《豬偽狂犬病毒 gE 蛋白間接磁微粒 CLIA 抗體檢測(cè)方法》

ICSXX.XXX

XXX

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

豬偽狂犬病毒gE蛋白間接磁微粒

CLIA抗體檢測(cè)方法

Indirectmagneticparticlebasedchemiluminescence

immunoassayfordetectingantibodiesagainst

PseudorabiesVirusgEGlycoprotein

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

20XX-XX-XX發(fā)布20XX-XX-XX實(shí)施

中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

T/CVMAXX-20XX

豬偽狂犬病毒gE蛋白間接磁微粒CLIA抗體檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體管式化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法的試劑、儀器設(shè)備、耗材、

操作步驟、結(jié)果判定。

本文件適用于定量檢測(cè)豬血清中偽狂犬病毒gE蛋白的特異性抗體，并且實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量、高敏

感性、高重復(fù)性檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

GB/19489樣品處理的生物安全措施、實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第302號(hào)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理規(guī)范

中華人民共和國主席令第五十六號(hào)《中華人民共和國生物安全法》

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T18641-2018偽狂犬病診斷方法

中華人民共和國國務(wù)院令第424號(hào)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件

CLIA:化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ChemiluminescenceImmunoassay）

1

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ELISA：酶聯(lián)免疫吸附（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）

5試劑

5.125×濃縮洗液洗液，按照附錄A.1配置

5.2樣本稀釋液，按照附錄A.2配置

5.3磁微粒工作液（偶聯(lián)豬偽狂犬病毒gE蛋白抗原的磁微粒懸浮液）

5.4稀釋液，同樣本稀釋液，按照附錄A.2配置

5.5酶標(biāo)抗體工作液（堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗豬IgG）

5.6豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作校準(zhǔn)品：包括工作校準(zhǔn)品1、工作校準(zhǔn)品2、工作校準(zhǔn)品3、工作

校準(zhǔn)品4、工作校準(zhǔn)品5、工作校準(zhǔn)品6，抗體含量分別為0U、10U、20U、40U、80U、320U，按照附

錄B制備

5.7豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體校準(zhǔn)品：包括產(chǎn)品校準(zhǔn)品1、產(chǎn)品校準(zhǔn)品2、抗體含量分別為20U、

80U，按照附錄C.1制備

5.8豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體質(zhì)控品：質(zhì)控品1抗體含量≤15U，質(zhì)控品2抗體含量范圍應(yīng)為40U～

65U，按照附錄C.2制備。

5.9化學(xué)發(fā)光底物。

6儀器設(shè)備及耗材

實(shí)驗(yàn)操作所需設(shè)備及耗材如下：

—全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀：磁微粒和酶促化學(xué)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備，LYC100、LYC200等。

—電子天平：最大稱量：Max=220g；最小稱量：Min=10mg；顯示分度值：d=0.1mg

—離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速：16000rpm。

—可調(diào)單道移液器（100μL、1mL）

—1.5mL尖底離心管

—反應(yīng)杯

—試劑船

7技術(shù)原理

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本方法使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，采用間接法原理，將豬偽狂犬病毒gE蛋白作為抗原偶聯(lián)于

3μm羧基磁微粒上，加入待檢血清進(jìn)行抗原抗體結(jié)合；再加入酶標(biāo)抗體進(jìn)行反應(yīng)；最后加入化學(xué)發(fā)光底

物，讀取發(fā)光值，待檢樣本抗體含量和發(fā)光值呈正相關(guān)。本方法通過檢測(cè)豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作

校準(zhǔn)品建立校準(zhǔn)曲線，并通過校準(zhǔn)曲線計(jì)算待檢樣本中豬偽狂犬病毒gE蛋白的抗體含量，判定陰陽性結(jié)

果。

8檢測(cè)前準(zhǔn)備

8.1樣品采集及保存

樣品采集按照NY/T541進(jìn)行。無菌注射器靜脈采血，不少于2mL，用自然析出法分離血清后，置于

無菌血清管中，按照GB/19489樣品處理的生物安全措施、實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求處理樣本，若在一

周內(nèi)檢測(cè)，可置2℃~8℃條件下保存，若超過一周檢測(cè)，應(yīng)置于-20℃以下冷凍保存。

血清樣本運(yùn)輸時(shí)應(yīng)注意2-8℃冷藏。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》、《中華人民共和

國生物安全法》進(jìn)行樣品的生物安全操作和標(biāo)識(shí)。

8.2樣品處理

取8.1中的樣品，8000r/min，離心2min，取上清放于1.5mL離心管中，體積應(yīng)大于300μL，待檢；

若樣品中存在沉淀或絮狀物等雜質(zhì)，應(yīng)離心去除雜質(zhì)，輕微操作，避免出現(xiàn)泡沫。

8.3溶液配制

洗滌液：將25×濃縮洗液用無離子水或蒸餾水1:25倍稀釋（如：25×濃縮洗液+水=100mL+2400mL），

裝入洗滌液桶。

無離子水或蒸餾水均應(yīng)符合GB/T6682的要求。

8.4儀器準(zhǔn)備

閱讀儀器說明書，放置反應(yīng)杯，掃碼放置底物、系統(tǒng)維護(hù)液，開始自檢。

8.5試劑準(zhǔn)備

將偶聯(lián)磁微粒工作液、酶標(biāo)抗體、稀釋液，分別裝入試劑船上對(duì)應(yīng)試劑瓶中，將磁微粒吹打混勻、

試劑船瓶蓋換為膠蓋；然后將試劑船裝入試劑倉中。

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9操作步驟

9.1校準(zhǔn)曲線擬合

將豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作校準(zhǔn)品1～工作校準(zhǔn)品6放入樣本架，按照9.4進(jìn)行樣品檢測(cè)，按9.5

制作校準(zhǔn)曲線并計(jì)算。校準(zhǔn)曲線見附錄D。

9.2校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)

將豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品1和產(chǎn)品校準(zhǔn)品2放入樣本架，按儀器說明書對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行

校準(zhǔn)。

以下情況需對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)，然后再進(jìn)行檢測(cè)：

a)試劑成分發(fā)生改變；

b)同一批次試劑盒使用周期超過28d；

c)根據(jù)具體需要：如質(zhì)控結(jié)果不符合要求。

9.3質(zhì)控

需要時(shí)檢測(cè)質(zhì)控血清，檢測(cè)值必須在參考范圍內(nèi)，方可繼續(xù)樣品檢測(cè)。

如下情況需檢測(cè)質(zhì)控血清：

a)試劑成分發(fā)生改變或校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)后后；

b)質(zhì)控樣品至少24h內(nèi)需檢測(cè)1次。

9.4樣品檢測(cè)

取待檢樣本于1.5mL/2mL離心管中（樣本量需300μL以上），置于專用樣品架，設(shè)置測(cè)試樣品信

息，進(jìn)行檢測(cè)。

整個(gè)檢測(cè)過程在LYC100T及LYC系列全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上全自動(dòng)進(jìn)行，具體檢測(cè)過程如

下：

a)免疫反應(yīng)：取20μL待測(cè)樣本，25μL磁微粒工作液、55μL稀釋液，分別加入反應(yīng)杯中，37℃孵

育10min；

b)清洗：使用磁鐵吸附磁微粒30s，使其聚集于管壁，棄去上清液。加入1×洗滌液300L懸浮磁微

粒，混勻30s后吸附磁微粒，棄去1×洗滌液。重復(fù)清洗4次。

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c)免疫反應(yīng)：取100μL酶標(biāo)二抗加入反應(yīng)杯中，37℃孵育10min；

d)同c)

e)檢測(cè)：加入化學(xué)發(fā)光底物溶液100L于清洗后的反應(yīng)杯中，混勻30s懸浮磁微粒，37℃反應(yīng)3分

鐘，檢測(cè)發(fā)光值（RLU）。

f)計(jì)算：將發(fā)光值（RLU）代入校準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中的抗體含量。

9.5計(jì)算結(jié)果

檢測(cè)完成后，以工作校準(zhǔn)品抗體含量（0U、10U、20U、40U、80U、320U）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)檢

測(cè)發(fā)光值為縱坐標(biāo)擬合四參數(shù)為校準(zhǔn)曲線，四參數(shù)模式為Y=(a-d)/[1+(x/c)*b]+d，當(dāng)R2高于0.99時(shí)，可用

于結(jié)果計(jì)算和判定。將待檢樣品檢測(cè)發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果即為待檢樣本中豬偽狂犬病毒gE蛋

白抗體含量。

10結(jié)果判定

10.1質(zhì)控血清參考范圍

質(zhì)控品1抗體含量≤15U，質(zhì)控品2抗體含量范圍應(yīng)為40U～65U，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。

10.2陰陽性判定依據(jù)

抗體含量≥35U時(shí)，判為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體陽性；＜35U判為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體陰

性。

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附錄A

(規(guī)范性)

試劑的配制

A.125×濃縮洗液，見表A1：

表A125×濃縮洗液配方

名稱稱量

丁二酸1.98g

六水丁二酸鈉62.16g

氯化鈉225.00g

吐溫-2013.75g

加滅菌蒸餾水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用無菌蒸餾水稀

釋25倍為1×洗液使用。

A.2稀釋液、樣本稀釋液，見表A2：

表A2稀釋液配方

名稱稱量

磷酸氫二鈉1.15g

氯化鈉8.00g

磷酸二氫鈉0.20g

吐溫-200.50mL

加滅菌蒸餾水至600mL溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存?zhèn)溆?。蒸餾水均應(yīng)符合GB/T6682

的要求。

A.3校準(zhǔn)品稀釋液

表A3校準(zhǔn)品稀釋液配方

名稱稱量

磷酸氫二鈉1.15g

氯化鈉8.00g

磷酸二氫鈉0.20g

牛血清白蛋白1.00g

海藻糖5.00g

吐溫-200.50mL

加滅菌蒸餾水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存?zhèn)溆?。蒸餾水均應(yīng)符合GB/T

6682的要求

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附錄B

(規(guī)范性)

豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作校準(zhǔn)品制備

B.1豬偽狂犬病毒gE蛋白高免血清制備

使用豬偽狂犬病毒gE蛋白（深圳重鏈生物科技有限公司）免疫4-6周齡豬偽狂犬病毒陰性豬，按

500ug/頭份劑量，頸部肌肉注射接種。在初次免疫后21天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，14天后檢測(cè)抗體水平，如達(dá)

不到要求，再進(jìn)行第三、第四次免疫。

抗體水平達(dá)到要求后，采集頸部靜脈血，用自然析出法，3000r/min離心10min，分離血清，然后用

0.22μm濾器過濾除菌，加入proclin300，使終濃度為0.05%（V/V），分裝，-20℃保存?zhèn)溆?，操作滿足

生物安全實(shí)驗(yàn)要求（GB/19489-2008）。

抗體水平合格標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)采集的血清樣品，用ELISA方法檢測(cè)抗體水平（GB/T18641-2018），以檢

測(cè)樣本為陽性的最大稀釋滴度判為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體水平。若抗體水平大于1∶4096，則為合格

的原始高免血清。

B.2豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作校準(zhǔn)品制備

用工作校準(zhǔn)品稀釋液梯度稀釋B.1所制備的高免血清，使用ELISA試劑盒檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果，

定義ELISA檢測(cè)陽性的最大稀釋滴度的稀釋血清抗體含量為10U，若此份血清為1:1024稀釋，則1:512

稀釋血清為20U；1:256稀釋血清為40U，依次類推。工作校準(zhǔn)品稀釋液定義為0U，最終選擇0U、

10U、20U、40U、80U、320U分別為工作校準(zhǔn)品1、工作校準(zhǔn)品2、工作校準(zhǔn)品3、工作校準(zhǔn)品4、

工作校準(zhǔn)品5、工作校準(zhǔn)品6，稀釋的工作校準(zhǔn)品–20℃保存?zhèn)溆茫?6個(gè)月內(nèi)有效。

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附錄C

(規(guī)范性)

豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品、質(zhì)控品

C.1豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品制備

取B.1所制備的豬偽狂犬病毒gE蛋白高免血清，用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至抗體含量為20U、80U，

分別為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品1、產(chǎn)品校準(zhǔn)品2。

C.2豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體質(zhì)控品制備

取B.1所制備的豬偽狂犬病毒gE蛋白高免血清，用工作校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至抗體含量為5U、50U，

分別為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體質(zhì)控品1、質(zhì)控品2，用豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體管式化學(xué)發(fā)光免疫

分析檢測(cè)方法檢測(cè)5次，計(jì)算平均值，質(zhì)控范圍為Mean±3SD。

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附錄D

(資料性)