動物細胞工程課件

緒論Chapter1INTRODUCTION第一節(jié)動物細胞工程的產(chǎn)生和發(fā)展細胞工程(cellengineering)是以生物細胞、組織或器官為研究對象，運用工程學(xué)原理，按照預(yù)定目標，改變生物性狀，生產(chǎn)生物產(chǎn)品，為人類生產(chǎn)或生活服務(wù)的科學(xué)。細胞工程與基因工程、酶工程、發(fā)酵工程和蛋白質(zhì)工程一起構(gòu)成了生物技術(shù)領(lǐng)域。生物技術(shù)的興起，不僅反映出生物學(xué)飛躍到一個與過去無法比擬的新水平，而且也反映出人類有效控制生物過程為人類造福的時代已經(jīng)開始。1859年，法國解剖學(xué)家Vulpian最早嘗試將蛙(Rana)胚尾部組織切下，放到普通水中“培養(yǎng)”，觀察到組織的生長和分化現(xiàn)象；1903年，Jolly用蓋片懸滴法將蠑螈(Ambystomamaculatum)白細胞培養(yǎng)了將近一個月。1906年，Beebe和Ewing用動物血清作培養(yǎng)基，將狗(Canisfamiliaris)淋巴肉瘤細胞培養(yǎng)2h，并觀察到細胞生長現(xiàn)象。

1907年，Harrison在無菌條件下，從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)，開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。探索期細胞培養(yǎng)技術(shù)方面：1923年，Carrel設(shè)計了卡氏培養(yǎng)瓶。Carrel把外科手術(shù)的無菌操作觀念帶到了細胞體外培養(yǎng)實驗中，在解決細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)和污染方面作出了貢獻。1953年，Gey等以人的腫瘤組織為材料成功地建立了HeLa細胞系。成熟期在細胞融合方面：

1954年，Enders等人觀察到麻疹病毒能使離體培養(yǎng)的宿主細胞產(chǎn)生多核體；1958年，Okada發(fā)現(xiàn)紫外線滅活的仙臺病毒可引起艾氏腹水瘤細胞彼此融合。1965年，Harris成功誘導(dǎo)了不同種動物體細胞的融合，并能存活下去。由于仙合病毒能夠穩(wěn)定地誘發(fā)細胞融合而引起了很多科學(xué)家的興趣。在克隆技術(shù)方面：1892年，Driesch把海膽(Strongylocentrotusperpuratus)2細胞胚胎通過劇烈振蕩分成2個細胞進行單獨培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)每一個分裂球都能夠發(fā)育成個體較小的完整幼蟲。1933年，Conklin以振蕩方法研究2細胞和4細胞期文昌魚胚胎分裂球的發(fā)育能力，發(fā)現(xiàn)沿第一次分裂面分開的左右兩部分能形成2個完整幼體。20世紀40~50年代，童第周等在魚類上進行了相似研究，獲得了孿生小魚。在多倍體誘導(dǎo)技術(shù)方面：1939年，F(xiàn)ankhauser和Griffiths在兩棲類中成功誘導(dǎo)出三倍體。1945年，Swardson采用低溫處理白鮭(Salmo)受精卵，獲得三倍體囊胚。真正誘導(dǎo)三倍體魚類成功的是Swarup，他用低溫處理三棘刺魚(Gasterosteusplatessa)獲得了三倍體，并飼養(yǎng)至性成熟。迅速發(fā)展期1975年，kohler和Milstein為了獲得單一抗體,利用仙臺病毒誘導(dǎo)小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合,從而建立了小鼠淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，篩選出既能持續(xù)分泌單克隆抗體、又能無限增殖的雜交瘤細胞。這一工作把細胞融合技術(shù)從實驗研究推廣到疾病的臨床診斷等應(yīng)用研究，使免疫學(xué)走向了新階段。從此，很多國家都開展了單克隆抗體的研究工作，使細胞工程逐漸茁壯成長起來。迅速發(fā)展期曹誼林教授在小鼠身上培育的人耳迅速發(fā)展期人工培養(yǎng)的肌肉迅速發(fā)展期波爾山羊的胚胎工程迅速發(fā)展期體細胞克隆羊——

多莉

迅速發(fā)展期轉(zhuǎn)基因魚迅速發(fā)展期轉(zhuǎn)基因克隆豬第一節(jié)動物細胞工程的產(chǎn)生和發(fā)展第二節(jié)動物細胞工程的主要技術(shù)領(lǐng)域本章講授提綱第三節(jié)國內(nèi)動物細胞工程的研究簡況第二節(jié)動物細胞工程的主要技術(shù)領(lǐng)域細胞培養(yǎng)細胞融合細胞拆合哺乳動物胚胎培養(yǎng)和胚胎移植轉(zhuǎn)基因技術(shù)哺乳動物克隆技術(shù)動物細胞工程的研究涉及了許多技術(shù)領(lǐng)域，概括起來主要包括以下幾個領(lǐng)域：組織工程一、細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)規(guī)?；囵B(yǎng)二、細胞融合雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體動物細胞融合和動物新品種培育三、細胞拆合物理法化學(xué)法四、哺乳動物胚胎培養(yǎng)和胚胎移植哺乳動物胚胎培養(yǎng)技術(shù)哺乳動物胚胎移植技術(shù)哺乳動物的無性繁殖技術(shù)哺乳動物嵌合體的制作技術(shù)胚胎干細胞的體外培養(yǎng)技術(shù)五、轉(zhuǎn)基因技術(shù)六、哺乳動物克隆技術(shù)哺乳動物胚胎分割技術(shù)哺乳動物胚胎細胞克隆技術(shù)哺乳動物體細胞克隆技術(shù)七、組織工程

組織工程是應(yīng)用工程技術(shù)和生命科學(xué)的原理和方法來解釋生理和病理狀態(tài)下哺乳動物的組織結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，研究生物替代物，以恢復(fù)、維持或改進組織功能的一門新興學(xué)科。Reddi于1994年最初提出

組織工程包括三個組成部分：一是提供細胞附著的細胞外間質(zhì)；二是提供細胞的應(yīng)答信號；三是觸發(fā)組織形成的調(diào)節(jié)信號。

具備上述三個條件，組織或細胞就可以在體外進行三維培養(yǎng)，形成所需要的組織、器官。第一節(jié)動物細胞工程的產(chǎn)生和發(fā)展第二節(jié)動物細胞工程的主要技術(shù)領(lǐng)域本章講授提綱第三節(jié)國內(nèi)動物細胞工程的研究簡況第三節(jié)國內(nèi)動物細胞工程的研究現(xiàn)狀1、單克隆抗體2、家畜胚胎移植3、核移植技術(shù)5、胚胎干細胞4、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)1、單克隆抗體近幾年來，淋巴細胞雜交瘤技術(shù)發(fā)展很快。至1985年底，已研制成功了抗胃癌、抗肺癌、抗乙型肝炎表面抗原、抗瘧疾、抗絲蟲等47類單克隆抗體。其中，抗乙型肝炎病毒單克隆抗體已投入了臨床應(yīng)用，創(chuàng)造了一定的經(jīng)濟效益。131I-Hab18肝單抗用于肝癌病人放免顯像診斷，顯像率達90.6%;腫瘤定位最小直徑為0.5cm，用于導(dǎo)向治療，療效為69％。馬傳染性貧血豬瘟雞新城疫草魚出血病等農(nóng)用單克隆抗體研究，已研究制成一大批單克隆抗體試劑盒：并應(yīng)用于動物疫病的快速診斷。在家畜胚胎移植技術(shù)方面，中國科學(xué)院遺傳研究所以及其它農(nóng)業(yè)科研機構(gòu)等單位已取得了一些成果。山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院在兔胚移植研究方面已初獲成功。西北農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生張涌（1987），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院朱裕鼎領(lǐng)導(dǎo)的課題組（1987年）利用胚胎切割技術(shù)繁殖半胚綿羊獲得成功。2、家畜胚胎移植我國利用移核技術(shù)培育新型魚已獲得實際應(yīng)用成果。3、核移植技術(shù)生長快、質(zhì)量好，增重速率比親本荷包紅鯉快20％，而且蛋白質(zhì)含量高，具有一定的經(jīng)濟效益。荷包紅鯉細胞核鯽魚細胞質(zhì)鯉鯽移核魚中科院發(fā)育所、水科院長江所和廣西水產(chǎn)所等單位：我國在魚類遠緣核移植技術(shù)方面達到了國際先進水平核移植此項研究成果已于1986年通過鑒定特別值得提及的是，中科院生殖生物學(xué)國家重點實驗室以陳大元為首的課題組，1999年將熊貓體細胞核植入家兔的去核卵中，移核卵在體外培養(yǎng)中發(fā)育到胚泡階段。熊貓屬食肉目動物，家兔屬兔形目，如此遠緣核質(zhì)雜交體能發(fā)育到囊胚，在世界上尚屬首例。此項研究成果被中國科學(xué)院院士評選為1999年中國十大科技成果之一。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)被應(yīng)用于動物育種，我國已獲得生長激素的轉(zhuǎn)基因豬200余頭，轉(zhuǎn)基因豬的生長水平高20%。上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所利用生物反應(yīng)器技術(shù)獲得40頭乳腺特異表達外源基因的轉(zhuǎn)基因羊，首批轉(zhuǎn)基因羊乳汁中分泌生長激素的含量已達400mg/L。中科院發(fā)育所和江蘇省生物工程重點實驗室已建成在乳腺中高效表達促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)轉(zhuǎn)基因山羊50頭。4、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)從20世紀80年代開始，一批學(xué)者又致力于胚胎干細胞(embryonicstemcell,EScell)的研究，中科院上海細胞所叢笑倩等以及中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院人類生殖工程研究室盧光琇等在這方面作了大量工作并已建立了自己的ES細胞系；中科院發(fā)育所鄭瑞珍以及北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院尚克剛等都在ES細胞的分離培養(yǎng)方面作出了杰出的貢獻。5、胚胎干細胞在動物細胞培養(yǎng)方面，我國的研究成果豐碩。建國以來，迄今已建立了100多個細胞株和系，為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供了大量的寶貴材料。從目前情況來看，我國在動物細胞工程研究領(lǐng)域已建成了許多基地，各種技術(shù)門類已初步建立，有些領(lǐng)域已經(jīng)跨入了國際先進行列。今后的主要任務(wù)是向研究的深度發(fā)展，把基礎(chǔ)研究搞上去，提高研究水平。

哺乳動物克隆技術(shù)隨著1997年2月Nature雜志報道英國Roslin研究所I.Wilmut等人創(chuàng)造的克隆羊多莉(Dolly)誕生，生物工程掀開了新的一頁?？寺?clone)一詞原意為無性繁殖系，在體外培養(yǎng)的細胞中早有使用，細胞克隆是指由一個細胞經(jīng)細胞分裂而產(chǎn)生出的一群細胞，而動物克隆是指由一個動物經(jīng)無性繁殖而產(chǎn)生的遺傳性狀完全相同的后代個體。卵細胞供體羊ScottishBlackfacesheepDollyDollyFinnDorset(FosterMother,寄母)核供體羊克隆羊“多莉”誕生后，克隆技術(shù)研究立即成為世界各國生物學(xué)家競相開展的生物學(xué)高新技術(shù)研究。克隆技術(shù)之所以一經(jīng)產(chǎn)生立即引起高度重視，是因為克隆技術(shù)不但具有重要的理論意義而且具有良好的應(yīng)用前景。第一節(jié)哺乳動物克隆的發(fā)展歷史講授提綱第七章哺乳動物克隆技術(shù)第二節(jié)哺乳動物克隆的技術(shù)方法第三節(jié)克隆動物的早衰問題第四節(jié)克隆動物的應(yīng)用前景第一節(jié)哺乳動物克隆的發(fā)展歷史同種胚胎細胞克隆同種體細胞克隆異種體細胞克隆克隆動物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)歷了60余年的漫長探索，根據(jù)供體細胞核與去核卵細胞的來源可歸納為3個標志性的發(fā)展階段。1938年，[德]科學(xué)家Hans

Spemann最早提出克隆設(shè)想。1952年，美國科學(xué)家Briggs和King將發(fā)育后期的青蛙胚胎細胞核植入青蛙卵中，沒有發(fā)育。1965年，中國實驗胚胎學(xué)家童第周完成了金魚核移植并獲得成功。1981年，Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎細胞第一次獲得了克隆小鼠，但其實驗未能被重復(fù)。第一個階段同種胚胎細胞克隆1984年，丹麥科學(xué)家Willadsen用胚胎細胞克隆羊獲得成功。1990年，中國科學(xué)院發(fā)育生物學(xué)研究所杜淼獲得了克隆兔。隨后，90年代，中國科學(xué)家利用胚胎細胞相繼克隆成了兔、羊、豬、牛、小鼠等幾種動物。1993年，美國的First用牛內(nèi)細胞團細胞成功地獲得了克隆牛。1997年，中國學(xué)者孟勵在美國成功獲得克隆猴。

至此，國內(nèi)外動物克隆采用的均為胚胎細胞。1997年，孟勵首次用胚胎細胞獲得的克隆猴。1997年，英國羅斯林研究所I.Wilmut等宣布用成年羊乳腺細胞首次獲得克隆羊。1998年，日本科學(xué)家Kato等用牛的輸卵管細胞得到克隆牛。第二個階段同種體細胞克隆1998年，美國夏威夷大學(xué)的Yanagimachi等用克隆鼠的卵丘細胞核作供體，獲得了克隆再克隆小鼠。至此，同種體細胞克隆進入成熟階段。1998年，新西蘭成功地克隆了奶牛，并克隆了世界上僅存的最后一頭珍稀牛。附：同種體細胞克隆研究現(xiàn)狀1999年10月和2000年5月，我國揚州大學(xué)與中科院發(fā)育所合作用攜帶外源基因的體細胞克隆出轉(zhuǎn)基因山羊。2000年6月，我國西北農(nóng)業(yè)大學(xué)用體細胞克隆出山羊。2000年9月，美國科學(xué)家采用原核互換的兩步核移植方法獲世界首例克隆豬。2001年1月，美國麻省ATC公司克隆出一只印度野牛。2002年初，世界上第一只克隆貓在美國誕生。2002年，世界上第一只克隆兔在法國誕生。2003年5月，世界上第一只克隆騾子在美國誕生。2003年8月，世界上第一只克隆馬在意大利誕生。2002年初，我國首批成年體細胞克隆牛群體誕生。2002年初，在美國誕生的世界上第一只克隆貓。2002年，在法國誕生的世界上第一只克隆兔。2003年5月，在美國誕生的世界上第一只克隆騾子。2003年8月，在意大利誕生的世界上第一只克隆馬。2002年初，在我國誕生的首批成年體細胞克隆牛。1998年～1999年，美國人White用珍稀動物盤羊的體細胞核與牛卵結(jié)合，韓國黃禹錫將白頭山老虎體細胞核與牛卵結(jié)合，我國學(xué)者陳大元將大熊貓體細胞核與兔卵結(jié)合，均成功克隆出早期胚胎。

2001年10月,意大利科學(xué)家報道異種克隆瀕危的歐洲盤羊獲得成功。第三個階段異種體細胞克隆第二節(jié)哺乳動物克隆的技術(shù)方法克隆動物主要方法：胚胎分割胚胎細胞核移植體細胞核移植連續(xù)細胞核移植優(yōu)質(zhì)動物體細胞的來源動物卵母細胞的成熟培養(yǎng)重構(gòu)胚胚胎移植克隆動物檢測體細胞核移植法克隆動物的大體操作流程卵母細胞核體細胞核核移植體外培養(yǎng)1、動物體細胞的體外培養(yǎng)G0期(細胞周期時相)常規(guī)體外培養(yǎng)降低血清使用量細胞分裂停止移核前卵丘—卵母細胞復(fù)合體(COC)用M199洗3次100μl成熟培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)液：

M199+10%FCS+10μg/mLPMSG+10μg/mLHCG5%CO2，38.5℃，飽和濕度24h或28～30h觀察卵丘擴展情況例:小牛卵母細胞的成熟培養(yǎng)養(yǎng)(IVM)2、卵母細胞的成熟培養(yǎng)盲吸法熒光法擠壓法吸引法蔗糖法3、去核方法帶下注射直接胞質(zhì)內(nèi)注射法4、核注射方法透明帶應(yīng)用piezo-pulse設(shè)備直接注射法常規(guī)法原核互換兩步法孤雌活化協(xié)同法誘導(dǎo)法5、核移植方法將數(shù)枚重構(gòu)胚放入100μL的胚胎培養(yǎng)液（CR1-aa）中培養(yǎng)48h后，選擇4細胞以上的胚胎移入鋪滿飼養(yǎng)層細胞

的培養(yǎng)液滴中。在120h半換液，148h加入1mg/mL的葡萄糖。以后每隔48h半換液。5、重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng)小鼠胎兒成纖維細胞6、胚胎移植方法假孕的同步發(fā)情的寄母輸卵管內(nèi)移植子宮角移植體細胞核卵母細胞重構(gòu)胚移入同步發(fā)情的動物輸卵管或子宮內(nèi)體體體細胞克隆動物研究路線圖圖圖體外培養(yǎng)去核胚胎移植移核7、克隆動物的檢測方法微衛(wèi)星圖譜法同工酶法克隆?！皠觿印钡奈⑿l(wèi)星檢測結(jié)果(紅色代表標準分子量，藍色和綠色代表擴增片段)受胎率低（26.2%）流產(chǎn)率高(53.8%)克隆動物的存活率低（35.7%)常出現(xiàn)早衰現(xiàn)象存在問題第三節(jié)克隆動物的衰老問題克隆羊“多莉”出現(xiàn)了早衰現(xiàn)象，其端粒長度比正常出生的羊短了20%，這與供核羊FinnDorset的6歲年齡直接相關(guān)。人類染色體端粒的熒光免疫原位雜交照片1999年，美籍華人楊向中教授第一個報道了克隆動物具有正常長度的端粒和遺傳年齡，得出克隆動物不會未老先衰、克隆動物的遺傳年齡與供體動物年齡無關(guān)的結(jié)論。此后，這一結(jié)論被美國麻省的ATC公司在克隆牛上和美國洛克菲勒大學(xué)在克隆鼠上得到證實?？傊?，由于細胞衰老的分子機理至今仍未能研究清楚，因此有關(guān)克隆動物的衰老問題，目前仍在爭論中，還需要進一步的研究來證實。端粒酶結(jié)構(gòu)的模式圖解第四節(jié)克隆動物的應(yīng)用前景克隆動物在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)方面具有極為重要的意義，這不僅表現(xiàn)在理論研究方面，更重要的是其在應(yīng)用開發(fā)方面的實用價值。1.克隆技術(shù)能快速培育出大量的優(yōu)良品種家畜，而用傳統(tǒng)的有性生殖方式培育動物良種不但需要花費很長的時間，而且優(yōu)良性狀難以在后代得到控制?？寺游镌谛竽翗I(yè)和醫(yī)學(xué)方面的意義體現(xiàn)在：2.克隆動物的遺傳背景完全一致，因而可以避免動物實驗的背景干擾，如用在藥物檢測上，所得結(jié)果將更加穩(wěn)定可靠。3.動物克隆技術(shù)可以用來保護瀕危動物，用瀕危動物的冷凍細胞隨時可以克隆出新的成體動物，而無須耗費大量的人力物力?？寺游锟蔀樾枰M織器官移植的病人提供所需要的組織器官。

國外已經(jīng)開始了這方面的研究，例如科羅拉多大學(xué)的研究者用來源于克隆牛胎兒的多巴胺生成細胞治療帕金森氏病模型大鼠，已取得一定效果。治療性克隆示意圖5、動物克隆技術(shù)如果與轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)結(jié)合起來將具有更大的發(fā)展?jié)摿?。轉(zhuǎn)基因動物克隆技術(shù)有性繁殖方式需要幾代才能獲得穩(wěn)定表達外源基因的轉(zhuǎn)基因動物，而通過轉(zhuǎn)基因克隆動物的方式，很快便可獲得新的轉(zhuǎn)基因動物，從而提高轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)效率。治療性克隆動物模型器官移植瀕危動物轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器基礎(chǔ)研究遺傳育種克隆

細胞拆合真核細胞是由細胞核和細胞質(zhì)兩大部分組成的，細胞的正常生命活動都是在這兩部分密切配合下進行的，兩部分間有一定的相互關(guān)系，為了探明這種相互關(guān)系的機理，學(xué)者們創(chuàng)建了細胞拆合技術(shù)。物理法化學(xué)法根據(jù)使用方法的不同，細胞拆合可以分為以下兩種類型：所謂細胞拆合，就是把核與質(zhì)分離開來，然后把不同來源的細胞質(zhì)和細胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細胞。第一節(jié)

物理法

最早使用的核質(zhì)分離技術(shù)是用機械的方法或短波光把細胞核去掉。例如用微玻璃針或微吸管將原生動物或魚類、兩棲類甚至哺乳動物的卵母細胞的細胞核去掉。還可使用紫外線或激光把細胞核破壞掉,形成去核的胞質(zhì)體，然后用微吸管吸入其它細胞核，組成新的雜交細胞，進行培養(yǎng)實驗。核移植操作示意圖核移植操作流程圖兩棲類的核移植第二節(jié)

化學(xué)法細胞松弛素B(cytochalasinB)有破壞微絲的作用。1967年Carter發(fā)現(xiàn)，細胞松弛素B能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠細胞排核。至20世紀70年代初，Prescott用細胞松弛素B處理哺乳類細胞，并結(jié)合離心技術(shù)，可將細胞分拆為核體(karyoplast)和胞質(zhì)體(cytoplast)兩部分。利用這種方法所得的胞質(zhì)體，純度可達90％以上，一次處理可獲得較大量的胞質(zhì)體。由于核體外表包有1層細胞膜和少量胞漿，因而也稱為小細胞(minicell)。在PEG或仙臺病毒的介導(dǎo)下，核體可同另一胞質(zhì)體融合，形成重組細胞(reconstitutedcell)。重組細胞亦能合成RNA和進行細胞分裂。為了把重組細胞與未去核的細胞區(qū)別開來，應(yīng)先進行標記。將準備制取核體的細胞，用3H-嘧啶核苷標記核；而準備制取胞質(zhì)體的細胞用小乳膠粒(Φ0.5μm)標記細胞質(zhì)(乳膠?？杀煌淌蛇M入細胞質(zhì))。真正融合的重組細胞，核為3H標記，細胞質(zhì)中含有乳膠粒。大體操作流程細胞（制取核體用）細胞（制取胞質(zhì)體用）3H-嘧啶核苷標記————小乳膠粒標記雜交細胞細胞松弛素B細胞松弛素B離心離心核體胞質(zhì)體融合細胞器的裝配

細胞器的拆合是離體的裝配過程。第三節(jié)

細胞拆合工程的內(nèi)容線粒體的裝配細胞膜的裝配細胞拆合工程包括3個方面的內(nèi)容：

細胞的裝配

利用顯微操作器進行細胞各部分的解剖，細胞各部分物質(zhì)的抽取和移植、注入各物質(zhì)、測量微電位的變化等。

細胞質(zhì)雜種細胞的研究胞質(zhì)雜種細胞是深入研究細胞質(zhì)作用的重要樣品，是不同種系之間的一種真正的新型細胞，在適宜條件下能成功地生存下去。在植物中已有煙草的細胞質(zhì)雜種個體。

1950年，美國科學(xué)家RobertBriggs和同事ThomasKing從豹蛙胚胎中取出一個細胞，用玻璃微針管取出其中的細胞核，再成功地將之注入到去核的卵細胞中。

兩年后，兩人完善了移植技術(shù)，在豹蛙的一系列實驗中40%的重組卵發(fā)育成胚胎、蝌蚪和幼蛙，這是人類第一次培養(yǎng)出的細胞核移植蛙，即克隆蛙。他們的研究結(jié)果發(fā)表在1952年3月出版的美國《國家科學(xué)院院刊》上。

童第周：《魚類細胞核移植》《鯉魚細胞核和鯽魚細胞質(zhì)配合而成的核質(zhì)雜種魚》

1981年，中國科學(xué)院水生生物研究所陳宏溪領(lǐng)導(dǎo)的研究小組把成年三倍體鯽魚的腎臟細胞核移植到二倍體鯽魚的去核卵子里獲得了三倍體的克隆魚并發(fā)育成成體，證明成年魚的體細胞也可以去分化和再程序化，具有發(fā)育成個體的全能性。研究論文發(fā)表在1986年的《水生學(xué)報》上，這是世界上第一次報道的體細胞克隆動物。1.1963年童第周等首先報道，在魚類中建立胚胎“細胞核移植”即“克隆”技術(shù)。2.1972年童第周等首先報道，在魚類中獲得了“核質(zhì)雜種克隆魚幼魚”。中國的克隆魚3.1980年童第周等首先報道，在魚類中獲得了“核質(zhì)雜種克隆魚”。草魚核—武昌魚去核卵獲得的“核質(zhì)雜種克隆魚”武昌魚第一代移核魚草魚第二代移核魚4、1982年，中科院海洋所吳尚勤等報道用金魚的紅血球核移到去核金魚卵內(nèi)獲得了克隆魚成體。（此實驗未重復(fù)）5、1986年，武漢中科院水生所陳宏溪等報道用培養(yǎng)的鯽魚腎細胞核移到鯽魚去核卵內(nèi)獲得了克隆魚成體。(此實驗未重復(fù))6、1996年，沙市中國水產(chǎn)科學(xué)院長江水產(chǎn)研究所余來寧等報道用培養(yǎng)的草魚肝細胞核移到草魚未去核卵內(nèi)獲得了克隆魚成體。（此實驗未重復(fù)）

這種去核和移核手術(shù)很精細，必須在顯微鏡下用顯微操縱儀進行操作，因而選用的材料有一定局限性，一些較小的體細胞，用這種移核方法很難奏效。細胞拆合技術(shù)在基礎(chǔ)研究方面是一種很有用的手段，利用這種手段證明了細胞核的核酸合成方式和基因表達受細胞質(zhì)物質(zhì)的影響。例如，不產(chǎn)生白蛋白的小鼠淋巴細胞同能分泌白蛋白的大鼠肝癌細胞融合所組成的雜交細胞，既能產(chǎn)生大鼠白蛋白，也能產(chǎn)生小鼠白蛋白。

細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)是動物細胞工程的一項基本技術(shù)，它是細胞融合、細胞拆合、細胞凋亡、染色體導(dǎo)入和基因轉(zhuǎn)移等項研究的技術(shù)基礎(chǔ)，同時體外培養(yǎng)細胞也是醫(yī)學(xué)研究尤其是腫瘤學(xué)研究的極其重要的材料。原代培養(yǎng)：由體內(nèi)直接取出組織或細胞進行培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點是：組織細胞剛脫離機體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。最常用的原代培養(yǎng)方法有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。

繼代培養(yǎng)（傳代培養(yǎng)）：將原代細胞分散后繼續(xù)在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。傳代代數(shù)細胞的世代（增殖代數(shù)）

區(qū)分:一、動物細胞原代培養(yǎng)的啟動三、培養(yǎng)動物細胞的同步化方法二、動物細胞系的建立技術(shù)講授提綱四、動物細胞的冷凍保存技術(shù)一、動物細胞原代培養(yǎng)的啟動建立一個體外研究體系和實驗平臺——用于理論及應(yīng)用研究（如育種等）;建立細胞系——用于功能產(chǎn)品的開發(fā)（如藥物、材料等）。目的：對動物細胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵主要集中在培養(yǎng)組織的選擇、培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、添加物（包括營養(yǎng)成分與生長因子等）的篩選，以及細胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)等幾個方面。（一）最適培養(yǎng)組織的篩選要想成功地進行動物細胞培養(yǎng)，作為組織來源的動物個體，一定要健康無毒。一般說來，作為組織來源的動物越年輕，其細胞相對就越幼稚，仍然保持有較強的分裂能力，細胞培養(yǎng)成功的可能性就越大。因此，動物的胚胎或幼體應(yīng)是起始細胞培養(yǎng)的最佳材料，故選擇細胞培養(yǎng)用組織的一般原則是盡可能選用胚胎組織或幼小個體的器官進行培養(yǎng)。（二）最佳培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化要想成功地進行動物細胞培養(yǎng)，除確定最佳組織來源外，首先必須確定細胞培養(yǎng)的最適營養(yǎng)液，主要包括培養(yǎng)基的成分、類型及所需補充的營養(yǎng)成分。1.基本培養(yǎng)基的選擇RPMI1640 MEM DMEM M199F-12 ACM L-15 GIMDM TC-100 ……常用的培養(yǎng)基：2.培養(yǎng)用血清的選擇胎牛血清(FBS)馬血清(HS)新生牛血清(NBS)小牛血清(BCS)無血清培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)中，為了模仿體內(nèi)環(huán)境條件，利于細胞代謝生長，細胞培養(yǎng)液中通常要加入5-15％的動物或人的血清，由于血清來源有限、價格高、且血清成分復(fù)雜難測，每一批血清的成分都有可能不同，這使大量細胞培養(yǎng)受到了限制，培養(yǎng)條件也難以保持完全一致。因此近年來又出現(xiàn)了一種新的細胞培養(yǎng)方法——無血清培養(yǎng)，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加各種促細胞生長因子、激素等，取代血清，以使培養(yǎng)基成分更加明確。3.其它補充營養(yǎng)成分的選擇除補充血清外，還要考慮添加一些其它的營養(yǎng)成分。這些營養(yǎng)成分包括碳水化合物、氨基酸、維生素和生長因子等。許多學(xué)者的研究表明，適量的葡萄糖、氨基酸、維生素C對動物細胞的培養(yǎng)也是必需的。在正常培養(yǎng)條件下，細胞的生長、增殖、分裂與代謝需要添加適量的生長因子。根據(jù)目前的研究結(jié)果，能促進動物細胞生長和分裂的有EGF、bFGF、TGF-

、IGF

、PDGF、NGF……

添加葡萄糖的培養(yǎng)液有助于細胞的貼壁和生長。1.培養(yǎng)液的pH值2.培養(yǎng)液的滲透壓3.培養(yǎng)溫度滲透壓 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 生長分裂pH值 代謝 細胞生長 分裂溫度 代謝 細胞生長 分裂（三）最佳培養(yǎng)條件的確立貼壁細胞所覆蓋的培養(yǎng)容器表面積的百分比與細胞外形是評價細胞培養(yǎng)成功與否的重要指標。

原代培養(yǎng)成功啟動后，細胞開始分裂并逐漸長成單層（Monolayer），此時便要準備傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時，要根據(jù)細胞的分裂速度和數(shù)量決定細胞的傳代瓶數(shù)（或1傳3，或1傳2，或2傳3

）和換液量（或全換液，或半換液）。一、動物細胞原代培養(yǎng)的啟動三、培養(yǎng)動物細胞的同步化方法二、動物細胞系的建立技術(shù)講授提綱四、動物細胞的冷凍保存技術(shù)二、動物細胞系的建立技術(shù)通過細胞培養(yǎng)，世界上已建立了大量細胞株或系，我國業(yè)已建立了上百個細胞系，為細胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)做出了重大貢獻。正常組織的初級培養(yǎng)物，在傳代培養(yǎng)過程中，細胞的壽命有一定的限度，只有癌細胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而成為具有癌性的細胞。建立細胞系的關(guān)鍵就是要千方百計地使培養(yǎng)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，即用某種因子刺激正常細胞發(fā)生突變而具有癌性。目前，使正常培養(yǎng)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的刺激因子主要有三大類：物理因子、化學(xué)因子和生物因子。（一）物理因子能使培養(yǎng)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的物理因子主要是指一些電離輻射：放射性同位素的射線：60Co、14C、131I、32P、3H……X-rayUVlight物理致癌劑（二）化學(xué)因子對細胞具有轉(zhuǎn)化作用的化學(xué)因子達數(shù)千種之多，其中有無機物，也有有機物。無機物：砷、石棉、鉻化合物、鎳化合物、鎘化合物……有機物：苯、聯(lián)苯胺、雜環(huán)烴、煤焦油、黃曲霉素(aflatoxin)、亞硝胺、煙堿(nicotine)……化學(xué)致癌劑（三）生物因子對細胞具有轉(zhuǎn)化作用的生物因子為腫瘤病毒(tumorvirus)，又稱致癌病毒(oncogenicvirus)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多種病毒可引起動物或植物發(fā)生腫瘤。腫瘤病毒中有DNA病毒，也有RNA病毒。Rous肉瘤病毒(Roussarcomavirus)：一種RNA病毒，其基因組中含有一個癌基因src，其編碼產(chǎn)物為具有蛋白質(zhì)激酶活性的pp60src蛋白，可使許多蛋白質(zhì)磷酸化，通過級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細胞癌變。pp60src蛋白是一種膜蛋白，結(jié)合在質(zhì)膜的內(nèi)表面，它可催化磷酸根轉(zhuǎn)移到一些蛋白質(zhì)的Tyr殘基上，使磷酸化Tyr在細胞中的含量提高了10倍。Rous肉瘤病毒(Roussarcomavirus)srcpp60src蛋白(Src蛋白,Tyr激酶)PTyr蛋白質(zhì)磷酸化細胞癌變無活性pp60srcRSV病毒中v-src基因的致癌機制圖解質(zhì)膜跨膜受體蛋白細胞外配體活性pp60src質(zhì)膜跨膜受體蛋白磷酸化Tyr有兩種作用：一是使細胞的正常調(diào)節(jié)機制失調(diào)，細胞增殖失去控制；二是使細胞的粘著性喪失，易于發(fā)生擴散和轉(zhuǎn)移。SV40（simianvacuolatingvirus40）細胞增殖被阻斷無活性細胞增殖因子(E2F)(基因調(diào)節(jié)蛋白)Rb蛋白(封閉細胞增殖因子)p53蛋白(關(guān)閉細胞增殖開關(guān))同抑癌基因產(chǎn)物-Rb蛋白和p53蛋白結(jié)合，使它們失活，從而使細胞發(fā)生癌變p53蛋白Rb蛋白活性細胞增殖因子基因轉(zhuǎn)錄T抗原(封閉Rb和p53蛋白)DNA病毒激活細胞增殖SV40病毒T抗原的致癌機理圖解——T抗原（T-antigen）：具有轉(zhuǎn)化作用SV40感染雖然動物細胞在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板中均可生長，但在體外利用培養(yǎng)罐進行大量培養(yǎng)就不象培養(yǎng)細菌和酵母那樣容易，是動物細胞培養(yǎng)的技術(shù)難題之一。目前這一問題已經(jīng)解決，人們在微生物培養(yǎng)用的發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上研制出一種用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的反應(yīng)罐，用以大量培養(yǎng)懸浮細胞（1個振動攪拌器：可以使細胞得到充足的營養(yǎng)和氧氣）。附：轉(zhuǎn)化動物細胞的規(guī)模化培養(yǎng)一、動物細胞原代培養(yǎng)的啟動三、培養(yǎng)動物細胞的同步化方法二、動物細胞系的建立技術(shù)講授提綱四、動物細胞的冷凍保存技術(shù)細胞分裂的同步化，對研究細胞周期和染色體標本制作等是非常有用的。只有使細胞周期同步化，獲得大量同周期階段的細胞，才有可能對一定周期階段的細胞進行狀態(tài)和生化分析。只有使細胞周期同步化，才能獲得大量同步分裂的細胞，如利用秋水仙素處理得到大量中期染色體，以便進行染色體組型、核酸原位雜交及FISH等研究。三、培養(yǎng)動物細胞的同步化方法細胞周期同步化的方法大致可分為3大類：一、分選二、化學(xué)同步化三、物理同步化這一類方法是把處于同一周期階段的細胞挑選出來，加以集中。最簡單的方法是用微吸管在顯微鏡下手工挑選中期細胞。如果用專門的電子裝置挑選，每秒鐘可挑出1000個細胞。但要快速取得大量同步細胞，則要使用其它方法如過濾、蔗糖梯度離心和膜淘洗等。一、分選1.過濾：將細胞培養(yǎng)物用多層濾膜過濾，小細胞首先通過，集中起來進行同步分裂。此法常用于微生物的分選。2.蔗糖梯度離心：混合細胞懸液經(jīng)密度梯度離心后，小細胞集中在蔗糖梯度的頂部，搜集起來便可進行同步培養(yǎng)。酵母和哺乳動物細胞培養(yǎng)物可用此法同步化分選。3.膜淘洗：把細胞培養(yǎng)物先結(jié)合到濾膜上，再用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)液連續(xù)緩慢流經(jīng)倒置濾膜，新形成的子細胞被沖洗下來，將在短時間內(nèi)沖洗下來的細胞集中則成為高度同步的細胞。如果濾膜夠大，即可得到大量同步化細胞。一種辦法是將培養(yǎng)液中減少某種細胞必需的營養(yǎng)成分，過一段時間后再把該成分加進去，以達到同步化的目的。二、化學(xué)同步化

另一種辦法是使用某種化學(xué)物質(zhì)將細胞暫時阻滯到有絲分裂的一定時期。大腸桿菌T-15秋水仙素、高壓氧化亞氮(nitrusoxide)、胸腺嘧啶核苷阻斷劑、長春花堿1.溫度——細胞同步化的有效手段由于分裂前細胞中的一些酶對溫度非常敏感，高溫可使分裂停止,而生物合成繼續(xù)進行，因此有些細胞發(fā)生分裂的時間推遲，其它后進的細胞便趁此趕上來，達到同步化狀態(tài)。

Zeutnen和Scherbaum(1954年)發(fā)現(xiàn)，將四膜蟲(Tetrahymena)在29.5℃(最適溫度)與34℃(抑制溫度)兩種溫度下每30min進行交替培養(yǎng)，經(jīng)7次循環(huán)之后，再于24℃下培養(yǎng)，結(jié)果有85%的細胞發(fā)生了同步分裂。三、物理同步化2.輻射——引起細胞同步分裂的方法之一

分裂前的細胞對射線很敏感，輻射可使細胞在分裂前積累,隨后去除輻射，細胞便在同一時間開始分裂。3.有絲分裂抖落法——哺乳動物細胞同步分裂的常用方法有絲分裂抖落法(mitoticshaking-off)的原理是，處于有絲分裂階段的細胞外形變圓，附著力降低，因此經(jīng)震抖后很易從附著的表面上脫落下來；而處于其它階段的細胞因呈伸展狀而附著力強，故不易被抖落，故通過震抖可將處于分裂期的細胞收集起來。細胞周期的同步化只是暫時性的，經(jīng)過幾代分裂之后，細胞群又會處于周期不同步狀態(tài)。一、動物細胞原代培養(yǎng)的啟動三、培養(yǎng)動物細胞的同步化方法二、動物細胞系的建立技術(shù)講授提綱四、動物細胞的冷凍保存技術(shù)四、動物細胞的冷凍保存技術(shù)由于生物細胞、組織器官甚至胚胎和個體在超低溫（-196℃）狀態(tài)下代謝完全停止，生命處于“靜止”狀態(tài)，故能得以長期保存。冷凍保存技術(shù)就是以此為理論基礎(chǔ)、以液氮為冷凍劑對生物材料進行長期保存的技術(shù)。冷凍保存對于動物種質(zhì)保存、遺傳多樣性保護以及動物育種研究等具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。（一）動物細胞的凍存技術(shù)冷凍保護劑及其濃度的選擇冷凍時細胞所處的生理狀態(tài)降溫速率冷凍保存溫度復(fù)蘇速率影響動物細胞冷凍保存效率的主要因子包括：冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，但對細胞一般均有毒性作用。1、冷凍保護劑的選擇冷凍保護劑按其能否滲透到細胞內(nèi)可分為兩種：滲透型冷凍保護劑非滲透型冷凍保護劑甘油、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇等常用的滲透型抗凍劑有：甘油、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等。滲透型冷凍保護劑：多屬于低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化了水的結(jié)晶過程，達到了保護細胞的目的。非滲透型抗凍劑：能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，即可在特定溫度下降低溶質(zhì)濃度，從而起到保護作用。常用的非滲透型抗凍劑有乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇等。最常用的冷凍保護劑為二甲基亞砜；有時也經(jīng)常使用乙二醇、甲醇、甘油、甲醛、蔗糖等。由于每個物種甚至同一個物種的不同發(fā)育階段其最適冷凍保護劑不盡相同，因此，在使用冷凍保護劑時，常常單獨選擇使用某一種冷凍保護劑或某幾種冷凍保護劑混合使用。如：鯉魚不同胚胎發(fā)育時期的最適冷凍保護劑不同：桑椹胚時，二甲基亞砜和蔗糖的冷凍保護效果較好；半原腸胚時，二甲基亞砜、蔗糖、甲醇的冷凍保護效果較好；而心跳期胚胎時，甲醇，甘油為較好的冷凍保護劑。再如：斑馬魚胚胎冷凍保存時的最適冷凍保護劑為溶解于0.1M蔗糖中的甲醇，而且甲醇濃度要隨溫度的變化而變化(0℃時1M；-5℃時2M；-10℃時3M；-15℃5M)。大多數(shù)凍存劑都具有一定的毒性，如果讓細胞暴露在過高濃度的凍存劑中，會影響細胞的存活。在選用凍存劑時要根據(jù)所用實驗材料、細胞時期、細胞活性狀態(tài)等具體對凍存劑及其使用濃度進行篩選和測試，才能達到最佳凍存效果。2、冷凍時細胞所處的生理狀態(tài)凍存時，細胞所處的生理狀態(tài)非常關(guān)鍵。如細胞活性非常旺盛，則容易凍存成功，且凍存細胞的存活率高；如細胞活性不旺盛，則不易凍存成功，且凍存細胞的存活率低。凍存時，多選用處于活躍分裂的對數(shù)期細胞進行凍存，以保證凍存成功和細胞的高存活率。3、降溫速率降溫速率也要根據(jù)所用實驗材料和具體細胞類型等來確定。一般采用的降溫程式：緩慢降溫(<1oC/min)降溫速率過快，在降溫過程中則會引起細胞內(nèi)形成冰晶，刺傷細胞結(jié)構(gòu)，引起細胞死亡。4、冷凍保存溫度液氮：-196oC干冰：-100oC超低溫冰箱：-86oC——原則上可永久保存——1年左右——半年左右（二）凍存細胞的復(fù)蘇技術(shù)復(fù)蘇的一般原則：盡可能快速復(fù)溫復(fù)蘇是指凍存細胞恢復(fù)至常溫后細胞仍然保持生物活性和正常的生物功能。細胞復(fù)蘇的成敗，關(guān)鍵在于復(fù)蘇速率！不同細胞的耐受溫度不同，不可機械制定復(fù)蘇溫度。如哺乳動物37oC，魚類30oC……

細胞融合細胞融合是指2個或2個以上的細胞融合成1個細胞的過程。人工的細胞融合開始于1950s，此后作為一門新興技術(shù)發(fā)展非?？?，應(yīng)用范圍也極為廣泛，不僅同種類細胞間可以融合，種間遠緣細胞也能融合。

細胞工程的發(fā)展是建立在細胞融合基礎(chǔ)上的。在2003年8月出版的《CellResearch》上，一篇論文介紹了上海第二醫(yī)科大學(xué)盛慧珍教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組的研究成果：“那不成人兔雜交了嗎？它是人？是兔？還是半人半兔？”——倫理上的普遍質(zhì)疑他們將一位5歲男孩、兩位成年男性的包皮細胞、一位60歲女性面部細胞的細胞核，放入去掉細胞核的新西蘭兔卵母細胞中，成功讓融合后的細胞發(fā)育到胚泡階段，從而得到胚胎干細胞。細胞融合不僅可用于生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，而且在生產(chǎn)實踐上還有重要的應(yīng)用價值，如目前在單克隆抗體的制備、核質(zhì)關(guān)系、體細胞的遺傳和發(fā)育、新品種的培養(yǎng)、免疫作用、疾病的治療和性狀的改良、潛伏病毒的研究等，已取得了顯著的成績。其中最突出的就是在制作單克隆抗體方面的應(yīng)用！第二節(jié)

雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第三節(jié)

細胞融合和動物新品種培育本章講授提綱第一節(jié)

細胞融合的技術(shù)方法第一節(jié)

細胞融合的技術(shù)方法細胞融合(Cellfusion)又稱為細胞雜交(Cellhybridization)，現(xiàn)多統(tǒng)稱為細胞雜交。同核體(homokaryon)：基因型相同的細胞融合成的雜交細胞異核體(heterokaryon)：來自不同基因型的雜交細胞根據(jù)所用促融劑的不同，細胞融合技術(shù)主要可分為四大類：病毒介導(dǎo)的細胞融合技術(shù)化學(xué)介導(dǎo)的細胞融合技術(shù)電擊介導(dǎo)的細胞融合技術(shù)激光介導(dǎo)的細胞融合技術(shù)一、病毒介導(dǎo)的細胞融合技術(shù)促融劑：麻疹病毒、副流感病毒、新城雞瘟病毒、仙臺病毒以及其他一些副粘液科的病毒大體原理：病毒被膜中的糖蛋白含有融合蛋白(fusionprotein),既可介導(dǎo)病毒同宿主細胞融合,又可誘導(dǎo)細胞與細胞融合。操作繁瑣；促融效果較好融合蛋白是副粘病毒的兩種包膜糖蛋白之一，其主要功能是引起病毒包膜與靶細胞膜或被感染的靶細胞膜之間發(fā)生融合。細胞融合過程需要另一種包膜糖蛋白――血凝素-神經(jīng)氨酸酶的協(xié)助。融合蛋白需要和同源性血凝素-神經(jīng)氨酸酶共同表達才能顯示出融合細胞的活性。病毒增殖紫外線滅活稀釋細胞懸液細胞融合誘導(dǎo)大體操作流程篩選二、化學(xué)介導(dǎo)的細胞融合技術(shù)聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)促融劑：大體原理：

一般認為，PEG改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜在修復(fù)時相互合并在一起,使兩細胞的胞質(zhì)溝通,從而造成相互接觸的細胞之間發(fā)生融合。操作簡便；促融效果好誘導(dǎo)大體操作流程A細胞融合細胞B細胞A/B細胞混合物按一定數(shù)量比例混合與細胞混合物充分混勻一定溫度、一定時間計數(shù)篩選PEG配制：加熱溶化，按體積比加入預(yù)熱至50oC的無血清培養(yǎng)基后混勻，降溫至使用溫度待用PEG配制PEG(MW1000-4000,40~60%)促融效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG分子量越大、濃度越高,對細胞的毒性也就越大（在實驗時常常采用的分子量1000~4000的PEG，濃度一般為40~60%）PEG介導(dǎo)細胞融合效果的影響因素：1.PEG分子量與濃度:融合效果與溫度成正比（質(zhì)膜流動性與溫度成正比），為獲得最佳融合效果,在細胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當提高處理的溫度（哺乳動物細胞，一般采用38~40℃）2.PEG的pH值:pH8.0~8.2：融合效果較好3.PEG作用時間:處理時間越長，融合效果越好,但對細胞的毒害也就越大（一般將處理時間限制在1min之內(nèi)）4.融合溫度:三、電擊介導(dǎo)的細胞融合技術(shù)操作簡便、快速/促融效果好/高回收率/對細胞毒性小原理：游離動物細胞或去壁原生質(zhì)體，在電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細胞被極化成偶極子，造成細胞間相互連接成點接觸狀態(tài)；然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細胞接觸點處的質(zhì)膜，此時質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時由于細胞表面的張力作用，兩個點接觸細胞逐步發(fā)生細胞融合。BioRad電融合儀動物細胞0.6M甘露醇，0.5mMCaC12·2H2080-300V/cm,0.5-1兆赫茲,30-90秒0.5-1.5KV/cm,幅度脈寬25微秒融合細胞誘導(dǎo)大體操作流程篩選電擊液懸浮于融合小室的電極間加入至細胞排列成串電泳效應(yīng)正弦交變電場施加2-3個脈沖電場施加操作例克隆羊的制做方法原理：貼在一起的兩個細胞，用高峰值功率密度激光對細胞接觸處的質(zhì)膜進行輻照，質(zhì)膜發(fā)生光擊穿，可產(chǎn)生微米量級的微孔，因質(zhì)膜上的微孔可逆，質(zhì)膜分子在重組過程中借助細胞連接處小孔的很高的表面曲率而處于高張力狀態(tài)，導(dǎo)致細胞發(fā)生融合。四、激光細胞融合技術(shù)激光細胞融合法與其它化學(xué)物理方法相比較具有許多優(yōu)點：（1）能選擇任意兩個細胞之間進行融合；（2）因僅在兩個細胞的接觸點照射激光，故作用于細胞的應(yīng)力和障礙小;（3）可進行非接觸、安全且遠距離的無菌操作；（4）能適時觀察融合過程。第二節(jié)

雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第三節(jié)

細胞融合和動物新品種培育本章講授提綱第一節(jié)

細胞融合的技術(shù)方法第二節(jié)

雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體1975年，英國科學(xué)家Milstein和Kohler開創(chuàng)了將產(chǎn)生抗體的單個細胞同瘤細胞融合的技術(shù)，解決了上述難題。兩位學(xué)者因此項發(fā)明而獲得了1984年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。

動物受到抗原刺激后可發(fā)生免疫反應(yīng)，由B淋巴細胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。一種抗原可具有不同的決定簇，故可為針對不同決定簇的多種抗體所識別。例如純系小鼠，每1種抗原即可為1000—8000種不同的抗體所識別。但在實際工作中只能測出5—6種。1個B淋巴細胞只能產(chǎn)生1種抗體。因此要想獲得大量純一的抗體，就必須使一個B淋巴細胞大量增殖。令人遺憾的是，1個B淋巴細胞在體外培養(yǎng)條件下不能無限大量增殖，因此，試圖通過培養(yǎng)1個B淋巴細胞增殖的方法，來制備針對某一特定抗原決定簇的大量單一抗體，是不可能的。而單一抗體無論在理論研究上還是在實驗應(yīng)用上都有重要的價值，因而制作大量的單一抗體是擺在學(xué)者面前有待解決的課題。瘤細胞在體外培養(yǎng)條件下可以無限傳代，是“永生”的細胞。為了大量制做純一的單克隆抗體，他們設(shè)計的方法是，把小鼠骨髓瘤細胞同經(jīng)綿羊紅細胞免疫過的小鼠脾細胞（B淋巴細胞）在PEG或病毒的介導(dǎo)下發(fā)生融合。融合的雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性：1)在體外培養(yǎng)條件下或移植到體內(nèi)可無限增殖，2)分泌抗綿羊紅細胞的抗體。Milestein和Kohler所創(chuàng)立的這種雜交瘤技術(shù)在免疫學(xué)上導(dǎo)致了一場“革命”！學(xué)者們紛紛利用這種技術(shù)來制造針對不同抗原的高度純一的單克隆抗體。大體操作流程目的抗原動物免疫B淋巴細胞細胞融合雜交瘤細胞的篩選分泌抗體的雜交瘤細胞的克隆化分泌抗體的雜交瘤細胞克隆雜交瘤細胞的大規(guī)模培養(yǎng)骨髓瘤細胞單克隆抗體抗體檢測二、雜交瘤技術(shù)的關(guān)鍵操作步驟1.動物免疫：目的：在細胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標抗原的特異性抗體的雜交瘤細胞.特定目標抗原動物免疫脾臟中B淋巴細胞B淋巴細胞大量增殖刺激能分泌針對于該抗原的特異性抗體常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法：皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑：“省時”“操作繁瑣”抗原用量少，免疫程序短，不加佐劑，所得單克隆抗體的特異性較高等免疫效果穩(wěn)定；抗原用量多，免疫程序長，需要添加佐劑，易形成優(yōu)勢克隆等常規(guī)免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑第2次免疫：抗原+福氏不完全佐劑第3次免疫：抗原第4次免疫：抗原(皮下注射或靜脈注射)(皮下注射)(皮下注射)(靜脈注射)抗體效價測定2、細胞融合及HAT篩選病毒介導(dǎo)的細胞融合PEG介導(dǎo)的細胞融合電擊介導(dǎo)的融合融合激光介導(dǎo)的細胞融合細胞融合方法：細胞懸液的制備與融合(1)脾細胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備

(2)骨髓瘤細胞懸液的制備：于對數(shù)生長期制備(3)細胞融合：

50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1minDNA的合成途徑DNA合成的主要途徑DNA合成的應(yīng)急途徑dUMP(orGln)dTMPDNA四氫葉酸二氫葉酸二氫葉酸還原酶氨基喋呤甲基化次黃嘌呤嘌呤核苷酸嘧啶核苷酸胸腺嘧啶HGPRT,hypoxanthine－guaninephosphoribosyltransferase，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶;TK,thymidinekinase，胸腺嘧啶核苷激酶TKHGPRTHAT培養(yǎng)基的篩選在HAT選擇培養(yǎng)液中含有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，當DNA主要合成途徑被氨基喋呤阻斷時，具有HGPRT酶和TK酶的細胞便可通過應(yīng)急途徑利用HAT培養(yǎng)液中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成DNA。未融合脾細胞未融合骨髓瘤細胞自身融合的脾細胞自身融合的骨髓瘤細胞雜交瘤細胞(脾細胞/骨髓瘤細胞)存活存活存活死亡死亡脾細胞——HGPRT+和TK+用來制備雜交瘤細胞的骨髓瘤細胞——HGPRT-和TK-短命融合后細胞混合液HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)2周正常培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基培養(yǎng)1周HAT培養(yǎng)基的篩選程序：雜交瘤細胞融合后的細胞混合液在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，只有雜交瘤細胞能存活下來所篩選出的雜交瘤細胞并非均分泌針對于目的抗原的抗體，還需要把含有分泌抗體雜交瘤細胞的培養(yǎng)孔挑選出來，因此需要進行抗體檢測。3、抗體檢測簡便、快速、敏感;在短時間內(nèi)能檢測大量樣品常用方法：酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)雙相擴散法要求抗原酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標儀檢測技術(shù)原理：4、克隆化在體外培養(yǎng)時分泌抗體的雜交瘤細胞的分裂速度要慢于不分泌抗體的雜交瘤細胞，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后很容易丟失，故需要及時地把分泌抗體的雜交瘤細胞挑選出來單獨培養(yǎng)。常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微挑揀法80個細胞/96孔飼養(yǎng)細胞(feedercells)ELISA法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。由單一克隆的雜交瘤細胞分泌的高度純一的抗體，只針對于一個抗原決定簇——單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體優(yōu)點：

高度純一高度專一5、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體的途徑常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法反應(yīng)器培養(yǎng)法培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動物免疫細胞融合混合細胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細胞骨髓瘤細胞X抗原B淋巴細胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細胞死亡無限生長細胞分泌X抗體只有雜交瘤細胞可長期存活下來BALB/c雜交瘤技術(shù)操作流程圖解應(yīng)用：疾病的診斷和治療(生物導(dǎo)彈)生物大分子的分類、鑒定、定位和分離純化細胞器的鑒定、定位和分離特定細胞或病毒的鑒定、定位和分離產(chǎn)生T淋巴細胞雜交瘤生產(chǎn)均一的淋巴因子研究生產(chǎn)其它細胞分泌產(chǎn)物單克隆抗體-藥物的結(jié)合物T細胞性的淋巴瘤或胸腺瘤同T淋巴細胞的融合第二節(jié)

雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第三節(jié)

細胞融合和動物新品種培育本章講授提綱第一節(jié)

細胞融合的技術(shù)方法第三節(jié)

細胞融合和動物新品種培育細胞融合技術(shù)是首先在動物細胞中實驗成功的，此后在動物細胞中最成功的應(yīng)用是單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，而動物細胞雜交技術(shù)則還主要應(yīng)用于核質(zhì)關(guān)系等理論研究和克隆動物的制作中。所謂動物細胞雜交，實際上也是以細胞融合為基礎(chǔ)的，即利用人工的方法把分離的不同品種或不同種的動物細胞誘導(dǎo)成融合細胞，然后再經(jīng)體外培養(yǎng)、分化、植回體內(nèi)等操作生產(chǎn)雜種動物的過程。獲得雜種動物的大體技術(shù)路線目標動物1目標動物2靶細胞靶細胞細胞融合雜交細胞的篩選體外培養(yǎng)囊胚植入養(yǎng)母體內(nèi)雜種篩選與鑒定動物幼體克隆牛的制做過程細胞融合去核盡管動物細胞融合技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但由于動物細胞核融合過程中雙親的染色體不親和性問題非常嚴重，兩種動物細胞融合后出現(xiàn)染色體的排斥與丟失現(xiàn)象十分普遍，且丟失幾乎是隨機性的，因此要篩選出理想的雜種動物非常困難。一般來說，兩種動物的親緣關(guān)系越遠，其染色體排斥和丟失現(xiàn)象就越嚴重。可見，要獲得理想的雜種動物，僅僅依靠兩種動物細胞的直接雜交是很困難的，這就需要在研究思路上加以開拓和創(chuàng)新。目前，在獲得理想雜種動物方面，主要創(chuàng)建了核移植與動物克隆等的技術(shù)和方法，而且已經(jīng)有了較多運用成功的例子，如克隆魚、克隆蛙、克隆羊、克隆豬、克隆猴、克隆牛等。克隆兔克隆貓克隆猴克隆豬創(chuàng)新應(yīng)用例多莉羊與寄母克隆馬克隆騾子體細胞克隆牛

轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是把已知基因轉(zhuǎn)移到真核細胞，并整合到基因組中得到穩(wěn)定表達的技術(shù)。是改變物種遺傳性狀的最根本途徑。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是1980s初興起的一項生物高技術(shù)，1980年，Gordon將克隆的外源基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，率先獲得了轉(zhuǎn)基因動物。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動、植物方面都有開展，而且正以強勁的勢頭在發(fā)展。通過人工操作的方式，將外源基因整合到動物的基因組內(nèi)，使該動物能穩(wěn)定地將此基因遺傳給后代的實驗技術(shù)就稱為轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)。

轉(zhuǎn)基因動物最早最成功的例子是“超級小鼠”（supermouse）的誕生。1982年底美國四個實驗室報導(dǎo)，將大白鼠生長激素的結(jié)構(gòu)基因GH與金屬硫蛋白基因MT-1的啟動子拼接在一起，組成雜交基因MGH。然后把克隆化MGH基因用顯微注射器注入到小鼠受精卵原核內(nèi)，將受精卵再移植到假孕母鼠體內(nèi)發(fā)育，結(jié)果得到了7只帶有MGH基因的小鼠，其中6只顯著大于同窩小鼠。這些小鼠生長快，74天時的體重即接近同窩正常小鼠的兩倍。有的超級小鼠血清中的生長激素（GH）水平竟達正常小鼠的100—800倍。這一成果的意義在于不僅為遺傳工程和遺傳疾病的研究提供了模型，而且也為加速經(jīng)濟動物的生長提供了新的技術(shù)途徑。一、轉(zhuǎn)基因動物的制作過程二、轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)方法三、轉(zhuǎn)基因動物的理論和實踐意義講授提綱轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是一項復(fù)雜而且涉及內(nèi)容廣泛的技術(shù)，其制作過程大致如下：1、目的基因的獲得、克隆與重組一、轉(zhuǎn)基因動物的制作過程2、目的基因的導(dǎo)入3、目的基因整合與表達的檢測利用限制性內(nèi)切酶獲取目的基因；利用mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA；人工體外合成DNA片斷；PCR法擴增特定基因片斷。1、目的基因的獲得、克隆與重組（1）目的基因的獲得：要把基因轉(zhuǎn)入宿主細胞，首先要把基因克隆化，然后，給目的基因接上適當?shù)膯幼舆M行重組，以使外源基因有效地整合和表達。目前已經(jīng)得到了若干真核細胞克隆化基因，如

-珠蛋白基因、TK基因等。（2）目的基因的克隆與重組：即基因轉(zhuǎn)移，利用顯微操作或其它方法把外源基因注入到動物早期胚胎中，再把胚胎植入到動物子宮內(nèi)，發(fā)育成的個體不僅能表達注入基因決定的性狀，而且能把該基因傳到第二代。2、外源基因的導(dǎo)入轉(zhuǎn)入的基因一般是隨機整合到宿主動物基因組，但并非所有的外源基因都能整合到動物基因組，而整合的基因也并非都能表達。通過顯微注射將外源基因?qū)牒?，大部分基因在細胞?jīng)過幾次分裂后就丟失，只有一少部分DNA得以整合。3、外源基因整合與表達的檢測因此，需要對轉(zhuǎn)基因動物進行嚴格的篩選！目前常用的檢測手段是利用PCR方法結(jié)合Southernblot雜交法來檢測外源基因是否整和并表達。只有外源基因整和并表達的動物才是真正的轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因小鼠的制做過程圖解在轉(zhuǎn)基因動物制作中，基因轉(zhuǎn)移是影響外源基因整合效率的十分關(guān)鍵的一個步驟，也是技術(shù)難度最大的一個步驟，基因轉(zhuǎn)移需要熟練的操作技術(shù)和技巧。原核顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎法胚胎干細胞法精子載體法二、轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)方法目前，動物轉(zhuǎn)基因的方法已發(fā)展成許多種，其中主要方法如下：顯微注射法是通過顯微操作儀將外源基因直接注射到受精卵的原核中，該法是產(chǎn)生最早且又最為有效的轉(zhuǎn)基因方法，目前使用非常廣泛。但原核顯微注射法技術(shù)難度比較大，不僅需要昂貴的儀器，而且需要一定的操作技巧。1、原核顯微注射法基因原核注入顯微圖像將外源基因重組到DNA病毒或RNA病毒上，再用重組的DNA病毒或RNA病毒去感染著床前后的胚胎，隨著病毒基因插入到宿主胚胎基因組中，外源基因也自然整合到胚胎基因組中。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎法是近年來興起的基因轉(zhuǎn)移方法，操作相對簡單而且感染后基因的整合效率高。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎法利用ES細胞被注射到宿主囊胚中可參與胚胎發(fā)育形成嵌和體胚胎的特點，首先將外源基因?qū)隕S細胞，再將ES細胞注射到宿主囊胚中，參與宿主發(fā)育形成轉(zhuǎn)基因動物。由于目前ES細胞的研究只有小鼠比較成功，所以用ES細胞途徑制作的轉(zhuǎn)基因小鼠比較多，而其它如牛羊等大型動物ES細胞研究尚未成熟，無法應(yīng)用ES細胞途徑進行轉(zhuǎn)基因動物制作。3、胚胎干細胞法將成熟的精子與外源DNA進行預(yù)培養(yǎng)之后，使精子有能力攜帶外源基因進入卵子，從而使外源基因整合于宿主基因組中。這種方法具有簡單有效的特點。4、精子載體法基因轉(zhuǎn)移除了上述方法以外，又發(fā)展起來一些新的方法，如人工酵母染色體(yeastartificialchromosome,YAC)法、電脈沖法等。YAC法是以YAC作為載體進行基因轉(zhuǎn)移，其優(yōu)點是可以用YAC攜帶大片段的基因(30～150萬bp)。電脈沖法主要用于魚類轉(zhuǎn)基因研究，因為有些魚類的卵殼較硬，而且看不清受精卵原核，所以用顯微注射法進行轉(zhuǎn)基因比較困難，而將魚的受精卵放入外源基因溶液內(nèi)，并施以一定的電脈沖，就可得到一定整合率的轉(zhuǎn)基因魚。受精卵4-cell囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動物胚胎干細胞DNA精子DNA顯微注射顯微注射DNA轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)移反轉(zhuǎn)錄病毒感染反轉(zhuǎn)錄病毒感染電脈沖法YAC法DNADNA卵子精子載體法幾種轉(zhuǎn)基因方法及其與受精卵不同發(fā)育階段的關(guān)系三、轉(zhuǎn)基因動物的理論和實踐意義自從轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)出現(xiàn)以來，各國政府紛紛投資開展這項工作，現(xiàn)已建立了轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠，轉(zhuǎn)基因兔、豬、牛、羊等。這不僅因為轉(zhuǎn)基因動物具有重要的理論意義，而且還具有實用價值，能夠創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益?；虮磉_與調(diào)控的研究改造動物個體遺傳性狀抗病轉(zhuǎn)基因動物育種制作人類疾病及遺傳病的轉(zhuǎn)基因動物模型腫瘤發(fā)生機理研究及腫瘤預(yù)防和治療方面的應(yīng)用利用轉(zhuǎn)基因動物作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)目的蛋白轉(zhuǎn)基因動物的理論和實踐意義主要包括以下幾個方面：利用外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中的特異表達，研究外源基因在動物體內(nèi)的活動規(guī)律，從而弄清真核細胞的基因調(diào)控方式。目前，利用轉(zhuǎn)基因動物已進行了組織特異性基因、發(fā)育調(diào)控基因的表達及增強子的定位研究。1、基因表達與調(diào)控的研究主要應(yīng)用于畜牧業(yè)，通過基因轉(zhuǎn)移改變動物的基因型，達到改良動物品種的目的。如轉(zhuǎn)基因的瘦肉型豬、產(chǎn)奶量高的牛等。2、改造動物個體遺傳性狀先克隆出某種抗病基因，再將此基因轉(zhuǎn)入宿主動物受精卵中，培育出對某種疾病具有抵抗力的轉(zhuǎn)基因動物。這項技術(shù)對家禽病的防治很有意義。3、抗病轉(zhuǎn)基因動物育種將產(chǎn)生某些疾病或遺傳病的基因作為外源基因轉(zhuǎn)移，構(gòu)建出人類遺傳病的轉(zhuǎn)基因動物模型，用以研究某些疾病或遺傳病的致病機理及治療方法等。目前已經(jīng)構(gòu)建的模型有乙型肝炎和高血壓轉(zhuǎn)基因動物模型，

-地中海貧血病轉(zhuǎn)基因動物模型是一種遺傳病動物模型。4、制作人類疾病及遺傳病的轉(zhuǎn)基因動物模型將可能激發(fā)腫瘤的基因?qū)胄∈笫芫阎?，制作出具有腫瘤傾向的腫瘤轉(zhuǎn)基因動物模型，使人們可以在整體水平上系統(tǒng)地研究不同癌基因在細胞分化、增殖中的作用，同時也為腫瘤藥物的測試和篩選提供了良好的實驗材料。5、腫瘤發(fā)生機理研究及腫瘤預(yù)防和治療方面的應(yīng)用動物生物反應(yīng)器(bioreactor)是指利用轉(zhuǎn)基因活體動物的某種能夠高效表達外源蛋白的器官或組織來進行工業(yè)化生產(chǎn)活性功能蛋白的技術(shù)，這些蛋白一般是藥用蛋白或營養(yǎng)保健蛋白。

6、利用轉(zhuǎn)基因動物作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)目的蛋白

國際上通常把目的基因在血液循環(huán)系統(tǒng)或乳腺中表達的轉(zhuǎn)基因動物稱為“動物生物反應(yīng)器”。其中動物乳腺生物反應(yīng)器是目前國際上惟一證明可以達到商業(yè)化生產(chǎn)水平的生物反應(yīng)器。

1987年，美國科學(xué)家首先從轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中獲得了治療急性心肌梗塞最好的溶血栓藥物t-PA（組織纖維蛋白溶酶原活化因子）。近幾年來，已有數(shù)百種產(chǎn)品在小鼠乳腺獲得高效表達，其中數(shù)種重要醫(yī)用產(chǎn)品已在大動物乳汁中生產(chǎn)出來，即將投放市場，如山羊乳腺表達抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)、t-PA均達到6g/L，綿羊乳腺表達抗胰蛋白酶（AAT）達到35g/L，家兔乳腺表達葡萄糖苷酶達到10g/L，豬乳腺表達蛋白Ｃ達到1g/L、第八因子（F-Ⅷ）達到3g/L，奶牛乳腺表達乳轉(zhuǎn)鐵蛋白達到3.5g/L。

如荷蘭Phraming公司制作的轉(zhuǎn)基因牛能生產(chǎn)人乳鐵蛋白(lactoferrin)和促紅細胞生成素(EPO)，英國愛丁堡PPL公司的轉(zhuǎn)基因羊能生產(chǎn)

l-抗胰蛋白酶等。乳鐵蛋白具有提高免疫機能和防止感染的作用，并具有增加鐵質(zhì)的功效。對紅細胞的生成有增強作用的體液性因子；增強肌肉抵抗力；有保護神經(jīng)細胞的作用；可用來治療視網(wǎng)膜色素變性等采用“乳腺生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥用蛋白是一種全新的生產(chǎn)模式，目前世界各國達到商業(yè)開發(fā)水平的乳腺分泌的藥用蛋白已超過十種，這一技術(shù)正成為生物工程領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。

組織工程TissueEngineering

組織、器官的損傷及功能障礙是危害人類健康的主要因素之一。

僅是美國一年用在組織器官損壞的醫(yī)療費用支出，就高達4000億美元。至于與細胞相關(guān)的技術(shù)，全球一年的產(chǎn)值約在八百億美元左右。目前臨床常用的治療組織器官缺損的方法有三種：

自體組織移植

異體、異種組織移植

生物材料組織代用品自體組織移植：在修復(fù)病損組織的同時也對正常部位造成了新的創(chuàng)傷，而且當病損組織范圍過大時(如身體大面積燒傷)，往往缺乏足夠的供區(qū)組織進行修復(fù)。

異體、異種組織移植：異體、異種移植面臨的最主要問題是免疫排斥反應(yīng)，病人需要終身服用免疫抑制藥物，生存質(zhì)量得不到保證。異種移植存在的另一個問題是，未知的動物病源可能通過器官移植傳染給人類，從而對人類的生存安全造成重大威脅。

生物材料組織代用品：應(yīng)用天然或合成的生物材料植入體內(nèi)以恢復(fù)組織的連續(xù)性，替代缺損組織的部分功能。只能部分地恢復(fù)缺損組織結(jié)構(gòu)與功能，而且材料植入人體后常常因疲勞而發(fā)生老化等現(xiàn)象，時間過長還需要更換。組織工程是指運用工程科學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，從根本上認識正常和病理的哺乳動物的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，并研究生物學(xué)替代物以恢復(fù)、維持和改進組織功能。

1987年，美國國家科學(xué)基金會（NSF）首次提出了組織工程的概念，并明確了組織工程的定義。組織工程學(xué)是根據(jù)細胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，將正常的、具有特定生物學(xué)活性的人體組織細胞與生物材料相結(jié)合，在體外或體內(nèi)再造組織和器官，以修復(fù)或替代人體損傷組織和器官功能的一門科學(xué)。2000年美國時代雜志(Times)就將“組織工程(TissueEngineering)”列為21世紀未來十大熱門行業(yè)的榜首。

通過組織工程構(gòu)建的組織，不僅能對病損組織進行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達到永久性替代的目的，而且還可以隨著身體生長的變化而一同變化。

組織工程目前研究的領(lǐng)域涉及機體的四大基本組織。主要集中在人工軟骨、骨、肌腱、皮膚和肝臟。第一節(jié)組織工程的主要研究內(nèi)容正常組織細胞細胞－生物材料復(fù)合物組織、器官替代物體外培養(yǎng)擴增生物材料植入體內(nèi)受損部位生物材料被降解吸收組織工程的基本原理主要方法是：將體外培養(yǎng)擴增的正常組織細胞吸附于一種生物相容性良好并可被機體吸收的生物材料上，然后將細胞一生物材料復(fù)合物植入體內(nèi)的受損部位，細胞在生物材料逐漸被肌體降解吸收的過程中，形成在形態(tài)和功能上與受損組織和器