遺傳實驗報告骨髓

實驗七小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備和觀察生64王攀2006030026同組實驗人：池月實驗日期：2008年11月3日實驗?zāi)康?、解利用動物骨髓進(jìn)行細(xì)胞染色體制片的一般方法，比較與其他制片方法的區(qū)別。2、正確掌握細(xì)胞收集、低滲、滴片等技術(shù)手段，觀察和了解小鼠染色體的數(shù)目及形態(tài)特征。實驗原理染色體的數(shù)目及形態(tài)特征在一個物種內(nèi)是相對穩(wěn)定的，染色體上的基因決定了一個物種生長發(fā)育的全部信息。因此通過染色體分析，可以了解某一物種最基本的遺傳指標(biāo)。進(jìn)行染色體標(biāo)本的制備一般取自細(xì)胞分裂旺盛的組織，如骨髓、淋巴細(xì)胞以及通過人工培養(yǎng)的懸浮液。動物的骨髓是重要的造血器官，它通過細(xì)胞分裂不斷補(bǔ)充體內(nèi)的需要，如將秋水仙素注射到動物的腹腔內(nèi)，經(jīng)腸系膜吸收并可轉(zhuǎn)運(yùn)到骨髓，結(jié)果使正在分裂的細(xì)胞不能形成紡錘體，使得染色體停在中期狀態(tài)，經(jīng)過處理和制片后就可以清楚地觀察到染色體。這種制片方法雖然也經(jīng)過許多步驟，但是效果非常好。而且省去了細(xì)胞培養(yǎng)的階段，可以獲得大量分裂細(xì)胞，但是屬于侵害性的，因此這種方法適用于動物來源豐富、動物個體較小的材料。實驗儀器、材料和用具實驗材料體重20克左右的小鼠一只儀器用具恒溫水浴槽、離心管2支、刀片、解剖盤、解剖剪、鑷子、離心機(jī)、光學(xué)顯微鏡、帶數(shù)碼相機(jī)的光學(xué)顯微鏡藥品試劑0.075mKCl低滲液、固定液（甲醇：醋酸＝3:1）、0.4%秋水仙素、改良苯酚品紅溶液實驗步驟ProceduresAttention腹腔注射秋水仙素溶液：在做實驗前2~3小時，對實驗用小鼠按0.1ml/20g小鼠的量對其進(jìn)行0.4％的秋水仙素注射。（此步由老師完成）取材：實驗時，用斷頸法迅速將小鼠處死，通過解剖取出股骨，用刀片將附著在股骨上的肉剝離干凈，剪開股骨頭，暴露骨髓腔。用注射器吸取低滲液1~2毫升，將針頭插入骨髓腔中沖洗骨髓，使沖洗液從股骨的另一端流出。收集沖洗液到5ml刻度的離心管中。低滲液需要在37℃下保溫。低滲：用吸管將沖洗液吹打幾次，然后把離心管放在37℃恒溫水浴槽內(nèi)低滲20分鐘。時間稍長比較合適。固定：之后取出并加1ml的固定液，吹打之后放入37℃恒溫水浴槽內(nèi)固定10分鐘。離心：然后將1000rpm離心10分鐘，棄去上清。再固定：加入固定液繼續(xù)固定10分鐘。先吹打，再放入恒溫水浴槽離心：再1000rpm的速度離心10分鐘。棄去上清。制備細(xì)胞懸液：離心結(jié)束后，棄去上清。小心操作，避免將沉淀懸起，最后留大約與沉淀等量的上清液，滴冰片：從冰箱里取出預(yù)冷的載玻片，根據(jù)細(xì)胞懸液體積的大小在鋪了報紙的地上將4張載玻片并排擺在一起，將細(xì)胞懸液吸入吸管內(nèi)，手持吸管在載玻片上方向下滴片。載玻片一定要是預(yù)冷過的；滴片的高度越高越好。干燥：讓其自然晾干。注意在干燥后用記號筆將滴有液體的部分標(biāo)記，可以在載玻片的背面標(biāo)記。染色：用改良苯酚品紅溶液染色15分鐘左右。去浮色：清水沖洗，風(fēng)干。注意洗玻片的時候不要將水直接沖到做過標(biāo)記的位置，而應(yīng)該是靠水流來洗。鏡檢：先用低倍鏡找到一好的分裂相區(qū)域，然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察。實驗結(jié)果（使用的5號機(jī)觀察）經(jīng)秋水仙素處理的小鼠（Musmusculus）骨髓細(xì)胞染色體照片：100×10（油鏡，數(shù)碼相機(jī)）在考試的十分鐘內(nèi)，就拍了這么一張，之前看到的比較好的都沒有找到。這里主要有個小插曲，我在自己的顯微鏡看好之后，就繼續(xù)找有沒有更好的，這時候老師就突然叫到我的名字（主要是我前面那位朋友突然要求先不考了，實在以外啊）。有點(diǎn)不知所措，但是還是決定去考。由于我的片其實本來做得不是很好，主要表現(xiàn)在視野中并沒有特別多的染色體，而且相當(dāng)一部分還沒有散開，所以到考試的時候，自己有點(diǎn)準(zhǔn)備不足，憑著印象看了一圈還是沒有找到，就拍了這個不太好的。我拍的這張只能說是染色體，但是由于沒有散開，所以數(shù)量是沒有法數(shù)了。我做的片子能夠數(shù)的其實很少，我看到過的最好的是能夠數(shù)的，但是就總體來講這個片子還是做得很不好的。對于其中最關(guān)鍵的三個步驟：低滲、預(yù)冷和滴片。前面兩個都是老師提前準(zhǔn)備好的，我們也是按照步驟來做，問題應(yīng)該不大，要說的話有一點(diǎn)，就是預(yù)冷的載玻片，我們是直接用手取的，后來想起來，手是有溫度的，應(yīng)該用鑷子效果更好，但是其實玻璃并不是熱的良導(dǎo)體，所以短時間應(yīng)該不會造成很大的影響；至于滴片的步驟，我們可是保證了相當(dāng)高的高度，唯一我覺得遺憾的是，我們之前沒有用水來試滴。結(jié)果由于離片太遠(yuǎn)，滴的時候不太好控制方向，最后雖然勉強(qiáng)滴到了板上，但是我認(rèn)為效果肯定是欠佳的，比如我們一共用了4張片，有一張是沒有滴到的，而且有幾滴是滴到了外面的，我們最后的液體本來就不多，這樣一來，也就只能勉強(qiáng)拿片子往下面做了。我們的片子中最后看來染色體的數(shù)量不是很多，這個可能就與取材、離心等步驟有關(guān)系了。比如取材，我們按照書上說的方法做的，但是這樣的效果好不好就不能評估了。在離心的步驟中，去掉上清液的過程也可能導(dǎo)致我們把細(xì)胞不小心去除了一部分，以至于最后的染色體數(shù)量不多。還有一種可能，就是我在去浮色的時候，不小心把水沖到了滴片的位置，這也可能是造成染色體數(shù)量少的原因。最后就是染色體分開的問題了，在我們做的片子里，有一部分是仍舊被細(xì)胞核包裹的染色體，這個應(yīng)該就是滴片的關(guān)系了，滴片給我的感覺是絕不僅僅是高度就完全決定的，應(yīng)該考慮包括角度在內(nèi)的其他因素吧，還有就是預(yù)冷的玻片取出來以后，一定要馬上就滴片，否則一旦恢復(fù)了溫度，那么效果肯定就不好了。實驗討論1、關(guān)于實驗處死動物的原則：在不影響動物實驗結(jié)果的前提下，使實驗動物短時間無痛苦地死亡。本實驗使用的是脊椎脫臼法：右手抓住鼠用力向后拉，同時左手拇指與食指用力向下按住鼠頭，將脊髓與腦髓拉斷，鼠便立即死亡。其優(yōu)點(diǎn)是比較易于掌握，而且大多數(shù)情況下要求不高，容易致死。不過我們在操作的時候，可能是心沒有足夠狠，小鼠并沒有立即死亡，后肢還會動，繼續(xù)重復(fù)剛才的操作，情況還是沒有很大的改變，反復(fù)幾次后小鼠終于死去。事實證明，力大并不是就好，比如我們旁邊的一組同學(xué)，就直接把小鼠拉成了兩半。2、低滲和高空滴片其共同目的都是使染色體能夠分散開。低滲液的作用是使細(xì)胞充分吸水膨脹而不破裂，從而一直保持在脹得很大而又沒有破裂的狀態(tài)。進(jìn)而使得細(xì)胞內(nèi)的中期染色體就能夠足夠分散開來，從而使得經(jīng)固定等步驟后仍然處于膨脹狀態(tài)。之后經(jīng)過滴片時的摔打和驟降溫過程，使細(xì)胞很快破碎，染色體進(jìn)一步分散開。在滴片的時候就能夠獲得一團(tuán)僅屬于一個細(xì)胞的分散的中期染色體的片子，易于在顯微鏡下觀察和對染色體進(jìn)行計數(shù)。而如果開始時就直接用蒸餾水使細(xì)胞破裂，這樣雖然染色體更分散，但是為數(shù)很少的染色體都分散到大量的溶液中去，視野里就沒幾條染色體了；就無法對染色體數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計。為了保持細(xì)胞的活性，所以需要對低滲液保溫。低滲時間上應(yīng)該也是長點(diǎn)較好，使細(xì)胞充分膨脹。老師說滴片是越高越好。為了保證滴片的成功，如果有條件的話，多拿幾塊載玻片排起來肯定滴到其中一塊上的概率會大一些。思考題1、找到一個分裂相好的區(qū)域，進(jìn)行顯微照相。前面已經(jīng)完成。2、統(tǒng)計小鼠2n染色體的數(shù)目，仔細(xì)觀察其形態(tài)特征。由前所述，照的這張片子染色體沒有分開，所以無法進(jìn)行有效計數(shù)。小鼠染色體的形態(tài)是兩個臂比較均勻，每一個臂都是較短且較粗，由一個著絲粒連接。3、低滲液起到什么作用，在使用的過程中應(yīng)該注意什么問題。低滲液的作用是使細(xì)胞充分吸水膨脹而不破裂，從而一直保持在脹得很大而又沒有破裂的狀態(tài)。進(jìn)而使得細(xì)胞內(nèi)的中期染色體就能夠足夠分散開來，從而使得經(jīng)固定等步驟后仍然處于膨脹狀態(tài)。之后經(jīng)過滴片時的摔打和驟降溫過程，使細(xì)胞很快破碎，染色體進(jìn)一步分散開。在滴片的時候就能夠獲得一團(tuán)僅屬于一個細(xì)胞的分散的中期染色體的片子，易于在顯微鏡下觀察和對染色體進(jìn)行計數(shù)。而如果開始時就直接用蒸餾水使細(xì)胞破裂，這樣雖然