離心機高速離心機超速離心機

轉(zhuǎn)子：許多離心機可以配用不同大小的離心管，只需要改變轉(zhuǎn)子或使用一個與不同的吊桶/

適配器相配的轉(zhuǎn)子。

1.水平轉(zhuǎn)子：盛樣品的離心管放在吊桶內(nèi)，以轉(zhuǎn)子的加速度運轉(zhuǎn)。水平轉(zhuǎn)子用于低速離心

機，其主要缺陷是延長了沉淀的路徑。同時，減速過程中產(chǎn)生的對流會引起沉淀物的重新

懸浮。

2.角式轉(zhuǎn)子：許多高速離心機及微量離心機安裝。由于沉降路徑短，沉淀顆粒時角式轉(zhuǎn)子

比水平轉(zhuǎn)子的效率更高。

3.垂直管轉(zhuǎn)子：用于高速及超高速離心機進行等密度梯度離心時。這種轉(zhuǎn)子在沉淀沒有形

成之前不能用來收集懸浮液中的顆粒。

(七)滅菌器：干熱滅菌器濕熱滅菌器

1、電烘箱(枯燥箱)

用途：用于玻璃器皿等耐熱物品的烤干和滅菌。

玻璃器皿等物的滅菌，溫度16()~165℃,滅菌2小時。

玻璃器材的干熱滅菌方法：

⑴將培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿洗凈枯燥后，用報紙包好，或裝入特制的鐵筒中。

⑵將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。

(3)關(guān)緊箱門，翻開排氣孔接上電源。

(4)待箱內(nèi)空氣排出到一定程度時，關(guān)閉上排氣孔，繼續(xù)加熱至一定溫度后，調(diào)節(jié)溫度控制

旋鈕固定溫度，在160℃—165c保持2小時即可。

(5)待自然降溫冷卻后(60C以下)才能開門取出玻璃器皿。

2、高壓滅菌鍋

用途：培養(yǎng)基、生理鹽水、廢棄物、采樣器、紗布、衣物的滅菌。

種類：手提式、立式、臥式殺菌鍋

3濾菌器

(A)普通冰箱冰柜

1、取用冰箱冰柜內(nèi)物品盡可能快，取完后及時將有用物品放回原處；

2、關(guān)冰柜門時應(yīng)輕輕合上，同時將門輕輕往外拉一下檢查是否關(guān)好；

3、冰柜內(nèi)的不要樣品應(yīng)及時清理

二、常用玻璃儀器及用具

(一)量器類

1、移液管1mL2mL5ml,10ml?25ml

2、容量瓶50ml,100ml,250ml,500ml,1000ml

3、量筒容量(ml)10、25、50、10、25、500、1000>2000

4、微量移液器

(二)其他常用玻璃器皿

1、培養(yǎng)皿.7cm,9cm,15cm2、試管

各種試管的使用：

13mmX100mm：生化反響及凝集反響

15mmX150mm：斜面培養(yǎng)

ISmmX180mm：檢樣稀釋

3、三角瓶50mL,150mL,200mL,250mL,500mL,IL,2L,3L

4、燒杯容量(mL)：25、50、100、150、250、500、1000、2000＞3000、5000

三、玻璃器皿的清洗和滅菌

(一)新購的玻璃器皿

1、先用熱肥層水刷洗，流水沖凈。

2、再浸泡于1~2%的鹽酸中數(shù)小時，最后用流水沖凈

(二)用過的玻璃器皿

1、含油脂器材的清洗：

(1)單獨高壓滅菌；(2)趁熱倒去污物；

13)倒放在鋪有吸水紙的籃子上，置100℃烘箱中烤0.5h;

(4)再用5%的碳酸氫鈉水煮兩次，再用肥皂水刷洗干凈。

2、含菌試管的清洗

高壓滅菌后，肥皂水刷洗干凈，烘干或晾干備用。

3、含菌平皿的滅菌

(1)底蓋分開放，放入桶中，高壓滅菌；

(2)趁熱倒去污物;

(3)肥皂水刷洗干凈，烘干或晾干備用。

4、含菌吸管的清洗

(1)把含菌吸管投入3%的來蘇爾液內(nèi)浸泡3()min以上殺菌；

(2)用肥皂水洗滌一次；

(3)最后用清水沖洗干凈即可。

5、載玻片及蓋玻片的清洗

(1)將載玻片及蓋玻片分別浸入5%的來蘇爾液內(nèi)浸泡過夜，取出水洗干凈；

(2)蓋片用軟布擦十即可;

(3)染色用的載玻片要放入肥皂水中煮沸l(wèi)Omin,再用肥皂水刷洗干凈，最后用95%的酒

精浸泡片刻，晾干備用。

(三)玻璃器材的滅菌

(1)清洗后烘干；

(2)加塞包扎;

(3)滅菌：干熱滅菌:160?165℃烘箱中烤2h濕熱滅菌:121℃20min

第三章細菌生化試驗和血清學(xué)試驗

第一節(jié)細菌常見的生化反響試驗

(一)什么是生化試驗？

＞指通過利用生物化學(xué)的方法來測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細

菌的類別、屬種的試驗。

＞生化試驗或稱生化反響：細菌的酶不完全相同，對營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力不一致，因

此其代謝產(chǎn)物各異。在培養(yǎng)基中參加可與被測終產(chǎn)物反響的指示劑，產(chǎn)生肉眼可見

的變化，如顏色的改變等，利用生化方法來鑒定細菌的試驗，統(tǒng)稱為細菌的生化試

驗或稱生化反響

(二)生化試驗的方法：

1在培養(yǎng)物中參加某種底物與指示劑，經(jīng)接種、培養(yǎng)后,觀察培養(yǎng)基的pH值變化。

2在培養(yǎng)物中參加試劑，觀察它們同細菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反響。

3根據(jù)酶作用的反響特性，測定酶的存在。

4根據(jù)細菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細菌的生長情況。

【三）生化試驗的考前須知

1.待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物，培養(yǎng)18?24h。

2.待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。

3.遵守觀察反響的時間。觀察結(jié)果的時間，多為24或48小時。

4.應(yīng)做必要的對照試驗。

5.提高陽性檢出率，至少挑取2-3待檢的疑似菌落分別進行試驗。

（四）檢驗細菌的生化試驗范圍

：1、糖（醉）類代謝試驗2、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗

3、有機酸鹽和鏤鹽的利用試驗4、呼吸酶類試驗5、毒性酶類試驗

二、糖醇類代謝試驗

［一）糖醇類發(fā)酵試驗

（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗

（三〕V-P試驗

［四）甲基紅（MethylRed）試驗MR

（五）七葉昔水解試驗（六）甘油品紅試驗

（一）糖醇類發(fā)酵試驗

1、原理：不同的細菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種

糖（醇），有的只能分解上2種糖（醇）,有的分解糖（醇）能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖（醇）只產(chǎn)酸

不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點，可鑒別細菌。

常用的糖醇

＞單糖：葡萄糖、廿露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖

＞雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖、蕈糖

＞三糖：棉子糖

＞多糖：菊糖、肝糖、淀粉

＞醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇

2試驗方法：用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于糖發(fā)酵管中，假設(shè)為半固體培養(yǎng)基,

那么用接種針作穿刺接種。置36±℃培養(yǎng)1?3天，每天觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察和記錄：

?產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以,，十"表示

.產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“〃表示

.不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以，，,表示

陽EO性⑦陽性+的性C\\__________

H培養(yǎng)某本變色、

天氣和產(chǎn)生

應(yīng)用：沙門氏菌可發(fā)酵葡萄糖但不發(fā)酵乳糖。大腸埃希菌可發(fā)酵葡萄糖及乳糖。

有些菌可發(fā)酵同一種糖類，其發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不盡相同。如大腸埃希菌和志賀菌均

可發(fā)酵葡萄糖，但前者產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而后者僅產(chǎn)酸，故可利用此試驗來鑒定細菌。

（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗

1、原理：

細菌對葡萄糖的分解，分為氧化型和發(fā)酵型。

氧化型細菌在有氧的條件下才能分解葡萄糖，無氧的條件下不能分解葡萄糖；

發(fā)酵型細菌在有氧無氧條件下均可分解葡萄糖；

不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。根據(jù)糖管的色澤變化可鑒別細菌。

2、方法；

取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在其中一管參加一層〔約1cm）

滅菌的液體石蠟以隔絕空氣，在37c培養(yǎng)2?4h天，每天觀察結(jié)果。

應(yīng)用：可用于鑒別腸桿菌科細菌（發(fā)酵型）與非發(fā)酵菌（氧化型或產(chǎn)堿型）。也可用于鑒定

葡萄球菌（發(fā)酵型）和微球菌（氧化型）。

3、結(jié)果觀察與記錄

封蠟管未封蟠管

產(chǎn)酸＜為色）產(chǎn)酸（黃色）

領(lǐng)化型不產(chǎn)假（穌色）產(chǎn)酸（黃色）

產(chǎn)堿型不產(chǎn)酸＜綠色,不產(chǎn)酸（綠色）

［三）V?P試驗

1、原理：某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫竣生成乙酰甲基甲醇，后

者在強堿環(huán)境卜，被空氣中的02氧化為二乙酰，在a-蔡酚和肌酸的催化作用卜，二乙酰

與培養(yǎng)基中的蛋白陳中精氨駿等所含的胭基生成紅色化合物，即V-P試驗陽性，稱V-P

（+）反響。

應(yīng)用：本試驗常與甲基紅試驗一起使用。二者結(jié)果通常相反。即如大腸埃氏菌、沙門菌、

志賀菌等甲基紅呈陽性反響，而VP反響那么為陰性。沙雷菌、陰溝腸桿菌等，VP反響為

陽性，而甲基紅反響為陰性。

2、試驗方法

（1）奧梅拉（O'Meara）法⑵貝立脫（Barritt）氏法（3）快速法

（1）奧梅拉法

＞將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)48h,每1mL培

養(yǎng)液加奧梅拉O^eara試劑，搖動試管1?2min,靜置于37c恒溫箱4h,或在

48?50℃水浴放置2h后判定結(jié)果。

（2）貝立脫法

＞將試驗菌接種于璘酸鹽葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)2天，每2mL培養(yǎng)

液先參加6%a-茶酚純酒精溶液1mL,再加40%氫氧化鉀水溶液，搖動2?5min,陽

性菌常立即呈現(xiàn)紅色，假設(shè)無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C培養(yǎng)4h,如顯現(xiàn)

紅色為陽性，呈黃色或有類似銅色者，可判定為陰性。

（3）快速法

＞將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中，挑取產(chǎn)酸反響的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種

環(huán)，乳化接種于其中，參加5%。?蔡酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放

置5min,判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用,

3、結(jié)果觀察與記錄

>（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，記V-P+

>（2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記V-P-

（四）甲基紅試驗（MR）

1、原理：細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后，由于代謝的途徑不同，有的細菌可使丙酮酸轉(zhuǎn)

化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使培養(yǎng)基pH值下降至以下，使甲基

紅指示劑變紅色，為甲基紅試驗陽性；有的細菌使丙酮酸脫竣后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，

培養(yǎng)液pH>,甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗班性。

2、試驗方法：挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基，于36

±1C或30℃（以30℃較好）培養(yǎng)3?5天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1mL,參加甲基

紅指示劑1?2滴，立即觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄

（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR+；

（2）呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-,迄至發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即

可判定結(jié)果。

應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌（陽性）和產(chǎn)氣腸桿菌（陰性）的鑒別。

?腸桿菌中許多細菌甲基紅試驗為陽性，如沙門菌、志賀菌、枸檄酸桿菌、變形桿菌

等為陽性，但腸桿菌屬和克雷伯菌屬為陰性。

（五）七葉昔水解試驗

1、原理：七葉苗被細菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結(jié)合，生成黑色化

合物，使培養(yǎng)基呈黑色，以此鑒別細菌。

2、試驗方法：將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉普培養(yǎng)基，于36±1C培養(yǎng)24h,觀察結(jié)

果。

3姑果河密與汨錄

'A（1）培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏?，為陽性，記錄?

>（2）培養(yǎng)基不變色者，為陰性，記錄為-

（六）甘油品紅試驗

1、原理：某些細菌可分解甘油成為丙酮酸，并進一步脫竣生成乙醛，乙醛與無色品紅生成

釀式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細菌。

2、試驗方法:取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于36±1°C培養(yǎng)

8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對照，觀察結(jié)果。

'A（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者，為陽性，記錄為+

>（2）與對照管顏色相同者，為陰性，記錄為-

三、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗

（一）靛基質(zhì)（咧咪）試驗

1、原理：某些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白陳中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（口引睬）?？谝?/p>

與對二甲氨基苯甲醛結(jié)合，可形成紅色化合物，即玫瑰呼I口朵，以此鑒別細菌。應(yīng)用：

主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。

2、試驗方法所用試劑：（1）柯凡克（Kovacs）試劑或（2）歐-波試劑

>將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)24?48h時后，參加柯凡克試劑數(shù)

滴，輕搖試管，呈紅色者為陽性。

>或沿試管壁緩慢參加歐一波試劑約覆蓋液面，兩液接觸處呈現(xiàn)玫瑰紅色者，為陽性反

響，無紅色者為陰性反響。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性反響，記+

＞無紅色者，為陰性反響，記?

（二）硫化氫（H2S）試驗

1、原理：某些細菌可分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸或含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛

鹽或鐵鹽可生成黑色沉淀物PbS或FeS,以此鑒別細菌

2、試驗方法：挑取待檢菌，用穿刺接種法接種于三糖鐵培養(yǎng)基上，于36±1℃培養(yǎng)24?48h,

觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄

＞培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記?

》培養(yǎng)基底部無黑色，為陰性，記-

應(yīng)用;用于腸道桿菌鑒定試驗，如：沙門氏菌屬、愛德華菌屬、枸檬酸桿菌屬及變形桿

菌等為陽性；腸道桿菌中其他菌屬為陰性，沙門菌屬中的甲型副傷寒沙門菌也為陰性。

（三）尿素酶試驗

1、7理：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解產(chǎn)生氨，氨使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中

的酚紅指示劑呈粉紅色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細菌。

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌尿素酶陽性,

雷氏普羅威登斯菌和摩氏摩根菌陽性，斯氏和產(chǎn)堿普羅威登斯菌陰性。

2、試驗方法：挑取大量培養(yǎng)18~24h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到

達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2、4和24h分別觀察一次結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽

性，顏色不變者為陰性。如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞培養(yǎng)基變呈粉紅色，為陽性，記+

＞培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記?

［四）氨基酸脫竣酶試驗

1、原理：某些細菌能產(chǎn)生氨基酸脫炭酶，可使賴氨酸、鳥氨酸生產(chǎn)脫竣作用，生成胺類物

質(zhì)和CO2o

胺類物質(zhì)使培養(yǎng)基呈堿性變紫色，為陽性，如呈黃色為陰性，以此鑒別細菌。

2、試驗方法：取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培養(yǎng)基內(nèi)和不含氨基酸的對照培養(yǎng)基內(nèi)，

在36±1°C培養(yǎng)1~4天，每天觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞試驗管呈紫色，對照管呈黃色，為陽性，記+

＞試驗管、對照管都呈黃色，為陰性，記-O

陽性反響試驗管顏色變化過程：紫色一黃色一紫色

原理：對照管呈黃色，說明有細菌生長。

在培養(yǎng)的早期（10~12h）,細菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)液pH下降，指示劑漠甲酚紫由紫色

變?yōu)辄S色，以后由于氨基酸脫竣生成胺，pH又上升至堿性，指示劑顯紫色。

應(yīng)用：沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門菌的鳥氨酸和賴氨酸脫竣酶試劑均為陽

性。志賀菌除宋氏和鮑氏志賀菌外其他志賀菌均陽性。故可作為腸桿菌科細菌鑒定的重要

方法。此外，對鏈球菌和弧菌科細菌的鑒定也有重要價值。

（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗

1、原理：某些細菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮

酸與氯化鐵作用生成綠色化合物，以此鑒別細菌。

2、試驗方法：從待檢菌瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸培養(yǎng)基上，在36±I℃

培養(yǎng)18?24h后，參加氯化鐵溶液4?5滴，轉(zhuǎn)動試管，使試劑與菌苔外表充分接觸，立即觀

察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄

＞試驗管立即出現(xiàn)綠色，為陽性，記+

＞無色為陰性，記-O

＞應(yīng)用：木試驗特異性較高，主要用于腸桿菌科細菌鑒定。變形桿菌屬、摩根菌屬和普羅

威登菌屬細菌均為強陽性，腸桿菌科中其他細菌均為陰性。

(六)明膠液化試驗

1、原理：有些細菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶)，能將明膠先水解為多肽，又進一步

將多肽水解為氨基酸，明膠失去凝膠性質(zhì)，使培養(yǎng)基由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。

2、試驗方法：

＞挑取培養(yǎng)18-24h的待試菌，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度。于20-22C

培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。

＞另取一支未接種的培養(yǎng)基一同培養(yǎng)作對照，每天取出兩支試管，放入冰箱放置

20?30min后，再觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄：

明膠液化，為陽性，+。

明膠凝固，為陰性，-

四、有機酸鹽和鍍鹽的利用試驗

碳源利用試驗：細菌對單一來源的碳源利用的鑒定試驗

(一)枸椽酸鹽利用試驗

1、原理：某些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解枸檬(檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；同時

分解培養(yǎng)基的鉉鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑浪麝香草酚藍由淡綠轉(zhuǎn)為深藍色,

為陽性。

2、試驗方法：挑取待檢菌，在西蒙枸椽酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集劃線接種，在36±1C培

養(yǎng)1?4天，每天觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{色或深藍色，為陽性，記+;

＞無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面仍為綠色者，為陰性，記-

應(yīng)用：枸撇酸鹽利用試驗用于腸桿菌科中各菌屬間的鑒別，在腸桿菌科中，埃希菌屬、志

賀菌屬、愛德華菌屬等為陰性，其他菌屬為陽性。

(二)丙二酸鹽利用試驗

1.原理：某些細菌可以利用培養(yǎng)基中的丙二酸鹽作為唯一碳源，丙二酸鹽被分解成碳酸鈉，使

培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,培養(yǎng)基由草綠色變成藍色，為陽性，以此鑒別細菌。

2、試驗方法：取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種于丙二酸鈉培養(yǎng)基上，于36±1°C培養(yǎng)48h,

觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞培養(yǎng)基由草綠色變成藍色,為陽性，記+

＞培養(yǎng)基無顏色變化,為陰性,記-

應(yīng)用：常用于腸桿菌科細菌鑒定，亞利桑那和克雷伯菌屬為陽性，枸檬酸桿菌屬、腸桿菌

屬和哈夫尼亞菌屬中有些菌種也呈陽性反響，其他各屬均為陰性。

Mimic試驗：咧跺⑴、甲基紅(M)、VP(Vi),枸椽酸鹽利用(C)四種試驗常用于鑒

定腸道桿菌，合稱為IMViC試驗。

I-弓啄(indol)試驗M-甲基紅(methylred)試驗

Vi-VP(Voges-Proskauer)試驗

C-枸檬酸鹽利用(citrateutilization)試驗

IMViC試驗

大腸埃希菌

產(chǎn)氣桿菌+

五、呼吸酶類試驗

（一）氧化酶試驗

I.原理：氧化酶使細胞色素C氧化后，氧化型細胞色素C再使鹽酸二甲基對苯二胺氧化，

便生成玫瑰紅色到暗紫色的幅類化合物，再和a-蔡酚結(jié)合，生成口引味酚藍,呈藍色反響，為陽

性。

試劑：1%a-蔡酚-乙醇液1%鹽酸二甲基對苯二胺

2、試驗方法:用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1?2滴在培養(yǎng)物上，再參加1%a

-蔡酚-乙醇液1~2滴；在3（）秒內(nèi)判定試驗結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄；

＞在30秒內(nèi)呈藍色反響,為陽性，記+

＞不變色或為紅色者,為陰性，記?

應(yīng)用：奈瑟菌屬的菌種均呈陽性反響。也用于區(qū)別假單胞菌與腸桿菌，腸桿菌科細菌為陰

性，假單胞菌為陽性。莫拉菌屬也為陽性。

＞本試驗中防止接觸含鐵物質(zhì)，否那么易出現(xiàn)假陽性，選銅綠假單胞菌為陽性對照，

大腸埃希菌為陰性對照。

（二）過氧化氫酶（觸酶）試驗

L原理：某些細菌可分泌過氧化氫酶，參加過氧化氫后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣,

產(chǎn)生氣泡，即為陽性反響。

2、試驗方法：挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（或試管），滴加3%過

氧化氫液數(shù)滴，或在瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記+

＞不產(chǎn)生氣泡者，為陰性，記?

應(yīng)用：絕大多數(shù)細菌均能產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌屬觸酶陰性，故常用此試驗來鑒別鏈

球菌。

應(yīng)注意本試驗不宜用血瓊脂平板上的菌落（易出現(xiàn)假陽性）。由于陳舊培養(yǎng)物可失去酶活性,

所以試驗應(yīng)取新鮮培養(yǎng)菌。用金黃色葡萄球菌作陽性對照，陰性對照用鏈球菌。

（三）硝酸鹽復(fù)原試驗

1、原理：某些細菌具有復(fù)原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，

亞硝酸鹽可生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮笨磺酸再與

。-蔡胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反響，為陽性反響

試劑：A、對氨基苯磺酸試劑B、Q.蔡胺試劑

2、試驗方法：取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在36土1℃培養(yǎng)1~4天,

每天取2mL培養(yǎng)液，參加A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，立即觀察結(jié)果。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+

＞假設(shè)無紅色出現(xiàn)，為陰性，記?

（四）氧化鉀試驗

1.原理：氨化鉀是細菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑，可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細菌的生

長，但有的細菌在一定濃度的氟化鉀存在時仍能生長，以此鑒別細菌.

2、試驗方法:取培養(yǎng)2（）?24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，接種至對照培養(yǎng)基及氧化鉀

培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡膠塞塞緊，36±1℃培養(yǎng)24?48h,觀察結(jié)果。

'＞對照B有菌?長，試驗管有菌生長為陽性，記+。

＞對照管有菌生長，試驗管無菌生長為陰性。記

六、毒性醐類試驗

(一)溶血試驗

1、原理：某些細菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解，不同的

細菌有不同的溶血反響，借此可鑒別細菌。

2試驗方法：平板法試管法

(1)平板法：

將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，36±1C培養(yǎng)24?48h,觀察結(jié)果。

溶血試驗的溶血類型及現(xiàn)象：

＞(1)a(甲型)溶血：菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。

＞(2)B(乙型)溶血：菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)。

＞(3)Y(-丙型)溶血：菌落周圍無溶血環(huán)。

(2)試管法：

將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在36±1℃培養(yǎng)16?18h,觀察結(jié)果。如

溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+;

＞無溶血現(xiàn)象，為陰性，記?

(-)鏈激酶試驗

1、原理：A群鏈球菌群能產(chǎn)生鏈激酶，該酶能使血液中的纖維蛋白酶原變成纖維蛋白酶，

而后溶解纖維蛋白，使血凝塊溶解，為陽性反響。

此試驗用于測定鏈球菌的致病性。陽性反響具有致病性。

2、試驗方法：

＞吸取草酸鉀血漿().2mL(O.()lg草酸鉀加5mL兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清

液)，參加0.8mL生理鹽水，混勻后，再參加待檢菌36C下培養(yǎng)18-24h肉湯培養(yǎng)物

0.5m和％氯化鈣0.25mL,混勻，放37℃水浴中，2min觀察一次。

＞待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時間。如2h內(nèi)不溶化，繼續(xù)放置24h后觀察。

同時用肉浸液肉湯做陰性對照，用的鏈激酶陽性的菌株做陽性對照。

3、結(jié)果觀察與記錄；

＞如凝塊全部溶化,為陽性+

＞凝塊24h仍不溶化，為陰性-

(三)卵磷脂酶試驗

1、原理：某些微生物能產(chǎn)生卵磷脂酶，在鈣離子存在時，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性

甘油酯和水溶性磷酸膽堿，在卵黃瓊脂平板上菌落周圍形成不透明的乳濁環(huán)或混濁白環(huán)，

或使血清、卵黃液變混濁，以此鑒別細菌。

2、試驗方法：

(1)卵黃平板法

A法：將待檢菌培養(yǎng)物劃線接種或點種于卵黃瓊脂平板上，36±1°C培養(yǎng)3?6h,觀

察結(jié)果。

B法：

先用卵黃磷脂酶抗血清將平板涂一半，置于36°C待干后，將待檢菌接種于未涂抗血清的

一半卵黃瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)劃已涂過抗血清的一半，36±1℃厭氧培養(yǎng)24?48h,觀察結(jié)

果。

0未涂抗血清的一半平板上，菌落周圍形成較大的不透明乳白色混濁區(qū)，在涂抗血清的一

半平板上，菌落周圍無不透明混濁區(qū)，為陽性。

兩邊均無不透明區(qū)，為陰性。

乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產(chǎn)生卵磷脂酶。

卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相應(yīng)抗血清所抑制，

（2）卵黃鹽水法：

＞將庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)物經(jīng)除菌過濾，收集濾液。在兩支滅菌試管內(nèi)，每管參加1%卵黃

鹽水0.4mL,在一管中參加濾液，另一管參加生理鹽水作對照。在36℃水浴中，經(jīng)

2h、4h、8h、24h觀察結(jié)果。

＞管底發(fā)生混濁沉淀，對照管無沉淀者，為陽性。

3、結(jié)果觀察與記錄：

＞菌落周圍形成較大的不透明區(qū)，為陽性。

＞兩邊均無不透明區(qū)，為陰性。

＞管底發(fā)生混濁沉淀，對照管無沉淀者，為陽性。

＞兩管無沉淀者，為陰性。

［四）血漿凝固酶試驗

1、原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，

附著在細菌的外表，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗

凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象，為陽性。

2、試驗方法

⑴玻片法：取清潔枯燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔（人）血漿,

挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min內(nèi),如血漿內(nèi)出現(xiàn)團塊或顆粒狀凝塊，而鹽水

滴仍呈均勻混濁，那么為陽性;如兩者呈均勻混濁，無凝固那么為陰性。

（2）試管法：取滅菌小試管3支，各參加血漿①一無菌水，1支參加被檢菌株的營養(yǎng)肉湯

培養(yǎng)液（或濃菌懸液）；其余2支作對照管，1支參加金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或

菌懸液作陽性對照;另1支參加營養(yǎng)肉湯或％氯化鈉溶作空白對照。將3管同時放37c溫箱

或水浴中培養(yǎng)，每（）.5h觀察一次，4h內(nèi)無凝固現(xiàn)象者，觀察直至24小時。

3、試管法的結(jié)果觀察與記錄：

＞空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固，試驗管血漿凝固者為陽性；

均無凝固那么為陰性。

七、三糖鐵（TSI）試驗

1、三糖鐵試驗的原理：

＞如果細菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基全部變黃；

＞如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少

量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使

斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色。

＞如果細菌又能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。

2、試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36

±1℃培養(yǎng)18?24h,觀察結(jié)果。

第二節(jié)細菌對抗菌藥物敏感性的檢驗

1、擴散法：

＞瓊脂加上細菌所需要的各種養(yǎng)料，將培養(yǎng)基融化后，倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻，凝

成一個平面或叫平板［平皿）。這時將含有少數(shù)細菌的菌液涂到平板上，培養(yǎng)后細菌就

會分別在平皿上繁殖，如果在平皿的培養(yǎng)基內(nèi)事先參加抗生素紙片，由于藥物在培

養(yǎng)基中擴散，起了抑［殺）菌作用，形成了不長菌落的抑制圈。

＞抑制圈的大小，反映某一抗生素對該菌抑菌的程度。

KB法：

最常用的藥敏試驗是WHO選薦的Kirby-Bauer紙片擴散法（K-B法）。

該法將藥敏試驗抑菌環(huán)大小分為四個等級，即：敏感、中度敏感、中介度、耐藥。

由于中介度介于敏感和耐藥之間，所以不予報告，故化驗單上只報告敏感、中度敏感或耐

【臨床意義】

1.敏感：表示被測菌株所引起的感染可以用常用劑量的該抗菌藥物治愈，禁忌癥除外。

2.中度敏感：表示被測菌株可以通過提高劑量被抑制或在藥物被生理性濃集的部位被抑制,

如B-內(nèi)酰胺類藥物。

3.中介度：這一范圍只是抑菌環(huán)直徑介于敏感和耐藥之間的“緩沖域”，以防止由微小的

技術(shù)因素失控所導(dǎo)致的較大的結(jié)果解釋錯誤。抑菌環(huán)落入中介度范圍，意義不明確，如果

沒有其他可替代的藥物，應(yīng)重復(fù)做藥敏試驗，或以稀釋法測定MIC。

4.耐藥：被測菌不能被常用劑量所到達組織內(nèi)或血液中的抗生素所抑制。

5.最低抑菌濃度：抑制被測菌的最低藥物濃度。

6.最低殺菌濃度：抗菌藥物殺滅細菌所需的最低濃度。

聯(lián)合藥敏試驗：

【臨床意義】常用于嚴重感染時對兩種或兩種以上抗生素的選擇。常用K-B法和方陣

棋盤稀釋法。結(jié)果以局部抑菌濃度FIC的指數(shù)報告。

＞1.FIC指數(shù)＜0.5,為協(xié)同作用。即兩種抗菌藥物聯(lián)合后的藥效大于同樣濃度的兩

種藥物抗菌作用的總和。

＞指數(shù)0.5?1,為相加作用，即兩種藥物聯(lián)合后其活性等于兩種藥物抗菌作用的總

和。

＞3.FIC指數(shù)1?2,為無關(guān)作用，即聯(lián)合藥物的活性與單獨的抗菌作用相同。

＞4.FIC指數(shù)＞2,為拮抗作用，即兩種藥物聯(lián)合后的抗菌活性小于單獨一種藥物的

抗菌作用。

K-B紙片瓊脂擴散法

(1)原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收

瓊脂中的水分溶解后不斷地向紙片周圍擴散，形成遞減的濃度梯度。

＞在紙片周圍可抑菌濃度范圍內(nèi)測定菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即

抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感性。

(2)制備抗菌藥物紙片

＞專用約敏紙片：用加樣或浸泡的方法使每片的約量到達一定的規(guī)定量，冷凍枯燥后

密封，-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)配制培養(yǎng)基

＞水解酪蛋白(Mueller-Hinton,MH)瓊脂是對生長較快的需氧和兼性厭氧菌進行藥

敏試驗的標準培養(yǎng)基,，瓊脂厚度為4mmo

＞對營養(yǎng)要求較高的細菌進行藥敏試驗時，應(yīng)在MH瓊脂中參加相應(yīng)的營養(yǎng)添加劑。

⑷細菌接種

＞接種物的準備可采用生長法或直接菌落懸液法。

＞為使藥敏試驗的接種濃度標準化,應(yīng)使用麥氏比濁標準的菌液濃度，制備好的菌液應(yīng)

在15min內(nèi)接種完畢。

＞置35℃孵育16-18h后讀取結(jié)果，厭氧菌應(yīng)孵育在含CO2的環(huán)境中，葡萄球菌和腸

球菌必須孵育24h,以檢測對苯理西林和萬古霉素的耐藥性。

(5)結(jié)果解釋和報告

＞用游標卡尺或直尺量取抑菌圈直徑，參照NCCLS標準判斷結(jié)果。常分為以下三級:

敏感、中度敏感、低度敏感

(6)紙片法藥敏結(jié)果的影響因素

＞培養(yǎng)基的質(zhì)量對結(jié)果的準確性有直接影響，如pH、硬度、濕度和深度等；

＞藥敏紙片的含藥量是影響抑菌圈大小的重要因素；

＞接種菌量正確與否是影響結(jié)果的重要因素之一；

＞試驗操作質(zhì)量：培養(yǎng)條件和溫度、時間；

＞抑菌圈測量工具的精確度；

＞質(zhì)控菌株本身的藥敏特性是否合格，有無變異。

(7)質(zhì)量控制

＞采用標準菌株是進行藥敏試驗質(zhì)量控制的主要措施。

＞常用的臨床藥敏質(zhì)控標準菌株有：金黃色葡萄球菌ATCC25923,大腸桿菌

ATCC25922,銅綠假單胞菌ATCC27853等。

2、稀釋法

⑴液體稀釋法

＞先將測試抗菌藥物作一系列倍比稀釋，然后各試管參加適當稀釋的試驗菌液，搖勻，

經(jīng)培養(yǎng)后觀察，以抗菌藥物最小抑菌濃度(MIC)管，即為試驗菌株的敏感度。

⑵瓊脂稀釋法：

＞將不高劑量的抗菌藥物，分別加于融化并冷至45℃的定量瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，

傾注成無菌平板，即為含有藥物濃度遞減的培養(yǎng)基；

＞接種測試菌于該培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后觀察，被檢菌生長情況，最低藥物抑制細菌生

長者，即最小抑菌濃度(MIC)。

3、自動分析法

＞國內(nèi)采用AUTOBAC儀器作細菌藥敏測定，儀器由測定環(huán)藥物紙片，培養(yǎng)振蕩機及

光度計主機等來檢定數(shù)據(jù)，按耐藥、中等耐藥、敏感，并把最小抑菌濃度都打印出

來。

＞該儀器僅適用于測定需氧菌及兼性厭氧菌，不適于專性厭氧菌及結(jié)核分枝桿菌的測

試。

第三節(jié)微生物培養(yǎng)及實驗根本操作技術(shù)

一、培養(yǎng)基配制

培養(yǎng)基是指人工配制的、適合于微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物所需的各種營養(yǎng)物的混合

基質(zhì)。

配制培養(yǎng)基是進行微生物檢驗工作的根底，甚至是任何與微生物有關(guān)工作的根底。

注意事項_火菌鍋的使用

①加水蓋過底部鐵板一②放入東西一③關(guān)門一④aej整溫度H寺ng一⑤關(guān)緊泄壓閥

滅菌結(jié)束彳發(fā)，等壓力降回零畤才可打^力

迤入滅菌鍋之物品，益子不可太累或太鬃

拿*戒菌彳發(fā)物品喜招已得帶耐熟手套

培養(yǎng)基中的主要成分及其作用：

營養(yǎng)物質(zhì)：N源、C源、無機鹽、生長因子、水

常用的N源：蛋白陳、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏

常用的C源：糖、醇類物質(zhì)(單糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖

雙糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖：多糖：淀粉、纖維素、菜糖；醇類：甘露醇、衛(wèi)茅除、甘油)

水：用蒸儲水，不能用自來水凝固劑：瓊脂、明膠、血清等

抑制劑：

1、作用：鑒定細菌、抑制雜菌的生長繁殖，增加待檢菌的檢出率

2、種類.

鹽類：氯化鈉、氯化鋰、氧化鉀、亞硫酸鉀(鈉)、亞硒酸鈉等

染色劑類：煌綠、薔薇酸、結(jié)晶紫、孔雀綠、孟加拉紅、玫瑰紅

膽鹽類：豬(牛、羊)膽鹽、混合膽鹽、三號膽鹽、去氧膽酸鹽、膽石酸鹽

抗菌素：者霉素、鏈霉素、桿菌肽、多粘菌素

指示劑

1、作用：用于指示鑒別細函可否利用分解糖醇類物質(zhì)和含氮化合物，產(chǎn)酸產(chǎn)堿的能力。

2、常用的指示劑：酚紅、嗅甲酚紫、中性紅、中國藍、甲基紅、復(fù)紅、伊紅、美藍、孔雀

綠等。

培養(yǎng)基的類型：

?根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：

1、液體培養(yǎng)基：主要用于增菌培養(yǎng)、鑒別性培養(yǎng)

2、固體培養(yǎng)基：用作微生物的別離、